CN107513512B - 一种降解黄曲霉毒素b1的荚膜红细菌菌株及其应用和降解剂及其应用 - Google Patents

一种降解黄曲霉毒素b1的荚膜红细菌菌株及其应用和降解剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种降解黄曲霉B1的荚膜红细菌菌株及其应用和一种防霉剂及其应用，属于黄曲霉毒素降解技术领域。本发明提供的降解黄曲霉B1的荚膜红细菌菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14603。所述的降解黄曲霉B1的荚膜红细菌菌株在降解黄曲霉B1中的应用。一种用于动物饲料的黄曲霉B1降解剂，包括所述的荚膜红细菌菌株。所述黄曲霉B1降解剂在制备动物饲料中的应用。所述降解剂不仅具有高效黄曲霉B1的特性，而且使动物饲料在粗蛋白、真蛋白和粗脂肪等营养成分方面有显著增加，大大提高了饲喂价值。

Description

一种降解黄曲霉毒素B1的荚膜红细菌菌株及其应用和降解剂 及其应用
技术领域
本发明属于黄曲霉毒素降解技术领域，具体涉及一种降解黄曲霉B1的荚膜红细菌菌株及其应用和一种降解剂及其应用。
背景技术
黄曲霉毒素B1是已知的化学物质中致癌性最强的一种。黄曲霉毒素B1对包括人和若干动物具有强烈的毒性，其毒性作用主要是对肝脏的损害。在自然界中以黄曲霉毒素B1最为多见，危害性也最强，国家质检总局规定黄曲霉毒素B1是大部分食品的必检项目之一。
除了对黄曲霉毒素B1检测预防外，对已经产生的黄曲霉毒素B1进一步降解是防止人畜摄入和代谢的重要环节。黄曲霉毒素B1对光、热、酸较稳定，只有加热到280～300℃才裂解，高压灭菌2小时，毒力降低25％～33％，4小时降低50％。可见物理降解，能耗较高，同时效果不显著。
目前，采用生物降解法对黄曲霉毒素B1进行降解一种新的思路。据报道能对黄曲霉毒素B1进行降解的微生物有多种，例如枯草芽孢杆菌、橙红色黏球菌、橙色黄杆菌、分歧杆菌、乳酪杆菌、产朊假丝酵母、红串红球菌、根霉菌、茎点霉菌、黑曲霉、红城红球菌、土壤单胞菌、腐皮镰孢或枝顶孢属菌株，同时还有将几种微生物复配形成的复合菌用于降解，例如将假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液以及芽孢杆菌菌液复合形成的复合菌剂对黄曲霉毒素B1的降解效率达到96.2％，其中假单胞菌菌液对黄曲霉毒素B1的降解效率仅为66.5％。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种降解黄曲霉B1的荚膜红细菌菌株及其应用和一种降解剂及其应用，提高对黄曲霉B1的降解效率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种降解黄曲霉B1的荚膜红细菌菌株ZCU1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14603。
本发明提供了所述降解黄曲霉B1的荚膜红细菌菌株ZCU1在降解黄曲霉B1中的应用。
本发明提供了一种用于动物饲料的黄曲霉B1降解剂，包括所述的荚膜红细菌菌株ZCU1和辅料。
优选的，黄曲霉B1降解剂为液体时，每毫升的黄曲霉B1降解剂中含有所述荚膜红细菌菌株为108～109CFU。
优选的，所述黄曲霉B1降解剂的剂型为水剂。
优选的，所述黄曲霉B1降解剂的剂型为水剂时，所述辅料为液态培养基；所述液体培养基包括体积百分含量为40％～60％的活化培养基、体积百分含量为40％～60％的酸解秸秆物和质量百分浓度的0.00003％～0.00005％的黄曲霉B1。
本发明还提供了所述黄曲霉B1降解剂在制备动物饲料中的应用。
优选的，包括以下步骤：
1)将霉变的植物秸秆预处理后调节pH值至中性后与所述黄曲霉B1降解剂进行混合，得到发酵料；
2)将所述步骤1)中的发酵料进行发酵，得到动物饲料。
优选的，每克植物秸秆中所述黄曲霉B1降解剂的数量为107～108CFU。
优选的，所述发酵的温度为35-36℃，发酵的时间为5～8d；所述发酵期间伴随光照和搅拌，所述光照的强度为500～1500lux；所述搅拌的速度为30～80r/min。
本发明提供了一种降解黄曲霉B1的荚膜红细菌菌株ZCU1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14603。所述荚膜红细菌菌株ZCU1是经过化学试剂1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG)结合紫外线诱变得到的突变株，同时在预处理的秸秆物和黄曲霉B1的驯化作用下能够利用黄曲霉B1，从而达到降解黄曲霉B1的效果。本发明提供的荚膜红细菌菌株ZCU1具有了高效降AFB1能力，但未影响其利用其它碳源与氮源的能力，因此能大量繁殖并同时提高了原料蛋白质含量。
本发明提供了所述的降解黄曲霉B1的荚膜红细菌菌株在降解黄曲霉B1中的应用。本发明提供的荚膜红细菌菌株ZCU1在黄曲霉B1降解后，降解率能够达到70％～80％，较出发菌株的降解率(3％～4％)提高了66％～77％。
本发明提供了一种用于动物饲料的黄曲霉B1降解剂，包括所述的荚膜红细菌菌株ZCU1，为含黄曲霉毒素的原料制作成高价值制品提供新办法，同时本发明拓宽了所述荚膜红细菌菌株对物质源的利用。
本发明还提供了所述黄曲霉B1降解剂在制备动物饲料中的应用，将降解AFB1与提升原料饲用价值融为一个环节，具有缩短制作周期，简化了工艺过程的作用。同时本发明提供的应用不仅消除了饲料原料中黄曲霉B1的毒力，而且还能有效增加饲料原料的营养成分，较出发菌株相比，采用所述黄曲霉B1降解剂制备的动物饲料中醋蛋白提高了100％～132％，真蛋白提高了149％～160％，粗脂肪提高了86％～102％，极大地提高了饲用价值。
菌种保藏证明
荚膜红细菌，Rhodobacter capsulatus，菌株编号：ZCU1，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2017年9月11日，保藏编号为CGMCC No.14603。
具体实施方式
本发明提供了一种降解黄曲霉B1的荚膜红细菌菌株ZCU1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14603。
本发明提供了所述的降解黄曲霉B1的荚膜红细菌菌株ZCU1在降解黄曲霉B1中的应用。
本发明中，所述降解黄曲霉B1的环境的pH值优选为6.5～7.8，更优选为7.2。
本发明中，当所述荚膜红细菌菌株的菌体浓度为107～108CFU/mL时，所述黄曲霉B1的质量浓度优选为140～170mg/mg，更优选为150mg/mg。所述荚膜红细菌菌株的菌体浓度优选为107～108CFU/mL，更优选为5×107CFU/mL。
本发明提供了一种用于动物饲料的黄曲霉B1降解剂，包括所述的荚膜红细菌菌株ZCU1和辅料。
本发明中，当黄曲霉B1降解剂为水剂时，每毫升的黄曲霉B1降解剂中含有所述荚膜红细菌菌株ZCU1优选为108～109CFU，更优选为5×108CFU。
本发明中，所述黄曲霉B1降解剂的剂型优选为水剂。
本发明中，所述黄曲霉B1降解剂的剂型为水剂时，所述辅料优选为液态培养基；所述液体培养基优选为体积百分含量为40％～60％的活化培养基、体积百分含量为40％～60％的酸解秸秆物和质量百分浓度的0.00003％～0.00005％的黄曲霉B1。
本发明中，所述活化培养基每1000mL水中优选包括以下含量的组分：0.2gMgSO4·7H2O、1g NH4Cl、1gNa2CO3、0.3g K2HPO4、0.5g NaCl、3g CH3CH2OH、蛋白胨1.5g、酵母膏1g、琼脂20g；所述活化培养基的pH值为7.2。
在本发明中，所述酸解秸秆物的制备方法优选包括以下步骤：将粉碎后的已霉变的植物秸秆的质量与酸化用溶液的体积比为100mg:130ml混合酸化，酸化后的混合物进行高温高压处理，再将高温高压处理的混合物降温至36℃，用1％的氨水进行中和至中性，得酸解秸秆混合物。
本发明还提供了所述黄曲霉B1降解剂在制备动物饲料中的应用。
本发明中，所述黄曲霉B1降解剂在制备动物饲料中的应用优选包括以下步骤：
1)将霉变的植物秸秆预处理后调节pH值至中性后与所述黄曲霉B1降解剂进行混合，得到发酵料；
2)将所述步骤1)中的发酵料进行发酵，得到动物饲料。
本发明将霉变的植物秸秆预处理后调节pH值至中性后与所述黄曲霉B1降解剂进行混合，得到发酵料。
本发明中，所述预处理优选包括：将霉变的植物秸秆依次粉碎、酸化和高温高压处理。
本发明中，所述植物秸秆包括稻米秸秆、小麦秸秆或玉米秸秆。所述霉变的植物秸秆中，黄曲霉B1的质量浓度优选为140～170mg/mg，更优选为150mg/mg。所述粉碎前，优选对所述霉变的植物秸秆进行干燥。所述干燥的温度优选为80～90℃，更优选为85℃。本发明对所述干燥的方式没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的干燥方案即可。
本发明对所述粉碎的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的粉碎方法即可。所述粉碎的植物秸秆的粒径优选为30～50目，更优选为40目。
本发明中，所述酸化用溶液为硫酸水溶液。所述硫酸水溶液的体积浓度优选为1％～2％，更优选为1.5％。所述酸化能够使植物秸秆中大分子物质纤维素、半纤维素、木质素等降解，从而进一步被菌种利用转化。所述酸化过程中所述粉碎的植物秸秆的质量与酸化用溶液的体积比优选为100mg：100～150mL，更优选为100mg：120～140mL，最优选为100mg：130mL。
得到的酸化的植物秸秆，本发明将所述酸化的植物秸秆在温度120～150℃，压力为0.5～1.1MPa的环境中高温高压处理1.5～2.5h，得到高温高压处理的植物秸秆。
本发明中，所述高温高压处理的温度优选为130～140℃，更优选为135℃。所述高温高压处理的压力优选为0.7～0.9MPa，更优选为0.8MPa。所述高温高压处理的时间优选为2.0h。所述高温高压处理能够使植物秸秆中的纤维素、木质素与半纤维素等大分子物质降解成小分子物质。
得到高温高压处理的植物秸秆后，本发明将所述植物秸秆调节pH值至中性后与所述黄曲霉B1降解剂进行混合，得到发酵料。
本发明中，发酵期间，所述发酵醪的pH值下降至6.2时调节pH值至7.8。调节pH值用溶液为氨水，所述氨水的质量浓度浓度优选为1％～3％，更优选为2％。
本发明中，每克植物秸秆中所述荚膜红细菌菌株的数量优选为107～108CFU，更优选为5×107CFU。本发明对所述混合的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的混合方案即可。
本发明中，所述发酵的环境优选在玻璃发酵罐中进行。所述发酵的温度优选为35～36℃，更优选为35.5℃；所述发酵的时间优选为为5～8d，更优选为6～7d；所述发酵期间优选伴随光照和搅拌，所述光照的强度优选为500～1500lux，更优选为800～1200lux，最优选为1000lux；所述搅拌的速度优选为30～80r/min，更优选为50r/min。在发酵期间，所述荚膜红细菌菌株能够将黄曲霉B1降解，形成无毒害作用的小分子，使制备的动物饲料中减少毒素的含量，提高了饲料的品质。
本发明中，所述发酵醪优选经烘干，得到动物饲料。所述烘干的温度为80～90℃，更优选为85℃。所述发酵醪的烘干的程度为发酵醪中含水率为8％～12.0％，更优选为10％。
下面结合实施例对本发明提供的一种降解黄曲霉B1的荚膜红细菌菌株及其应用和防霉剂及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
荚膜红细菌活化、化学-紫外诱变、发酵转化霉变秸秆酸解物降黄曲霉毒素B1制取饲料包括以下步骤：
(1)两次化学诱变。购买的荚膜红细菌(荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC，No.1.3366)接入液态活化培养基于28℃进行活化，并再转接2次使菌种稳定，培养条件：27℃，接种量9％，培养时间5d，每天摇匀2次静止培养。将0.1mL前一次转接培养2天的荚膜红细菌液(菌数4.4×105CFU/mL)涂布于固态培养基(I)上并上覆一层3mm溶液层(I)，1h后吸去上层溶液，并用去离子水反复轻倒入与吸取4次，后上盖一层液体石蜡在白织灯下光照强度1000lux与温度27℃下培养7天。待长出菌落挑取2环于液态培养基(I)150mL并按光照强度1000lux与温度27℃下6天转接培养2次，取1mL培养液用去离子水稀释至菌数3.2×105个/mL，再取0.1mL涂布于固态培养基(II)上并上覆一层3mm溶液层(II)，1.2h后吸去上层溶液，并用去离子水反复轻倒入与吸取4次后上覆一层液体石蜡，在光照1200lux与温度28℃下再培养6天。
活化培养基：0.2g MgSO4·7H2O、1gNH4Cl、1g Na2CO3、0.3g K2HPO4、0.5gNaCl、3gCH3CH2OH、蛋白胨1.5g、酵母膏1g、琼脂20g，H2O定容至1000ml，pH 7.2。
固态培养基(I)：活化培养基+2％琼脂+0.00001％AFB1；
溶液层(I)：0.01％1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG)+0.1mol/L的磷酸缓冲液；
液态培养基(I)：活化培养基+0.00002％AFB1；
固态培养基(II)：活化培养基+2％琼脂+0.00003％AFB1；
溶液层(II)：0.015％1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG)+0.1mol/L的磷酸缓冲液。
(2)紫外诱变与驯化。待上述平板培养基上长出菌落，挑取长势良好菌落2环入150mL液态培养基(II)中，并于光照1200lux与温度28℃下培养6天，以此培养条件按10％接种量转接3次使菌种稳定。取菌种培养液1ml(菌数5.8×105CFU/mL)于装有10mL液态培养基(III)试管中，在20W紫外灯下20cm处照射65s，取0.1ml菌种液涂布在于固态培养基(III)上并上覆一层液体石蜡，于1300lux与温度28℃下培养6天。挑取长势良好菌落2环入液态培养基(IV)中，于1200lux与温度28℃下培养5天，并按此培养条件转接4次，每次转接提升15％酸解秸秆物相应降低15％的活化培养基，且每次转接降低0.00001％AFB1与提高温度1.5℃，直至最后一次转接培养基由100％酸解秸秆物组成，5d后菌数经平板计数法计算菌落数达2.3×108CFU/mL作为发酵剂。
液态培养基(II)：80％活化培养基+20％酸解秸秆物+0.00003％AFB1；
液态培养基(III)：70％活化培养基+30％酸解秸秆物+0.00003％AFB1；
固态培养基(III)：60％活化培养基+40％酸解秸秆液+2％琼脂+0.00003％AFB1；
液态培养基(IV)：50％活化培养基+50％酸解秸秆物+2％琼脂+0.00004％AFB1；
酸解秸秆物：将已霉变的玉米秸秆于85℃恒温箱中至恒重，冷却后粉碎至40目过筛。将100份粉碎秸秆(含水率9.7％)与130份的1％浓度硫酸溶液混合均匀，放置于密闭不锈钢容器中加热至145℃保温2h，再将混合物降温至36℃加入1％的氨水进行中和至中性(pH＝7)得酸解秸秆混合物。
诱变得到的荚膜红细菌菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14603。
实施例2
将已霉变的玉米秸秆于85℃恒温箱中至恒重，冷却后粉碎至40目过筛。将100kg粉碎秸秆(含水率10.0％)与100ml的1％浓度硫酸溶液混合均匀，加热至135℃保温保压2.5h，密闭不锈钢容器中压力为0.8MPa，再将混合物降温至35℃加入2％的氨水进行中和至中性(pH＝7)得酸解秸秆混合物。
取100份酸解秸秆物与9份实施例1扩大培养的菌株混合均匀于2L玻璃发酵罐中，使每克酸解秸秆物中包含的菌落数为3.1×106CFU发酵剂混合均匀于2L玻璃发酵罐中，于光照800lux、温度36℃、搅拌转速40r/min条件下发酵，发酵醪pH下降至6.2时补充0.3％浓度的氨水溶液调至pH至7.8，发酵7天结束。将发酵醪85℃干燥恒重(含水率9.9％)得发酵固态饲料。
(4)指标检测。将霉变玉米秸秆、发酵前后物质分别在85℃干燥恒重，它们的干物质主要成分对比见表2。
对比例1
将实施例1中编号为1.3366的菌种进行活化、驯化，具体按照实施例1中步骤1)和步骤2)进行，但不进行添加诱变剂(1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍)与紫外光照射处理；待发酵剂菌种数目为2.7×108CFU/mL；按实施例2的处理过程发酵与检测。发酵后干物质主要成分列于表2。
表2诱变后的菌株与出发菌株在制备动物饲料的干物质含量变化一览表
实施例3
将已霉变的玉米秸秆于90℃恒温箱中至恒重，冷却后粉碎至50目过筛。将100份粉碎秸秆(含水率10.0％)与100份的1％浓度硫酸溶液混合均匀，放置于密闭不锈钢容器中加热至120℃保温3h，再将混合物降温至35℃加入2％的氨水进行中和至中性(pH＝7)得酸解秸秆混合物。
取100份酸解秸秆物与10份实施例1扩大培养的菌株混合均匀于2L玻璃发酵罐中，使每克酸解秸秆物中包含的菌落数为4.3×107CFU。在光照1200lux、温度35℃、搅拌转速70r/min的条件下发酵，发酵醪pH下降至6.2时补充0.3％浓度的氨水溶液调至pH至7.8，发酵8天结束。将发酵醪85℃干燥恒重(含水率10.0％)得发酵固态饲料。
指标检测。将霉变玉米秸秆、发酵前后物质分别在85℃干燥恒重，它们的干物质主要成分对比见表3。
对比例2
将实施例1中编号为1.3366的菌种进行活化、驯化处理，按照实施例1中步骤(1)和步骤(2)进行，但不进行添加诱变剂(1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍)与紫外光照射处理；(2)中发酵剂菌种个数为7.1×108CFU/mL；按照实施例4过程发酵与检测。发酵后干物质主要成分列于表3。
表3诱变后的菌株与出发菌株在制备动物饲料的干物质含量变化一览表
由上述实施例可知，经过诱变后菌株参与发酵后，不仅能够有效降解AFB1，由原来AFB1浓度为149～166μg/kg降低到27～32μg/kg，降解率达到70％～80％，于此同时，发酵得到的动物饲料在粗蛋白、真蛋白和粗脂肪等营养成分方面有显著增加(较出发菌株相比，粗蛋白提高了100％～132％，真蛋白提高了149％～160％，粗脂肪提高了86％～102％)，同时降低了粗纤维的量，不仅提高了饲用价值还保证动物饲料的安全性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种降解黄曲霉毒素B1的荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)菌株ZCU1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14603。
2.权利要求1所述的降解黄曲霉毒素B1的荚膜红细菌菌株ZCU1在降解黄曲霉毒素B1中的应用。
3.一种用于动物饲料的黄曲霉毒素B1降解剂，其特征在于，包括权利要求1所述的荚膜红细菌菌株ZCU1和辅料。
4.根据权利要求3所述的黄曲霉毒素B1降解剂，其特征在于，每毫升的黄曲霉毒素B1降解剂中含有所述荚膜红细菌菌株ZCU1为108～109CFU。
5.权利要求3或4所述黄曲霉毒素B1降解剂在制备动物饲料中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)将霉变的植物秸秆预处理后调节pH值至中性，将所述pH值中性的植物秸秆与所述黄曲霉毒素B1降解剂进行混合，得到发酵料；
2)将所述步骤1)中的发酵料进行发酵，得到动物饲料。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，每克植物秸秆中所述荚膜红细菌菌株的数量为107～108CFU。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为35～36℃，发酵的时间为5～8d；所述发酵期间伴随光照和搅拌，所述光照的强度为500～1500lux；所述搅拌的速度为30～80r/min。
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