CN107519032A - 一种护肤品的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗衰老护肤品的其制备方法，具体的，涉及一种含有小分子遗传物质的抗衰老护肤品的制备方法，特别地，还涉及一种利用植物为发生器生产抗衰老小分子遗传物质的方法，本发明提供的制备方法纯度高、精细化、生产材料纯天然、工业污染少、成本低、生产效率高，适用于美容产品产业化制造。

Description

一种护肤品的制备方法
技术领域
本发明涉及一种护肤品的其制备方法，特别地涉及一种利用植物为发生器制造生物活性物质作为抗衰老因子添加入护肤品的方法。
背景技术
表皮由多层上皮细胞组成，对环境和刺激起到保护屏障作用。表皮既是在基底层内部发生的细胞增生的场所，还是在中间层细胞分化的场所，最终形成一种完全分化的保护结构，即角质层。表皮主要由角质形成细胞组成，这些细胞在表皮的最深层增生，然后开始分化，并从表皮的深层迁移到表面，完成该循环大概需要20天。该过程对应于多种特定基因按照一定的顺序和协调的方式接连地被激活、随后被抑制的表达。
随着生物学，特别是分子生物学技术的发展，给美容化妆品行业带来了全新的发展机遇，护肤品已经从精细化工美容、植物美容向生物美容、基因美容发展。生物护肤品的主要成分生物活性多肽大部分是细胞生长因子，它们在体内含量极微，但生物活性极高，对多种细胞生理功能和代谢活动发挥生物调节作用，直接、间接地影响多种类型细胞的生长、分裂、分化、增殖和迁移，在美容护肤、整形外科、烧伤溃疡以及各种皮肤病的伤口修复与愈合中有重要作用。
生物活性物质微RNA(miRNA，miRNA)是一类在转录后水平上通过与靶基因mRNA的3'-非翻译区(untranslated regions，UTR)结合后调控基因表达的小分子非编码RNA。在细胞衰老中都发现有miRNA的异常表达，并且这些miRNA在细胞衰老的发生过程中扮演着重要的角色。
本发明采用微阵列芯片技术筛选表皮细胞衰老过程中的差异miRNA并进行功能分析，首次发现并提供了与表皮细胞衰老相关的miRNA，并提供了所述含有抗衰老生物活性物质的护肤品的制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种护肤品组合物及其制备方法。
为实现上述目的，一种制备护肤品的方法，包括向护肤品中添加生物活性物质。
进一步地，所述生物活性物质为miRNA。
更进一步地，所述制备护肤品的方法具体步骤如下：
步骤1、构建在植物中稳定表达miRNA的载体，构建miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355表达的骨架载体，针对miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355序列设计引物，利用重叠PCR扩增方法获得miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355的前体序列，最后将miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355的前体序列克隆到植物表达载体中表达；
步骤2、鉴定出阳性质粒并转化农杆菌，栽培无菌苗，利用农杆菌侵染法获得植物愈伤，在诱芽培养基以及幼苗诱根培养基上培养植物愈伤至转化植株，检测确定转化植株中获得的miRNA为miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355，获得了含有与表皮细胞抗衰老相关的miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355的植物，大面积种植含有与表皮细胞抗衰老相关的miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355的植物，获得与抗衰老护肤品相关的生物活性物质miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355；
步骤3、制备护肤品基质，包括油相A与水相B，将油相部分加热至82摄氏度，水相部分加热至96摄氏度，高压灭菌，冷却到82摄氏度，将油相加入至水相中并同时搅拌至乳化生成护肤品基质；
步骤4、制备抗衰老护肤品，成分比例如下：原料及配比为护肤品基质1份，miRNA-134为0.1份，miRNA-1207为0.1份，miRNA-720为0.1份，乳化基质冷却至33摄氏度以下加入miRNA共0.3份，搅拌至混匀，获得护肤品混合物。
优选地，所述植物包括但不限于：禾本科、蕨科、菊科、唇形科、百合科、石蒜科、伞形科、十字花科、豆科、葫芦科或其组合。
进一步地，所述植物为十字花科植物。
更进一步地，所述植物为拟南芥。
优选地，所述诱芽培养基为以MS培养基为基本培养基并附加0.5mg/L6-苄基腺嘌呤和0.1mg/Lα-萘乙酸的培养基。
本发明所述“miRNA”或“miRNA”指小分子核糖核酸(miRNA，缩写为miRNA)又译微核糖核酸，是真核生物中广泛存在的一种长约21到23个核苷酸的核糖核酸(RNA)分子，可调节其他基因的表达。miRNA来自一些从DNA转录而来，但无法进一步转译成蛋白质的RNA(属于非编码RNA)。miRNA通过与目标信使核糖核酸(mRNA)结合，进而抑制转录后的基因表达,在调控基因表达、细胞周期、生物体发育时序等方面起重要作用。在动物中，一个微RNA通常可以调控数十个基因。
本发明所述“转录”是指是遗传信息由DNA转换到RNA的过程。作为蛋白质生物合成的第一步，转录是mRNA以及非编码RNA(tRNA、rRNA等)的合成步骤。转录中，一段基因会被读取、复制为mRNA；就是说以特定的DNA片段作为模板，以DNA依赖的核糖核酸聚合酶(RNA聚合酶或RNA合成酶)作为催化剂而合成前体mRNA的过程。mRNA转录时，DNA分子双链打开，在RNA聚合酶的作用下，游离的4种核糖核苷酸按照碱基互补配对原则结合到DNA单链上，并在RNA聚合酶的作用下形成单链mRNA分子。至此，转录完成。转录通常是多起点多向复制，转录时所转录的仅为DNA上有遗传效应的片段(DNA)，不包括内含子。
本发明术语“基因芯片”(genechip)(又称DNA芯片、生物芯片)是指利用杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列，据此可重组出靶核酸的序列的技术。
本发明术语“生物活性物质”是指来自生物体内的对生命现象具体做法有影响的微量或少量物质。如：有些食物含有多种具有生物活性的化合物，当与机体作用后能引起各种生物效应，称为生物活性物质。它们种类繁多，有糖类、脂类、基因、蛋白质多肽类、甾醇类、生物碱、甙类、挥发油等等。
本发明的有益效果是纯度高、精细化、生产材料纯天然、工业污染少、成本低、生产效率高，适用于美容产品产业化制造。
附图说明
图1微阵列芯片筛选衰老相关miRNA；
图2miR-3667-5p、miR-381或miRNA-355表达骨架载体。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1：
收集200名志愿者(年龄分布于18-50岁)的表皮细胞，所有样本的收集均征得志愿者或其家属同意，并签署知情同意书。提取miRNA具体步骤如下：将样品分别加入750μl TRIREAGENT BD(Molecular Research Center公司)和20μl 5N醋酸，混匀后加入5μl浓度为50pmol/L的Cel-miR-39，震荡混匀，室温下静置5分钟，加入200μl氯仿，震荡混匀，室温下静置5分钟，4℃，12000g离心15min，提取上清液，加入4μl DNA mate(TAKARA公司)，后加入与上清液等体积的异丙醇混匀，-20℃静置20min，4℃，12000g离心15min，去上清，向沉淀中加入1ml 75％乙醇清洗沉淀，4℃，7500g离心洗涤沉淀5min。去上清，将沉淀室温晾干后加入40μl RNase-free的水充分溶解，测定所得RNA的浓度。
采用微阵列芯片技术进行miRNA筛选，芯片采用Agilent human miRNAsmicroarray(Agilent公司提供)，操作过程严格按说明书进行，采用SlideWasherTM 8芯片洗干仪对芯片进行清洗甩干， LuxScanTM 10K/A双通道激光扫描仪对芯片进行扫描，Lux Scan 3.0图像分析软件对数据进行提取，SAM软件进行差异基因的挑选。筛选条件为假发现率(false discovery rate，FDR)控制在5％以内，差异倍数(foldchange，FC)为1.5。筛选出与人表皮细胞衰老相关的下述microRNA:miR-127-3p,miR-3198,miR-146b-5p,miR-1973,miR-424,miR-487b,miR-1274a,miR-1274b,miR-377,miR-3651,miR-181b,miR-4291,miR-154,miR-181a,miR-455-3p,miR-381,miR-1260b,miR-1260,miR-29a,miR-29c,miR-34b,miR-548,miR-1207-5p,miR-1280,miR-4286,miR-720,miR-1183,miR-3917,miR-505,miR-3667-5p,miR-3937,miR-557,miR-3127,miR-3610,miR-601,miR-29c,miR-3907,miR-3188,miR-1273,miR-3194,miR-623,miR-29b,miR-34a,miR-1226,miR-572,miR-134。
实施例2：
基因芯片检测结果如图1所示，根据基因芯片检测结果，从中选取在衰老细胞中显著下调表达的miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355进行实时定量RT-PCR检测，具体步骤为：使用AppliedBiosystems公司的Taqman miRNA反转录试剂盒对提取的RNA进行反转录反应。
反应体系如下(20μl)：
使用Applied Biosystems公司热循环仪进行16℃30分钟，42℃30分钟，85℃5分钟的反转录。对反转录产物进行适当稀释后，取5μl作为实时定量PCR的模板，使用AppliedBiosystems公司的TaqMan Universal PCR Master Mix试剂盒进行实时定量PCR鉴定。PCR反应在Applied Biosystems 7900HT序列检测系统(P/N：4329002，Applied Biosystems)中进行。PCR反应体系为20μl，包括4μl RT产物，11μl 10×Universal PCR MasterMix(P/N：4324018，Applied Biosystems)，1μl探针(0.2mM)，4μl RNase-free水。将所有的反应体系首先进行95℃10分钟的预热，然后进行每循环95℃15秒，60℃1分钟，共50循环的PCR反应。所有的反应重复三次，每次取固定的阈值，三次测定中最少的Ct值作为该样本Ct值。引物序列见表1。
表1 miRNA引物序列
根据上述实验，发现miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355为衰老相关miRNA，通过表皮细胞导入miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355或其类似物，可以达到延缓皮肤衰老的目的。
实施例3：
miRNA类似物的制备方法，具体操作步骤如下：
3.1构建miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355表达的骨架载体(如图2所示)；针对miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355序列设计引物，利用重叠PCR扩增方法获得miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355的前体序列；最后将miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355的前体序列克隆到植物表达载体；鉴定出阳性质粒并转化进农杆菌株，用于植株侵染；
3.2 MiRNA转化拟南芥，包括步骤：拟南芥无菌苗培养、农杆菌侵染、拟南芥愈伤组织在诱芽培养基以及幼苗诱根培养基培养；
3.3 MiRNA在拟南芥转化植株中的检测确定，包括RNA及cDNA的准备，miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355表达的检测，以及数据的处理；
3.4将所述转化有表皮细胞抗衰老相关的miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355的拟南芥大面积种植，即可获得用于抗衰老护肤品的miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355。
miRNA提取方法为本领域技术人员所公知的。
实施例4：
4.1制备护肤品基质。
油相A：单硬脂酸甘油酯68-83％、氢化羊毛脂10-30％、橄榄油5-10％、硬脂酸2％；
水相B：甘油4％，透明质酸0.2％，超轻水补充至100％；
将油相部分加热至82℃，水相部分加热至96℃，高压灭菌，冷却到82℃，将油相加入水相并同时搅拌至乳化获得护肤品基质。
4.2制备护肤品。
以下成分按重量百分比记，原料及配比为：
乳化基质冷却至33℃以下加入miRNA，搅拌至混匀，获得护肤品混合物。
由上述步骤制得的护肤品经检验分析合格后即可包装。
实施例5：
试制的产品分别提供给老年(60岁左右)、中年(40岁左右)、壮年组(30岁左右)，青年(20岁左右)，共四组(每组50人)，试用6个月。每天早晚各一次，一次涂抹约黄豆粒大小本产品，将产品直接涂抹于暴露的肌肤(脸和手背)，一周后涂抹部位肌肤明显白嫩滋润度增加、通透感增强。其中，青年组中10位受试者原有的出痘症状明显缓和；中年组中15人皮肤细纹显著减淡，皮肤光鲜有弹性；老年组反馈皮肤水润度提高且皮肤掉屑症状减轻，其中19人色斑明显减淡，皱纹和皮肤松弛现象得到不同程度的改善。
最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.一种制备护肤品的方法，其特征在于，包括向护肤品中添加生物活性物质。
2.根据权利要求1所述制备护肤品的方法，其特征在于，所述生物活性物质为miRNA。
3.根据权利要求1或2任一所述制备护肤品的方法，其特征在于，所述制备护肤品的方法具体步骤如下：
步骤1、构建在植物中稳定表达miRNA的载体，构建miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355表达的骨架载体，针对miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355序列设计引物，利用重叠PCR扩增方法获得miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355的前体序列，最后将miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355的前体序列克隆到植物表达载体中表达；
步骤2、鉴定出阳性质粒并转化农杆菌，栽培无菌苗，利用农杆菌侵染法获得植物愈伤，在诱芽培养基以及幼苗诱根培养基上培养植物愈伤至转化植株，检测确定转化植株中获得的miRNA为miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355，获得了含有与表皮细胞抗衰老相关的miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355的植物，大面积种植含有与表皮细胞抗衰老相关的miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355的植物，获得与抗衰老护肤品相关的生物活性物质miR-3667-5p、miR-381和miRNA-355；
步骤3、制备护肤品基质，包括油相A与水相B，将油相部分加热至82摄氏度，水相部分加热至96摄氏度，高压灭菌，冷却到82摄氏度，将油相加入至水相中并同时搅拌至乳化生成护肤品基质；
步骤4、制备抗衰老护肤品，成分比例如下：原料及配比为护肤品基质99％，miR-3667-5p 1％，miR-3811％，miRNA-3551％，乳化基质冷却至33摄氏度以下加入miRNA，搅拌至混匀，获得护肤品混合物。
4.根据权利要求1-3任一所述制备护肤品的方法，其特征在于，所述植物包括但不限于：禾本科、蕨科、菊科、唇形科、百合科、石蒜科、伞形科、十字花科、豆科、葫芦科或其组合。
5.根据权利要求4所述制备护肤品的方法，其特征在于，所述植物为十字花科植物。
6.根据权利要求5所述制备护肤品的方法，其特征在于，所述植物为拟南芥。
7.根据权利要求6所述制备护肤品的方法，其特征在于，所述诱芽培养基为以MS培养基为基本培养基并附加0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤和0.1mg/Lα-萘乙酸的培养基。
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