CN107475198A - 一种树鼩多巴胺能神经元细胞分离培养方法 - Google Patents

一种树鼩多巴胺能神经元细胞分离培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种树鼩多巴胺能神经元细胞分离培养方法，属于细胞分离培养技术领域。本发明将3日龄内的离体树鼩大脑放入预冷的含2%双抗的D‑Hank's液中，去除软膜血管，剥离出大脑皮质及中脑组织，用D‑Hank's液清洗后，剪碎，离心，弃上清，胰酶消化后，过细胞筛，滤液离心，弃上清，用神经元专用培养基重悬细胞，转入PDL包被的细胞板上培养，培养3d后换液，以后每3天换一次液；当细胞贴壁并长至70%‑80%时，进行酪氨酸羟化酶及Nestin蛋白的双荧光免疫鉴定。利用本方法分离培养出的神经元细胞成活率高达95%，能为进一步的神经系统疾病的研究提供可靠的实验材料。

Description

一种树鼩多巴胺能神经元细胞分离培养方法
技术领域
本发明属于细胞分离培养技术领域，具体涉及一种树鼩多巴胺能神经元细胞分离培养方法。
背景技术
神经细胞不具有再生功能，但神经元细胞可以自我更新，能够促进神经细胞再生和神经组织修复，目前神经元细胞难以分离培养。神经性疾病如帕金森综合征、毒品依赖性疾病等会作用于多巴胺能神经细胞，因此找到一种高效分离培养及鉴定多巴胺能神经元细胞的方法是非常必要的。树鼩是一种新型的模式动物，全基因组研究发现它的代谢、神经及免疫系统与人类有着较为高度的同源性，是研究神经系统疾病较好的模型。本发明选用新生树鼩为动物模型，分离培养出具有多巴胺能神经元活性的细胞，从而为进一步的神经系统疾病的研究奠定基础。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种树鼩多巴胺能神经元细胞分离培养方法，该方法利用胰酶消化法分离树鼩神经元细胞，细胞活性较高，能够分离出多巴胺能神经元，为进一步的神经系统疾病的研究奠定基础。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种树鼩多巴胺能神经元细胞分离培养方法，包括如下步骤：
步骤（1），将3日龄内的离体树鼩大脑放入4℃的含体积浓度为2%双抗的D-Hank's液中，去除软膜血管，剥离出大脑皮质及中脑组织，用D-Hank's液清洗后，将组织剪碎至0.9~1.1mm大小，离心，弃上清，按照体积1:3比例加入0.25%胰酶消化液（即离心管中剩余物与0.25%胰酶消化液的体积比为1:3），于细胞培养瓶中，反复吹打并于37℃、5%CO2条件下消化；
步骤（2），待步骤（1）消化结束后，向细胞培养瓶中加入细胞培养液终止消化，反复吹打消化后的细胞直至无肉眼可见的组织块，之后采用70目细胞筛过滤，滤液离心，弃上清，用神经元专用培养基重悬细胞并转入0.1mg/ml PDL包被的细胞板上培养，细胞板中细胞含量为1×106cell/孔，培养3d后换液，更换为新的神经元专用培养基，以后每3天换一次液，得到树鼩多巴胺能神经元细胞；当细胞贴壁并长至汇合度为70%-80%时，进行酪氨酸羟化酶及Nestin蛋白的双荧光免疫鉴定；
所述的细胞培养液为高糖DMEM细胞培养基+5%FBS+1%双抗；
所述的神经元专用培养基为neurbasal培养基+ 2%B27+1%GlutamaxTM+ 1%双抗。
进一步，优选的是，步骤（1）所述的离心速度为2500~3000转/分，离心时间5~10分钟；
进一步，优选的是，步骤（1）中，采用眼科剪将组织剪碎；
进一步，优选的是，步骤（1）中，所述的消化的消化时间15~20分钟；
进一步，优选的是，步骤（2）所述的离心速度为2500~3000转/分，离心时间10~15分钟。
利用本发明方法，神经元细胞分离1天后贴壁生长，7天后经免疫双荧光鉴定为具有多巴胺能活性的神经元细胞。
本发明利用胰酶消化法分离树鼩神经元细胞，细胞活性较高，能够分离出多巴胺能神经元。
本方法需注意：分离过程全程为无菌操作，所用耗材均为灭菌处理。
本发明除非另有说明，否则百分号代表体积百分数。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
1、目前尚无专利涉及树鼩多巴胺神经元细胞分离培养方法，本发明方法简单高效，能快速分离培养出树鼩多巴胺能神经元细胞。
2、经过本方法分离出的树鼩多巴胺能神经元细胞，可以用于多巴胺能神经元细胞相关疾病的研究。
3、利用本方法分离培养出的神经元细胞的成活率达到95%，能为进一步的神经系统疾病的研究提供可靠的实验材料。
附图说明
图1是树鼩多巴胺能神经元细胞的镜下形态（200倍）；
图2是培养经培养后双免疫荧光鉴定为多巴胺能神经元细胞。A为细胞核染色；B为Nestin蛋白染色；C为酪氨酸羟化酶染色；D为A、B、C三幅图的叠加图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
GlutamaxTM：谷氨酰胺；
Neurbasa：神经专用培养基；
FBS：胎牛血清；
DMEM：细胞培养基；
TH：酪氨酸羟化酶，TH阳性表示细胞具有多巴胺能活性；
Nestin蛋白：巢氏蛋白，是神经元细胞的标志，阳性表示细胞为神经元细胞。
一、培养前准备
1. 器械和器皿
器械：外科剪、镊子、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等，用超声清洗后，用70~80%酒精酒浸泡1小时以上消毒，使用时用酒精棉球擦拭即可。
2.一次性培养皿、培养瓶、细胞板、细胞筛、吸管、吸头等，均为无菌无酶，即开即用。
3.培养基和培养用液的配制
1）多聚赖氨酸（Poly-D-lysine），浓度为0.1mg/ml。
2）神经元专用培养基：96ml Neurbasal+2ml B27+1ml GlutamaxTM+1ml双抗
3）细胞培养液：94ml高糖DMEM细胞培养基+5ml FBS+1ml双抗
本发明实施例中对于树鼩大脑的取得方式没有任何限制，如现有方法中通常是将新生3日龄内树鼩采用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，将头部放入含75%酒精的培养皿中，于冰上取出完整大脑。
实施例1
一种树鼩多巴胺能神经元细胞分离培养方法，包括如下步骤：
步骤（1），将3日龄内的离体树鼩大脑放入4℃的含体积浓度为2%双抗的D-Hank's液中，去除软膜血管，剥离出大脑皮质及中脑组织，用D-Hank's液清洗后，采用眼科剪将组织剪碎至0.9~1mm大小，离心，弃上清，按照体积1:3比例加入0.25%胰酶消化液，于细胞培养瓶中，反复吹打并于37℃、5%CO2条件下消化15分钟；
步骤（2），待步骤（1）消化结束后，向细胞培养瓶中加入细胞培养液终止消化，反复吹打消化后的细胞直至无肉眼可见的组织块，之后采用70目细胞筛过滤，滤液离心，弃上清，用神经元专用培养基重悬细胞并转入0.1mg/ml PDL包被的细胞板上培养，细胞板中细胞含量为1×106cell/孔，培养3d后换液，更换为新的神经元专用培养基，以后每3天换一次液，得到树鼩多巴胺能神经元细胞；
所述的细胞培养液为高糖DMEM细胞培养基+ 5%FBS+1%双抗；
所述的神经元专用培养基为neurbasal培养基+ 2%B27+1%GlutamaxTM+ 1%双抗。
其中，步骤（1）所述的离心速度为25000转/分，离心时间5分钟；步骤（2）所述的离心速度为2500转/分，离心时间10分钟。
实施例2
一种树鼩多巴胺能神经元细胞分离培养方法，包括如下步骤：
步骤（1），将3日龄内的离体树鼩大脑放入4℃的含体积浓度为2%双抗的D-Hank's液中，去除软膜血管，剥离出大脑皮质及中脑组织，用D-Hank's液清洗后，采用眼科剪将组织剪碎至1~1.1mm大小，离心，弃上清，按照体积1:3比例加入0.25%胰酶消化液，于细胞培养瓶中，反复吹打并于37℃、5%CO2条件下消化20分钟；
步骤（2），待步骤（1）消化结束后，向细胞培养瓶中加入细胞培养液终止消化，反复吹打消化后的细胞直至无肉眼可见的组织块，之后采用70目细胞筛过滤，滤液离心，弃上清，用神经元专用培养基重悬细胞并转入0.1mg/ml PDL包被的细胞板上培养，细胞板中细胞含量为1×106cell/孔，培养3d后换液，更换为新的神经元专用培养基，以后每3天换一次液，得到树鼩多巴胺能神经元细胞；
所述的细胞培养液为高糖DMEM细胞培养基+ 5%FBS+1%双抗；
所述的神经元专用培养基为neurbasal培养基+ 2%B27+1%GlutamaxTM+ 1%双抗。
其中，步骤（1）所述的离心速度为3000转/分，离心时间10分钟。步骤（2）所述的离心速度为3000转/分，离心时间15分钟。
实施例3
一种树鼩多巴胺能神经元细胞分离培养方法，包括如下步骤：
步骤（1），将3日龄内的离体树鼩大脑放入4℃的含体积浓度为2%双抗的D-Hank's液中，去除软膜血管，剥离出大脑皮质及中脑组织，用D-Hank's液清洗后，采用眼科剪将组织剪碎至0.95~1.05mm大小，离心，弃上清，按照体积1:3比例加入0.25%胰酶消化液，于细胞培养瓶中，反复吹打并于37℃、5%CO2条件下消化18分钟；
步骤（2），待步骤（1）消化结束后，向细胞培养瓶中加入细胞培养液终止消化，反复吹打消化后的细胞直至无肉眼可见的组织块，之后采用70目细胞筛过滤，滤液离心，弃上清，用神经元专用培养基重悬细胞并转入0.1mg/ml PDL包被的细胞板上培养，细胞板中细胞含量为1×106cell/孔，培养3d后换液，更换为新的神经元专用培养基，以后每3天换一次液，得到树鼩多巴胺能神经元细胞；当细胞贴壁并长至汇合度为70-80%时，进行酪氨酸羟化酶及Nestin蛋白的双荧光免疫鉴定；树鼩多巴胺能神经元细胞镜下形态如图1所示
所述的细胞培养液为高糖DMEM细胞培养基+ 5%（体积百分浓度）FBS+1%（体积百分浓度）双抗；
所述的神经元专用培养基为neurbasal培养基+ 2%（体积百分浓度）B27+1%（体积百分浓度）GlutamaxTM+ 1%（体积百分浓度）双抗。
其中，步骤（1）所述的离心速度为2600转/分，离心时间7分钟。步骤（2）所述的离心速度为2800转/分，离心时间13分钟。
酪氨酸羟化酶及Nestin蛋白的双荧光免疫鉴定操作方法：
1、细胞生长密度达到70％~80％时，吸出培养液，用1×PBS洗2遍，每次5分钟。
2、加入4℃预冷的4%多聚甲醛，覆盖即可，放入4℃冰箱固定30分钟。
3、室温下，吸出4%多聚甲醛，用1×PBS洗3遍，每次5分钟。
4、加入体积浓度为0.1%Triton™ X-100 ，覆盖即可，20分钟后吸出，然后用1×PBS洗3遍，每次5分钟。
5、用体积浓度为5%牛血清白蛋白室温封闭1小时。
6、吸出封闭液，加入5%牛血清白蛋白稀释的Nestin兔克隆蛋白抗体（1:200稀释）和TH鼠克隆蛋白抗体（1:200），覆盖即可，放入4℃冰箱中反应过夜。
7、在室温下，吸取上述液体，用1×PBS洗3遍，每次分钟。
8、加入1%牛血清白蛋白稀释的抗兔（荧光标记为：Alexa Fluor555）和抗鼠（荧光标记为FITC），稀释比例为1:500，覆盖即可，室温作用1h。
9、吸出二抗，用1×PBS洗3遍，每次5分钟。
10、加入核染色剂DAPI(1:500)，室温染色1分钟，用1×PBS洗3遍，每次5分钟，然后用荧光显微镜观察结果。
结果如图2所示，A为细胞核染色，呈阳性；B为Nestin蛋白染色，呈阳性；C为酪氨酸羟化酶染色，呈阳性；D为A、B、C三幅图的叠加图，说明在同一个细胞核内，经酪氨酸羟化酶及Nestin蛋白的双荧光免疫鉴定，得到了树鼩多巴胺能神经元细胞。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (5)

1.一种树鼩多巴胺能神经元细胞分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），将3日龄内的离体树鼩大脑放入4℃的含体积浓度为2%双抗的D-Hank's液中，去除软膜血管，剥离出大脑皮质及中脑组织，用D-Hank's液清洗后，将组织剪碎至0.9~1.1mm大小，离心，弃上清，按照体积1:3比例加入0.25%胰酶消化液，于细胞培养瓶中，反复吹打并于37℃、5%CO2条件下消化；
步骤（2），待步骤（1）消化结束后，向细胞培养瓶中加入细胞培养液终止消化，反复吹打消化后的细胞直至无肉眼可见的组织块，之后采用70目细胞筛过滤，滤液离心，弃上清，用神经元专用培养基重悬细胞并转入0.1mg/ml PDL包被的细胞板上培养，细胞板中细胞含量为1×106cell/孔，培养3d后换液，更换为新的神经元专用培养基，以后每3天换一次液，得到树鼩多巴胺能神经元细胞；
所述的细胞培养液为高糖DMEM细胞培养基+ 5%FBS+1%双抗；
所述的神经元专用培养基为neurbasal培养基+ 2%B27+1%GlutamaxTM+ 1%双抗。
2.根据权利要求1所述的树鼩多巴胺能神经元细胞分离培养方法，其特征在于，步骤（1）所述的离心速度为2500~3000转/分，离心时间5~10分钟。
3.根据权利要求1所述的树鼩多巴胺能神经元细胞分离培养方法，其特征在于，步骤（1）中，采用眼科剪将组织剪碎。
4.根据权利要求1所述的树鼩多巴胺能神经元细胞分离培养方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的消化的消化时间15~20分钟。
5.根据权利要求1所述的树鼩多巴胺能神经元细胞分离培养方法，其特征在于，步骤（2）所述的离心速度为2500~3000转/分，离心时间10~15分钟。
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