CN107475384A - 一种锰/镉吸收高效生态型美洲商陆的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物修复技术，具体为一种锰/镉吸收高效分子生态型美洲商陆的筛选方法，包括如下步骤：野外采集我国多个污染地区和非污染地区美洲商陆种群的叶片、种子和附近的土壤；检测多个地区美洲商陆种群附近土壤的锰/镉含量，分别选取高锰污染、高镉污染、非污染地区的美洲商陆种群；对选取的美洲商陆种群叶片进行AFLP分子标记检测，分析其遗传结构；选取发生不同遗传分化的美洲商陆种群室内繁殖幼苗，将幼苗进行锰、镉和正常Hoagland溶液培养50天，以美洲商陆株高、鲜重及叶片锰/镉含量为指标筛选出锰/镉吸收高效生态型美洲商陆。本发明将锰/镉吸收高效生态型超积累植物用于治理锰/镉污染土壤，提高植物对重金属的积累量和修复效率。

Description

一种锰/镉吸收高效生态型美洲商陆的筛选方法
技术领域
本发明涉及植物修复技术，涉及一种重金属超积累植物的筛选方法，具体为一种锰/镉吸收高效分子生态型美洲商陆的筛选方法。
背景技术
随着社会发展，人类对重金属的开采、冶炼、加工及商业制造增多，重金属对土壤的污染日益严重，极大危害人类的健康。《国家土壤污染调查报告》显示，我国19.4％的耕地土壤点位超标，重金属是耕地土壤的主要污染物。
锰和镉是常见的重金属。锰是植物生长必需的微量元素，但是过量锰则能够引起植物叶片萎蔫坏死、叶片厚度减小、节间缩短和生物量降低。镉是我国土壤重金属点位超标率最高的一种重金属，镉在土壤中迁移性强，极易被植物吸收，进而造成植物生长受抑制甚至死亡。此外，镉的毒性非常强，主要损害人体的肾脏，同时会造成骨质疏松、萎缩、变形等病症。
目前，治理土壤重金属污染的方法主要是通过物理修复、化学修复、生物修复和联合修复等方法降低土壤重金属浓度。与传统方法相比，植物修复技术集治理与生态于一体，以其环境友好、价格低廉等优点而成为研究热点。有一类植物可以大量积累重金属，并且能够在重金属污染环境下良好生长，被称为重金属超积累植物。超积累植物在重金属污染土壤修复中具有很高潜力。然而，超积累植物只占植物界的很小一部分，已报道的各类超积累植物大概500种左右，并且该类植物往往存在生长周期较长、植株矮小、生物量低、扎根浅等缺点，导致其修复效率较低，极大地限制了它们在镇南关金属污染土壤修复方面的实际意义。因此，筛选出理想的超积累植物迫在眉睫。目前，修复植物的筛选在国际尚未制定统一的标准，大大限制了植物修复的产业化进程。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种锰/镉吸收高效生态型超积累植物美洲商陆的筛选方法，筛选出锰/镉吸收高效生态型，将锰/镉吸收高效生态型超积累植物用于治理锰/镉污染土壤，提高植物对重金属的积累量和修复效率。
为了实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：
一种锰/镉吸收高效生态型超积累植物美洲商陆的筛选方法，包括如下步骤：
1)野外采集我国多个污染地区和非污染地区美洲商陆种群的叶片、种子和附近的土壤。
2)检测多个地区美洲商陆种群附近土壤的锰/镉含量，分别选取高锰污染、高镉污染、非污染地区的美洲商陆种群。
3)对选取的美洲商陆种群叶片进行AFLP分子标记检测，分析其遗传结构。
4)根据AFLP遗传分析的结果，选取发生不同遗传分化的美洲商陆种群室内繁殖幼苗，将幼苗进行锰、镉和正常Hoagland溶液培养50天，以美洲商陆株高、鲜重及叶片锰/镉含量为指标择优筛选出锰/镉吸收高效生态型美洲商陆。
按照上述方案步骤2)，土壤锰和镉的测定采用浓酸湿法消煮，使用优级纯的硝酸和高氯酸按照体积4:1配成混酸，常温下冷消煮10h，然后用电热消煮炉逐步升温至160-180℃蒸干。
步骤2)和步骤3)之间还包括如下步骤：对选取的高锰污染、高镉污染、非污染地区的美洲商陆种群，采用内梅罗污染指数进行污染评价。
按照上述方案步骤3)，AFLP流程参照Vos等的AFLP方法并经修改进行。使用EcoRI+MseI 2个限制性核酸内切酶对基因组DNA酶切、接头连接、预扩增、选择性扩增、毛细光荧光电泳。所筛选出的适用于美洲商陆选择性扩增的8对引物为E14×M13、E14×M42、E21×M14、E21×M21、E34×M11、E34×M32、E44×M11、E44×M42。
按照上述方案步骤3)，利用Genemaker进行AFLP条带的统计，并将得到的结果转化成二进制格式，再通过Matlab将每个二进制表整合到一个总二进制表中。利用R语言的AFLPdat软件将二进制表转换成各软件分析所需要的格式并计算Nei’遗传变异程度(h)。利用Popgene 1.32得到基因流(NM)，多态性条带数目(FP)，等位基因数(NA)和Shannon多样性指数(H)等群体遗传多样性指标。利用Arlequin 2.0进行分组分层AMOVA分子变异分析，用来描述分组间以及组内种群间分化。利用Phylip 3.69软件进行Nei遗传距离的NJ(neighbor-joining)树分析。通过Structure 2.3.4，比较不同K值得计算结果来寻找最适的K值，根据等位基因频率，不同个体被分配到不同组中。
按照上述方案步骤4)，合格的种子在浓硫酸中浸泡20min，用水冲洗种子。将美洲商陆种子播种在蛭石基质上发芽，待幼苗长至2片子叶全部打开时，选取长势和大小一致的幼苗，将其移栽到1L的塑料杯中，每个塑料杯种3株美洲商陆。开始时在去离子水中预培养2天，然后使用1/8Hoagland营养液培养，再逐步换为1/4、1/2和完全Hoagland培养液。每2天换一次培养液，并用HCl或NaOH溶液将营养液pH调至5.2。
按照上述方案步骤4)，Hoagland营养液中具体成分为：2.5mM Ca(NO3)2、2.5mMKNO3、l.0mM MgSO4、0.5mM KH2PO4、20μM Fe-EDTA、46μM H3BO3、0.32μM CuSO4、0.71μM ZnSO4、11.1μM MnCl2、0.38μM H2MoO4。
按照上述方案步骤4)，待美洲商陆幼苗长至4叶1心期(不包括子叶)时，开始处理，锰镉的处理浓度分别为10mmol L-1Mn、10μmol L-1Cd处理。Mn和Cd分别以MnCl2母液和CdCl2母液的形式添加到Hoagland营养液中。对照为Hoagland营养液，每2天换一次处理液，处理50d。
按照上述方案步骤4)，处理结束收苗时，先将美洲商陆幼苗用去离子水冲洗，再将根系浸泡在CaCl2溶液中，用去离子水冲洗几次，然后用吸水纸将表面的水分吸除。
按照上述方案步骤4)，叶片金属元素的测定采用浓酸湿法消煮，使用优级纯的硝酸和高氯酸按照体积87:13配成混酸。常温下冷消煮过夜(大约10h)，然后再电热消煮炉逐步升温至160-180℃蒸干。
本发明原理为：超积累植物能够在重金属环境下生长与其种群较高的适合度密切相关，是其长期生活在重金属污染环境下适应性进化的结果。很多物种具有较高的遗传多样性，同一基因往往具有多个等位基因和基因型，构成巨大的遗传变异储备，能够为选择压力下发生的进化反应提供遗传基础(Ward et al.,2008)。土壤重金属污染构成植物选择性进化的动力(Pollard et al.,2014)。由于重金属胁迫的强选择压力，导致某些植物种群之间耐金属胁迫特性的遗传分化，生长在不同矿山或重金属污染土壤的种群之间重金属耐性和积累的能力产生不同，进而分化成不同的生态型(ecotypes)。例如通过RAPD和ISSR标记鉴定发现Dianthus carthusianorum耐Zn–Pb生态型和不耐Zn–Pb生态型的种群在遗传和形态上都具有显著的差异(Wójcik et al.,2013)。因此通过遗传分子标记鉴定结合形态生理检测能够筛选出重金属吸收高效的超积累植物生态型。美洲商陆(PhytolaccaamericanaL.)为商陆科商陆属的植物，多年生草本，是原产北美的入侵植物，繁殖能力强，适应性广，目前在中国的大部分地区具有分布记载。美洲商陆自交亲和，自交结实率高，其繁育系统为兼性自交模式，在拓殖过程中倾向于通过自交繁殖的方式进行扩散。美洲商陆是一种高生物量的超积累植物，对于重金属镉和锰具有超富集性。
相对于现有技术，本发明的有益效果：
(1)具有首创性：从已有的相关文献报道来看，以多个地区广泛存在的锰镉超积累植物美洲商陆为筛选对象，利用分子遗传标记检测和水培锰镉处理试验进行锰/镉高效生态型美洲商陆的筛选研究在国内外均为曾涉及。该方法考虑了进化过程中重金属生境对于不同生态型美洲商陆的遗传分化效应，分别从遗传和生理上确定不同生态型的差异。(2)方法可操作性强：本筛选方法采用了人工可控制的重金属污染条件，参试的不同生态型美洲商陆均处于相对一致的生长环境，不同生态型美洲商陆之间的遗传差异以及对锰/镉的耐性及积累特征具有可比性，方法可操作性强。(3)经济可行：美洲商陆种子广泛存在，方便采集，筛选成本相对较低。
附图说明
图1示出美洲商陆AFLP预扩增结果；
图2示出8对美洲商陆AFLP选择性扩增引物筛选结果；
图3示出美洲商陆AFLP构建NJ(neighbor-joining)树；
图4为美洲商陆AFLP的Structure分析图。
具体实施方式：
为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
一种锰/镉吸收高效生态型美洲商陆的筛选方法
野外美洲商陆种群采集区的重金属污染评价
采集区域概述：2014年8月-11月对全国19个地区进行采样，并对每个地区的重金属污染情况进行调查，采样点分布如下：湖南10个、广西3个、江西3个，浙江1个以及江苏2个。在采样过程中，采集美洲商陆叶片、种子以及相应的周际土壤。(详见表1)。
样品采集方法：在每个采样地区，选取18株较大的美洲商陆(2年生以上)，每个采集成熟叶片约20张左右，放入变色硅胶中密封保存。再采集该株美洲商陆对应的土壤，用铲子在美洲商陆根周围半径20cm范围内选取5个点取样，采样深度为0-20cm，然后将土样混匀，作为一个土壤样品。采集到的美洲商陆以株为单位，不同美洲商陆之间采样距离大于10m。
样品前处理：将采集的土壤样品放置阴处风干，除去石块，植物残渣等杂质，用玛瑙研钵研磨，过20目尼龙筛子，保存于阴凉干燥处。再取已过20目的土壤5g，继续玛瑙研磨，并全部过100目尼龙筛子，用于对土壤重金属含量测定。采集到的美洲商陆种子放在太阳下晒干、去除果皮、清洗美洲商陆种子、晾干，最后保存在4℃冰箱中。
表1美洲商陆野外采样点信息
重金属含量分析：土壤锰(Mn)和镉(Cd)的测定采用浓酸湿法消煮，使用优级纯的硝酸和高氯酸按照体积4:1配成混酸。称取0.2000±0.0050g过100目筛的干燥土壤样品(称取前土壤样品需要在80℃烘箱中连续干燥6h以上)，加入10ml混酸，常温下冷消煮过夜(大约10h)，然后用电热消煮炉逐步升温至160-180℃蒸干，再准确加入10ml 2.5％硝酸(w/v)。涡旋使沉淀溶解，并在65℃水浴60min，然后再涡旋一次，转移到15ml离心管中。土壤消煮样品经静止或离心后，将上清液转移到新的15ml离心管中备用。使用电感耦合等离子体质谱(ICP)分别测定土壤中的锰和镉的含量。评价标准采用国家环保局颁布的《土壤环境质量标准》(GB15618-1995)中的三级标准，Cd为1mg kg-1。该标准中没有给出Mn元素的国家标准值，参考泰国生活环境和农业土壤质量标准(Soil Quality Standards for Habitat andAgriculture)，该标准给出的农用土壤Mn含量限度为1800mg kg-1。各采样点土壤重金属含量见表2，采样点的污染情况与采样点周围生境基本一致。当污染土壤重金属含量越高时，美洲商陆叶片中重金属含量也越高。
表2各种群美洲商陆土壤和叶片中Mn和Cd含量
注：给出的数值为平均值加标准误(Mean+SE)
污染评价：内梅罗指数反映了重金属污染对土壤的作用，同时突出了高浓度污染物对土壤环境质量的影响，因此采用内梅罗污染指数进行污染评价。计算公式如下：内梅罗污染指数(PN)＝{[(PI均2)+(PI最大2)/2]}1/2；单项污染指数(PI)＝土壤污染物实测值/评价标准；式中PI均和PI最大分别是平均单项污染指数和最大单项污染指数。内梅罗指数污染评价结果见表3。根据内梅罗指数，将采样种群筛选出15个种群用于后续遗传变异和水培实验。非污染种群筛选的标准是采样点土壤和叶片重金属含量低，内梅罗指数小。而污染种群则是采样点土壤和叶片重金属含量高，内梅罗指数大。其中，非污染种群为郴州(CZ)、张家界(ZJJ)、西华山(XH)、杭州(HZ)及紫金山(NZM)。Mn污染种群为吉首(JS)、花垣(JH)、永州(YZ)、崇左(DX)和桂平(GP)。Cd污染种群为汤山(TS)、长沙(CS)、衡阳(HY)、冷水江(LD)及于都(YD)。
表3各采样点锰和镉污染情况评价(内梅罗指数)
野外美洲商陆种群的遗传变异分析
美洲商陆基因组DNA提取：对野外采集和同质园实验的美洲商陆叶片提取DNA，本实验采用植物基因组DNA Plant DNAzol试剂盒提取。使用Onedrop1000微量分光光度计检测DNA纯度和浓度，检测A260/A280，A260/A230。通过1.0％琼脂糖凝胶电泳进一步鉴定DNA模板的完整性。
野外美洲商陆种群基因组AFLP分析：AFLP流程参照Vos等的AFLP方法并经修改进行。使用EcoRI+MseI 2个限制性核酸内切酶对基因组DNA酶切、接头连接、预扩增、选择性扩增、毛细光荧光电泳。AFLP用到的引物、接头和荧光毛细管电泳由苏州金唯智生物公司合成。接头和引物序列信息详细见表4。
表4美洲商陆AFLP分析用到的接头和引物序列
基因组DNA酶切：对每个美洲商陆基因组DNA进行EcoRI+MseI限制性核酸内切酶酶切，37℃酶切3h。酶切体系如表5。待反应结束后，65℃水浴20min使酶灭活。
表5美洲商陆AFLP双酶切体系
酶切产物接头复性：将EcoRI接头(E1，E2)和MseI接头(M1，M2)复性形成双链。具体方法如下：先将接头稀释浓度到100μM。EcoRI接头按照取2μl E1+2μl E2补水至40μl，浓度为5μM。MseI接头按照20μl M1+20μl M2，浓度为50μM。PCR复性程序：90℃，1.5min；64循环，每一循环温度下降1℃；25℃，30s；4℃保存。
酶切产物接头连接：按表6中体系加入各反应成分，混匀后16℃连接过夜，得到T4连接产物。反应完成后70℃灭活10min，4℃保存。
表6美洲商陆AFLP接头连接体系
预扩增：将T4连接产物稀释10倍。按表7中体系加入各反应成分。PCR程序如下：94℃，30s；56℃，1min；72℃，1min；30个循环，4℃保存。预扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上检测结果显示，扩增条带在100-700bp之间具有较亮的弥散，主带集中在500bp左右，条带范围在荧光毛细管电泳和聚丙烯酰胺凝胶的检测范围内(图1)。
表7美洲商陆AFLP预扩增体系
选择性扩增引物筛选：预扩增产物稀释10倍。按表8中体系加入各反应成分，选择性扩增引物对为荧光引物。PCR程序如下：94℃，30s；65℃，30s；72℃，1min；12个循环，每1循环温度下降0.7℃；94℃，30s；56℃，30s；72℃，1min；22个循环，4℃保存。利用1.5％的琼脂糖凝胶对64对不同选择性扩增引物对进行筛选，选择标准为条带多且清晰，不同处理间有差别。最终筛选出8对适合美洲商陆的AFLP引物(E14×M13、E14×M42、E21×M14、E21×M21、E34×M11、E34×M32、E44×M11、E44×M42)。筛选结果详见图2。EcoRI-选择性引物选自引物E14、E21、E34、E44的一种；MseI-选择性引物选自引物M13、M14、M21、M11、M32、M42的一种。
表8美洲商陆AFLP选择性扩增体系
AFLP数据分析：
条带的统计和种群遗传多样性：统计每个种群个体的条带数，若该条带在种群中只有一个，则去掉这个条带。计算条带多态性百分数。先利用Genemaker将得到的结果转化成二进制格式，再通过Matlab将每个二进制表整合到一个总二进制表中，最后通过利用R语言的AFLPdat软件将二进制表转换成各软件分析所需要的格式并计算Nei’遗传变异程度(h)。同时利用Popgene 1.32得到基因流(NM)，多态性条带数目(FP)，等位基因数(NA)和Shannon多样性指数(H)等群体遗传多样性指标。选择8对引物组合对15个美洲商陆种群(270个体)进行AFLP扩增，获得可判断的扩增片段954个。其中943个条带(98.85％)具有多态性。扩增片段长度为49-509bp。各美洲商陆种群含有的多态性片段数目(FP)、多态性片段百分数(PPF)、观测等位基因数目(NA)、有效等位基因数目(NE)、遗传多样性指数(h)，Shannon多样性指数(H)见表9。8对引物的平均扩增计数错误率小于5％。结果显示，非污染种群的遗传多样性是最高的，其次是锰污染种群，镉污染种群的遗传多样性是最低的。
表9基于AFLP结果对美洲商陆野外15个种群的群体遗传多样性统计
注：NA:Observed number of alleles等位基因数；NE:Effective number ofalleles等位基因有效数；h:Nei’s gene diversity(Nei’遗传变异程度)；H:Shannon’sinformation index(Shannon多样性指数)；NM:estimate gene flow from GST or GSC(基因流)；N:the number of individuals in population种群中个体数量；FP:the number ofpolymorphic fragments多态性条带数目；PPF:the percentage of polymorphicfragments多态性条带百分比
遗传结构分析：Arlequin 2.0进行分组分层AMOVA分子变异分析，用来描述分组间以及组内种群间分化。利用Phylip 3.69软件进行Nei遗传距离的NJ(neighbor-joining)树分析，bootstrap值为1000。通过Structure 2.3.4，比较不同K值得计算结果来寻找最适的K值，根据等位基因频率，不同个体被分配到不同组中。Structure设置参数为Length ofburnin period＝5000，MCMC reps after burnin＝5000，选择No admixture模型，K选择1-15，重复计算3次。将15个野外美洲商陆群体分为非污染种群(CK)、锰污染种群(Mn-polluted)和镉污染种群(Cd-polluted)三组，并进行分组分层AMOVA分子变异分析(表10)，结果显示其中38.6％的分子变异来自组间变异，7.24％来自组内种群间变异，54.16％来自种群内变异。美洲商陆野外种组间发生了高度遗传分化(FST＝0.45841)。NJ树结果显示(图3)，非污染种群、锰污染种群和镉污染种群分别聚集到3支中，支持率分别为88％和100％。Structure结果显示(图4)，当K＝3时，Delta K值最大，表明3是最适的K值。当K＝3时，15个野外美洲商陆群体被分为三个基因库，刚好对应了非污染种群、锰污染种群和镉污染种群这三种种群来源，与NJ聚类结果一致。由AFLP的遗传变异分析得知，不同类型污染区的美洲商陆种群已产生遗传分化，结合后面的生理结果可知已分化成不同的生态型。
表10分组后分子方差变异结果(AMOVA)
水培实验
美洲商陆幼苗培养：选择遗传分析中美洲商陆种群的种子，共15个种群，每个种群18个个体，每个种群的每棵植株选取多粒种子进行培养。采集的种子先干燥处理，再去除瘪粒、霉粒，挑选出饱满优质的种子。合格的种子在浓硫酸中浸泡20min，用水冲洗种子。将美洲商陆种子播种在蛭石基质上发芽，待幼苗长至2片子叶全部打开时，选取长势和大小一致的幼苗，将其移栽到1L的塑料杯中，每个塑料杯种3株美洲商陆。开始时在去离子水中预培养2天，然后使用1/8Hoagland营养液培养，再逐步换为1/4、1/2和完全Hoagland培养液。每2天换一次培养液，并用HCl或NaOH溶液将营养液pH调至5.2。Hoagland营养液中具体成分为：2.5mM Ca(NO3)2、2.5mM KNO3、l.0mM MgSO4、0.5mM KH2PO4、20μM Fe-EDTA、46μM H3BO3、0.32μM CuSO4、0.71μM ZnSO4、11.1μM MnCl2、0.38μM H2MoO4。重金属处理：待15个美洲商陆种群幼苗长至4叶1心期(不包括子叶)时，开始处理(表11)，来自同一种群的同一植株的种子分别进行CK、10mmol L-1Mn、10μmol L-1Cd处理。Mn和Cd分别以MnCl2母液和CdCl2母液的形式添加到Hoagland营养液中。对照为Hoagland营养液，每2天换一次处理液，处理50d。处理结束收苗时，先将美洲商陆幼苗用去离子水冲洗，再将根系浸泡在CaCl2溶液中，用去离子水冲洗几次，然后用吸水纸将表面的水分吸除。分别测量株高、鲜重及叶片锰/镉含量等指标。叶片锰/镉含量的测定采取成熟叶片的倒三叶。叶片金属元素的测定采用浓酸湿法消煮，使用优级纯的硝酸和高氯酸按照体积87:13配成混酸。称取0.2000±0.0050g过60目筛的植物样品放入消煮管中，加入5ml混酸，常温下冷消煮过夜(大约10h)，然后再电热消煮炉逐步升温至160-180℃蒸干，再准确加入10ml 2.5％硝酸(w/v)。涡旋使沉淀溶解，并在65℃水浴60min，然后再涡旋一次，转移到15ml离心管中。消煮样品经静止或离心后，将上清液转移到新的15ml离心管中备用。使用电感耦合等离子体质谱(ICP)分别测定叶片中的Mn和Cd的含量。所得数据利用软件SPSS19.0进行ANOVA方差分析，比较污染种群与非污染种群之前是否存在显著差异。由表12可知，在10mMMn处理下，来自锰污染区的美洲商陆种群株高同样高于非污染种群。锰污染种群花垣(JH)的株高最高(38.8cm)，非污染种群张家界(ZJJ)的株高最低(21.46cm)。由表13可知，在10μM Cd处理下，镉污染美洲商陆种群株高显著高于非污染种群，其中镉污染种群长沙(CS)的株高最高(27.96cm)，非污染种群郴州(CZ)的株高最低(9.19cm)。由表14可见，在10mMMn处理下，锰污染美洲商陆种群鲜重显著性高于非污染种群，其中锰污染种群崇左(DX)的相对鲜重最高(0.81)，非污染种群紫金山(NZM)的相对株高最低(0.49)。由表15可见，在10μM Cd处理下，镉污染美洲商陆种群鲜重与非污染种群无显著差别。由表16可见，对10mMMn处理下，10个不同美洲商陆种群间叶片的Mn含量没有显著性差异，锰污染种群和非污染美洲商陆群体间没有差异。由表17可见，在10μM Cd处理下，镉污染美洲商陆种群镉积累量大于非污染种群，其中镉污染种群于都(YD)含量最高，达到106mgkg-1。
以上结果表明，来自三种不同污染区的种群已经发生遗传分化，并且在生理上也存在差异，已分化成三种不同的生态型。锰污染种群与非污染种群相比，尽管叶片锰含量没有显著差别，但在整体生物量上有显著增加，因此能够在锰污染环境下生长更好，且增加整株的锰吸收量；镉污染种群与非污染种群相比叶片镉含量显著增加，预示着来自镉污染区的美洲商陆种群在修复镉污染土壤中具有更为有效的应用前景。
表11水培实验美洲商陆种群的重金属处理
表12 10个美洲商陆种群在Mn处理50d后植物株高
注：Net表示占各自对照百分比，为相对值；*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；NS：统计不显著
表13 10个美洲商陆种群在Cd处理50d后植物株高
注：Net表示占各自对照百分比，为相对值；*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；NS：统计不显著
表14美洲商陆种群在Mn处理50d后植物鲜重
注：Net表示占各自对照百分比，为相对值；*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；NS：统计不显著
表15美洲商陆种群在Cd处理50d后植物鲜重
注：Net表示占各自对照百分比，为相对值；*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；NS：统计不显著
表16不同美洲商陆种群叶片中Mn的积累量
注：*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；NS：统计不显著
表17不同种群美洲商陆叶片Cd积累量
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
序列表
<110>南京农业大学
<120>一种锰镉吸收高效生态型美洲商陆的筛选方法
<160> 16
<170>PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 接头E1
<400> 1
ctcgtagactgcgtacc 17
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 接头E2
<400> 2
aattggtacgcagtctac 18
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 接头M1
<400> 3
gacgatgagtcctgag 16
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> 接头M2
<400> 4
tactcaggactcat 14
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 预扩增引物E01
<400> 5
gactgcgtaccaattca 17
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213>预扩增引物M03
<400> 6
gatgagtcctgagtaac 17
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 选择性引物E14
<400> 7
gactgcgtaccaattcaag 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213>选择性引物E21
<400> 8
gactgcgtaccaattcata 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213>选择性引物E34
<400> 9
gactgcgtaccaattcacg 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213>选择性引物E44
<400> 10
gactgcgtaccaattcagg 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213>选择性引物M11
<400> 11
gatgagtcctgagtaacaa 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213>选择性引物M13
<400> 12
gatgagtcctgagtaacac 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213>选择性引物M14
<400> 13
gatgagtcctgagtaacag 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213>选择性引物M21
<400> 14
gatgagtcctgagtaacta 19
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213>选择性引物M32
<400> 15
gatgagtcctgagtaacct 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213>选择性引物M42
<400> 16
gatgagtcctgagtaacgt 19

Claims (10)

1.一种锰/镉吸收高效生态型美洲商陆的筛选方法，包括如下步骤：
1)野外采集我国多个污染地区和非污染地区美洲商陆种群的叶片、种子和附近的土壤；
2)检测多个地区美洲商陆种群附近土壤的锰/镉含量，分别选取高锰污染、高镉污染、非污染地区的美洲商陆种群；
3)对选取的美洲商陆种群叶片进行AFLP分子标记检测，分析其遗传结构；
4)根据AFLP遗传分析的结果，选取发生不同遗传分化的美洲商陆种群室内繁殖幼苗，将幼苗进行锰、镉和正常Hoagland溶液培养50天，以美洲商陆株高、鲜重及叶片锰/镉含量为指标择优筛选出锰/镉吸收高效生态型美洲商陆。
2.根据权利要求1所述的一种锰/镉吸收高效生态型美洲商陆的筛选方法，其特征在于：
在步骤2)中，土壤锰和镉的测定采用浓酸湿法消煮的方法，使用优级纯的硝酸和高氯酸按照体积4:1配成混酸，常温下冷消煮10h，然后用电热消煮炉逐步升温至160-180℃蒸干。
3.根据权利要求1所述的一种锰/镉吸收高效生态型美洲商陆的筛选方法，其特征在于：
在步骤2)和步骤3)之间，还有如下步骤：对选取的高锰污染、高镉污染、非污染地区的美洲商陆种群，采用内梅罗污染指数进行污染评价。
4.根据权利要求1所述的一种锰/镉吸收高效生态型美洲商陆的筛选方法，其特征在于：
在步骤3)中，AFLP分子标记检测具体过程为：使用EcoRI+MseI 2个限制性核酸内切酶对基因组DNA酶切、接头连接、预扩增、选择性扩增、毛细光荧光电泳；筛选出的适用于美洲商陆选择性扩增的8对引物为E14×M13、E14×M42、E21×M14、E21×M21、E34×M11、E34×M32、E44×M11、E44×M42。
5.根据权利要求1所述的一种锰/镉吸收高效生态型美洲商陆的筛选方法，其特征在于：
在步骤3)中，利用Genemaker软件进行AFLP条带的统计，并将得到的结果转化成二进制格式，再通过Matlab将每个二进制表整合到一个总二进制表中；利用R语言的AFLPdat软件将二进制表转换成各软件分析所需要的格式并计算Nei’遗传变异程度h；利用Popgene1.32得到基因流NM，多态性条带数目FP，等位基因数NA和Shannon多样性指数H等群体遗传多样性指标；利用Arlequin 2.0进行分组分层AMOVA分子变异分析，用来描述分组间以及组内种群间分化；利用Phylip 3.69软件进行Nei遗传距离的NJ(neighbor-joining)树分析；通过Structure 2.3.4，比较不同K值得计算结果来寻找最适的K值，根据等位基因频率，不同个体被分配到不同组中。
6.根据权利要求1所述的一种锰/镉吸收高效生态型美洲商陆的筛选方法，其特征在于：
在步骤4)中，合格的种子在浓硫酸中浸泡20min，用水冲洗种子；将美洲商陆种子播种在蛭石基质上发芽，待幼苗长至2片子叶全部打开时，选取长势和大小一致的幼苗，将其移栽到1L的塑料杯中，每个塑料杯种3株美洲商陆；开始时在去离子水中预培养2天，然后使用1/8 Hoagland营养液培养，再逐步换为1/4、1/2和完全Hoagland培养液；每2天换一次培养液，并用HCl或NaOH溶液将营养液pH调至5.2。
7.根据权利要求1所述的一种锰/镉吸收高效生态型美洲商陆的筛选方法，其特征在于：
在步骤4)中，Hoagland营养液中具体成分为：2.5mM Ca(NO3)2、2.5mM KNO3、l.0mMMgSO4、0.5mM KH2PO4、20μM Fe-EDTA、46μM H3BO3、0.32μM CuSO4、0.71μM ZnSO4、11.1μMMnCl2、0.38μM H2MoO4。
8.根据权利要求1所述的一种锰/镉吸收高效生态型美洲商陆的筛选方法，其特征在于：
在步骤4)中，待美洲商陆幼苗长至4叶1心期时，开始处理，锰镉的处理浓度分别为10mmol L-1Mn、10μmol L-1Cd；Mn和Cd分别以MnCl2母液和CdCl2母液+的形式添加到Hoagland营养液中；对照为Hoagland营养液，每2天换一次处理液，处理50d。
9.根据权利要求8所述的一种锰/镉吸收高效生态型美洲商陆的筛选方法，其特征在于：
在步骤4)中，处理结束收苗时，先将美洲商陆幼苗用去离子水冲洗，再将根系浸泡在CaCl2溶液中，用去离子水冲洗几次，然后用吸水纸将表面的水分吸除。
10.根据权利要求1所述的一种锰/镉吸收高效生态型美洲商陆的筛选方法，其特征在于：
在步骤4)中，叶片金属元素的测定采用浓酸湿法消煮，使用优级纯的硝酸和高氯酸按照体积87:13配成混酸；常温下冷消煮过夜，然后再电热消煮炉逐步升温至160-180℃蒸干。
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