CN107462683A - 一种木藤蓼降尿酸降血糖作用的研究方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种木藤蓼降尿酸降血糖作用的研究方法,该方法包括以下步骤:步骤1、关于降尿酸的供试品的制备;步骤2、关于降尿酸的造模剂的配制;步骤3、关于降尿酸的阳性药的配制;步骤4、关于降尿酸的造模与给药;步骤5、关于降尿酸的取材与检测;步骤6、关于降尿酸的统计学处理;步骤7、关于降血糖的供试品的制备;步骤8、关于降血糖的造模剂的配制;步骤9、关于降血糖的阳性药的配制;步骤10、糖尿病模型的建立;步骤11、关于降血糖的动物分组及给药;给药前后体重变化;步骤12、给药前后体重变化;步骤13、脏器系数的变化;步骤14、关于降血糖的统计学处理。本发明为木藤蓼降尿酸降血糖作用的研究奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,涉及一种木藤蓼降尿酸降血糖作用的研究方法。
背景技术
木藤蓼Polygonum aubertii Henry为多年生半灌木。茎长达数米,近直立或缠绕,表面红紫色,无毛,实心,近木质。叶簇生,厚实,叶片卵形或阔三角形,长1~5厘米,宽0.5~3厘米,顶端尖,基部近心形或箭形,叶缘波状,两面均无毛;叶柄细弱,长0.5~2.5厘米;花序圆锥状,腋生或顶生,花轴上有毛;苞片膜质,褐色,漏斗状,顶端急尖,每苞内具2~8花;花梗细,长3~4毫米,下部具关节;花被5深裂,浅粉红色或白色,花被片外面3片较大,背部具翅,果时增大,基部下延;花被果时外形呈倒卵形,雄蕊8,比花被短,花丝中下部较宽,基部具柔毛;花柱极短,柱头头状。瘦果卵形,具3棱,黑褐色,密被小颗粒,微有光泽,包于宿存花被内。花期7~8月,果期8~9月。
近年来,随着人们物质生活水平的提高,世界范围内痛风的发病率逐年上升。痛风是体内嘌呤代谢异常从而致使尿酸合成增加的一种体内代谢疾病。体内尿酸过高的主要原因有两个:一是外源性嘌呤类物质摄入过多或体内黄嘌呤氧化酶功能异常,导致生成尿酸过多;二是排泄尿酸量减少以致尿酸蓄积。目前通过抑制黄嘌呤氧化酶的药物主要是别嘌呤,虽然疗效较好,但存在肾损伤、骨髓抑制等严重不良反应。苯溴马隆可以促进尿酸排泄,但其可能会引起严重不良反应如肝炎等。治疗痛风,中药已有千年的历史,从中药中寻找高效、低毒的抗痛风药物是有巨大的优势和潜力。
糖尿病是一种因胰岛素绝对或相对不足以及靶细胞对胰岛素敏感性降低,引起糖、蛋白质、脂肪和继发性水、电解质代谢紊乱综合征,临床上以高血糖为主要特征,影响全身营养物质代谢并且易发多种严重并发症的慢性疾病,表现为高血糖和糖尿,常伴有多组织、多器官的慢性并发症,严重影响机体正常功能。据调查显示,随着我国社会的发展和人们生活模式的变化,我国糖尿病发病率在不断上升,这是一个值得引起重视的问题!而目前的降糖产品主要是化学合成类的处方药品,虽然效果明显,但长期服药引起的耐药性、抗药性、肝肾损伤等副作用都让糖尿病患者甚感痛苦,因此研究抗糖尿病的中药及保健食品都具有非常重要的实际意义。
糖尿病是由内分泌紊乱引起的代谢性疾病,涉及到多器官、多靶点损伤。目前尚无治疗糖尿病,及其并发症的理想西药。但中药藏药在治疗多靶点多器官的糖尿病及其并发症方面具有独特优势。
现有技术中,未发现关于木藤蓼降尿酸降血糖作用的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种木藤蓼降尿酸降血糖作用的研究方法。
其具体技术方案为:
一种木藤蓼降尿酸降血糖作用的研究方法,包括以下步骤:
步骤1、关于降尿酸的供试品的制备
依据药材常用量2~6g,本试验以口服生药量6g作为成人(60kg)最大日用量,按照实验动物与人用药量的换算公式计算,得到小白鼠的用药量(1.2g/Kg)。设此为中剂量组,在此数据上加减分设高剂量和低剂量。即高剂量组(2.4g/Kg)、中剂量组(1.2g/Kg)、低剂量组(0.6g/Kg)。取木藤蓼冻干粉,均用0.5%CMC-Na溶液准确配置供试溶。
步骤2、关于降尿酸的造模剂的配制
精密称取氧嗪酸钾5g,研磨后加入0.5%CMC-Na溶液至0.4L,超声分散,配置成12.5mg/ml的氧嗪酸钾混悬液,临用前摇匀,使其均匀分散。
步骤3、关于降尿酸的阳性药的配制
取别嘌醇100mg(1片),研磨后加入0.5%CMC-Na溶液至0.4L,超声分散,配置成0.25mg/ml的混悬液,临用前摇匀,使其均匀分散。
步骤4、关于降尿酸的造模与给药
小鼠每组10只,随机分为12组,依次为空白对照组、模型对照组、别嘌醇组,木藤蓼高、中、低剂量组。分组后开始给药造高尿酸模型,除正常对照组给予等容积的溶媒,其余每组小鼠均给氧嗪酸钾(250mg/kg)制备高尿酸模型,造模1h后除正常对照组和模型对照组给与等溶剂的溶媒外,其余各组分别给于相应地治疗药物,以上给药方式均为灌胃给药,给药容积为0.2ml/10g,每日造模和给药各一次,持续给药7天。
步骤5、关于降尿酸的取材与检测
末次给药1h后眼眶取血,室温下自然凝血1h,3000rpm离心5min,分离得到血清。
按尿酸测试剂盒说明书采用磷钨酸还原法测量血清尿酸(Serum Rric Acid,SUA)。
计算公式:
解剖取适量小鼠肝组织称重,加入9倍量的生理盐水,制备10%肝匀浆液,3000rpm离心10min,取上清液,按照黄嘌呤氧化酶检测试剂盒方法测定黄嘌呤氧化酶活性(Xanthine Oxidase,XOD)。计算公式:
其中黄嘌呤摩尔消光系数为12.6×10-3,光径为1cm,匀浆蛋白含量为227g/L,反应时间为20min,于530nm处测吸光度值。
步骤6、关于降尿酸的统计学处理
所得数据用SPSS 16.0软件分析,用、表示。采用单因素方差分析进行组间显著性检验。
步骤7、关于降血糖的供试品的制备
依据药材常用量2~6g,本试验以口服生药量6g作为成人(60kg)最大日用量,按照实验动物与人用药量的换算公式计算,得到小白鼠的用药量(1.2g/Kg)。取木藤蓼冻干粉,均用蒸馏水溶解准确配置供试溶液。
步骤8、关于降血糖的造模剂的配制
四氧嘧啶很容易氧化,必须在临用前配制。将四氧嘧啶用生理盐水溶解,配成2%的溶液。
步骤9、关于降血糖的阳性药的配制
取盐酸二甲双胍1片(500mg),加入生理盐水至0.4L,配置成浓度为12.5mg/ml。
步骤10、糖尿病模型的建立
步骤11、关于降血糖的动物分组及给药
选取造模成功的小鼠50只,按照血糖值均衡原则分为5个组,分别为模型组、阳性对照组(盐酸苯乙双胍组)木藤蓼提取物组。分组次日开始每天灌胃均按0.2ml/10g给相应的药物,空白对照组和模型对照组予以等体积蒸馏水,连续给药7天。末次给药后禁食不禁水12h,尾静脉取血测空腹血糖值。
步骤12、给药前后体重变化
记录造模后给药前的体重与给药后的体重变化。
步骤13、脏器系数的变化
给药后,处死小鼠,解剖,取其肝脏、肾脏、脾脏、胰腺,称重,并计算脏器系数。
步骤14、关于降血糖的统计学处理
采用计算机的统计软件spss16.0对实验数据进行分析,计量资料数据以()表示。
进一步,步骤10中所述糖尿病模型的建立,具体为:
取80只健康小鼠,雄性,体重18~22g。每天早上固定时间点空腹称重。适应性饲养3天后,禁食不进水12h。随机取8只作为空白对照组。其余小鼠腹腔注射四氧嘧啶100mg/Kg,连续给药2天;空白对照组腹腔注射等体积无菌注射用水。恢复饮食72h后称重,同时禁食不禁水12小时,尾静脉取血,用GA-3型血糖仪测血糖值,选取血糖>11.1mmol/L的小鼠作为造模成功的实验性糖尿病小鼠。
与现有技术相比,本发明的有益效果:
本发明的研究结果表明:
1、木藤蓼降尿酸的研究结果:与正常对照组比较,模型对照组小鼠SUA水平显著升高,表明建模成功。与模型对照组相比,别嘌醇组和木藤蓼高剂量组均可有效降低模型动物SUA水平且均具有极显著差异;
与正常对照组比较,模型对照组小鼠肝脏XOD水平有显著升高;木藤蓼三个剂量组对小鼠肝脏XOD水平均有降低,且随剂量增加,小鼠肝脏XOD水平有增加趋势;
2、植物提取物对糖尿病小鼠的降糖作用:四氧嘧啶诱发的糖尿病模型组小鼠的血糖值与空白对照组比较保持较高水平,有显著性差异,表明造模成功;木藤蓼组给药前后小鼠血糖值有显著性差异,表明木藤蓼提取物能降低四氧嘧啶所致糖尿病小鼠的血糖值。
3、植物提取物对糖尿病小鼠体重的影响:小鼠体重在不同组别下不同给药时间变化趋势不同,适应性喂养3d到造模时小鼠体重有明显上升。用药后7d,模型对照组和阳性对照组小鼠体重均下降,这与文献记录高血糖模型组和苯乙双胍组体重与空白对照减少且差异显著一致。木藤蓼组小鼠体重变化跟空白对照组相比没有差异性,表明原植物提取物能够有效地缓解糖尿病小鼠消廋症状,且不同提取物对缓解糖尿病小鼠消廋症状程度不同,但差异不大。
4、植物提取物对实验性糖尿病小鼠脏器系数的影响:四氧嘧啶可损伤小鼠肾脏、胰腺、脾脏等,这与文献报道的肝、肾毒性相一致;与模型对照组相比,阳性对照药(盐酸苯乙双胍片)对四氧嘧啶所致糖尿病小鼠的胰腺有明显损伤;木藤蓼的保护弱一些。
具体实施方式
下面结合具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
1植物降尿酸作用研究
1.1动物
KM小白鼠,SPF级,体重(20±2)g,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司,动物合格证号:SCXK(湘)2013-0004),饲养于青海民族大学药理实验室,环境温度22~26℃,相对湿度55%~65%。动物饮用纯净水动物饮用纯净水,饲料为实验鼠维持颗粒料,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司,生产证号:SCXK(湘)2014-0002),适应环境一周后进行实验,实验前禁食不禁水12h。
1.2药品
木藤蓼茎提取物冻干粉(4.1.2.1中处理备用),尿酸测定试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:20161107),黄嘌呤氧化酶(XOD)测试盒(南京建成生物工程研究所,批号:20161209),别嘌醇(上海信谊万象药业股份有限公司,批号:05160103),氧嗪酸钾(Sigma公司,批号STBF6610V)、灭菌注射用水(国药集团容生有限公司)。
1.3仪器
1.4方法
1.4.1供试品的制备
依据药材常用量2~6g,本试验以口服生药量6g作为成人(60kg)最大日用量,按照实验动物与人用药量的换算公式计算,得到小白鼠的用药量(1.2g/Kg)。设此为中剂量组,在此数据上加减分设高剂量和低剂量。即高剂量组(2.4g/Kg)、中剂量组(1.2g/Kg)、低剂量组(0.6g/Kg)。取木藤蓼冻干粉,均用0.5%CMC-Na溶液准确配置供试溶。
1.4.2造模剂的配制
精密称取氧嗪酸钾5g,研磨后加入0.5%CMC-Na溶液至0.4L,超声分散,配置成12.5mg/ml的氧嗪酸钾混悬液,临用前摇匀,使其均匀分散。
1.4.3阳性药的配制
取别嘌醇100mg(1片),研磨后加入0.5%CMC-Na溶液至0.4L,超声分散,配置成0.25mg/ml的混悬液,临用前摇匀,使其均匀分散。
1.4.4造模与给药
小鼠每组10只,随机分为12组,依次为空白对照组、模型对照组、别嘌醇组,木藤蓼高、中、低剂量组。分组后开始给药造高尿酸模型,除正常对照组给予等容积的溶媒,其余每组小鼠均给氧嗪酸钾(250mg/kg)制备高尿酸模型,造模1h后除正常对照组和模型对照组给与等溶剂的溶媒外,其余各组分别给于相应地治疗药物,以上给药方式均为灌胃给药,给药容积为0.2ml/10g,每日造模和给药各一次,持续给药7天。
1.2取材与检测
末次给药1h后眼眶取血,室温下自然凝血1h,3000rpm离心5min,分离得到血清。按尿酸测试剂盒说明书采用磷钨酸还原法测量血清尿酸(Serum Rric Acid,SUA)。
计算公式:
解剖取适量小鼠肝组织称重,加入9倍量的生理盐水,制备10%肝匀浆液,3000rpm离心10min,取上清液,按照黄嘌呤氧化酶检测试剂盒方法测定黄嘌呤氧化酶活性(Xanthine Oxidase,XOD)。计算公式:
其中黄嘌呤摩尔消光系数为12.6×10-3,光径为1cm,匀浆蛋白含量为227g/L,反应时间为20min,于530nm处测吸光度值。
1.3统计学处理
所得数据用SPSS 16.0软件分析,用表示。采用单因素方差分析进行组间显著性检验。
1.4结果
表1各组小鼠血清中SUA及肝组织中XOD检测结果(n=10)
注:与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
由表1可知,与正常对照组比较,模型对照组小鼠SUA水平显著升高,表明建模成功。与模型对照组相比,别嘌醇组和木藤蓼高剂量组均可有效降低模型动物SUA水平且均具有极显著差异;
与正常对照组比较,模型对照组小鼠肝脏XOD水平有显著升高;木藤蓼三个剂量组对小鼠肝脏XOD水平均有降低,且随剂量增加,小鼠肝脏XOD水平有增加趋势;
2植物降血糖作用研究
2.1材料
2.1.1动物
KM小白鼠,SPF级,体重(20±2)g,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司,动物合格证号:SCXK(湘)2013-0004,饲养于青海民族大学药理实验室,环境温度22~26℃,相对湿度55%~65%。动物饮用纯净水动物饮用纯净水,饲料为实验鼠维持颗粒料,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司,生产证号:SCXK(湘)2014-0002,适应环境一周后进行实验,实验前禁食不禁水12h。
2.1.2药品
木藤蓼茎提取物冻干粉。四氧嘧啶(上海原叶生物科技有限公司,批号S30381),葡萄糖注射液(规格20ml:10g河南科伦药业有限公司产品批号:E14072302),灭菌注射用水(规格2ml国药集团容生有限公司产品批号:13110629),盐酸二甲双胍片,(深圳市中联制药有限公司,产品批号:1612898。)
2.1.3仪器
2.2方法
2.2.1供试品的制备
依据药材常用量2~6g,本试验以口服生药量6g作为成人(60kg)最大日用量,按照实验动物与人用药量的换算公式计算,得到小白鼠的用药量(1.2g/Kg)。取木藤蓼冻干粉,均用蒸馏水溶解准确配置供试溶液。
2.2.2造模剂的配制
四氧嘧啶很容易氧化,必须在临用前配制。将四氧嘧啶用生理盐水溶解,配成2%的溶液。
2.2.3阳性药的配制
取盐酸二甲双胍1片(500mg),加入生理盐水至0.4L,配置成浓度为12.5mg/ml。
2.2.4糖尿病模型的建立
取80只健康小鼠,雄性,体重18~22g。每天早上固定时间点空腹称重。适应性饲养3天后,禁食不进水12h。随机取8只作为空白对照组。其余小鼠腹腔注射四氧嘧啶100mg/Kg,连续给药2天;空白对照组腹腔注射等体积无菌注射用水。恢复饮食72h后称重,同时禁食不禁水12小时,尾静脉取血,用GA-3型血糖仪测血糖值,选取血糖>11.1mmol/L的小鼠作为造模成功的实验性糖尿病小鼠。
2.2.5动物分组及给药
选取造模成功的小鼠50只,按照血糖值均衡原则分为5个组,分别为模型组、阳性对照组(盐酸苯乙双胍组)木藤蓼提取物组。分组次日开始每天灌胃均按0.2ml/10g给相应的药物,空白对照组和模型对照组予以等体积蒸馏水,连续给药7天。末次给药后禁食不禁水12h,尾静脉取血测空腹血糖值,结果见表2。
2.2.6给药前后体重变化
记录造模后给药前的体重与给药后的体重变化。结果见表3
2.2.7脏器系数的变化
给药后,处死小鼠,解剖,取其肝脏、肾脏、脾脏、胰腺,称重,并计算脏器系数,结果见表4。
2.2.8统计学处理
采用计算机的统计软件spss16.0对实验数据进行分析,计量资料数据以()表示。
2.3结果
2.3.1植物提取物对糖尿病小鼠的降糖作用
表2给药前后血糖测定结果(mmol/L)
注:与空白对照组比较,*P<0.05,与模型对照组比较,#P<0.05。
由表2可见,四氧嘧啶诱发的糖尿病模型组小鼠的血糖值与空白对照组比较保持较高水平,有显著性差异,表明造模成功;木藤蓼组给药前后小鼠血糖值有显著性差异,表明木藤蓼提取物能降低四氧嘧啶所致糖尿病小鼠的血糖值;
2.3.2植物提取物对糖尿病小鼠体重的影响
表3植物提取物对糖尿病小鼠体重的影响(n=8)
注:与空白对照组比较,*P<0.05,与模型对照组比较,#P<0.05。
由表3可见,小鼠体重在不同组别下不同给药时间变化趋势不同,适应性喂养3d到造模时小鼠体重有明显上升。用药后7d,模型对照组和阳性对照组小鼠体重均下降,这与文献记录高血糖模型组和苯乙双胍组体重与空白对照减少且差异显著一致。木藤蓼组小鼠体重变化跟空白对照组相比没有差异性,表明原植物提取物能够有效地缓解糖尿病小鼠消廋症状,且不同提取物对缓解糖尿病小鼠消廋症状程度不同,但差异不大。
2.3.3植物提取物对实验性糖尿病小鼠脏器系数的影响
表4对小鼠脏器系数的影响
注:与空白对照组比较,*P<0.05,与模型对照组比较,#P<0.05。
由表4可以看出,四氧嘧啶可损伤小鼠肾脏、胰腺、脾脏等,这与文献报道的肝、肾毒性相一致;与模型对照组相比,阳性对照药(盐酸苯乙双胍片)对四氧嘧啶所致糖尿病小鼠的胰腺有明显损伤;木藤蓼的保护弱一些。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,本发明的保护范围不限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内,可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (2)
1.一种木藤蓼降尿酸降血糖作用的研究方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1、关于降尿酸的供试品的制备
依据药材常用量2~6g,本试验以口服生药量6g作为成人60kg最大日用量,按照实验动物与人用药量的换算公式计算,得到小白鼠的用药量1.2g/Kg;设此为中剂量组,在此数据上加减分设高剂量和低剂量;即高剂量组2.4g/Kg、中剂量组1.2g/Kg、低剂量组0.6g/Kg;取木藤蓼冻干粉,均用0.5%CMC-Na溶液准确配置供试溶;
步骤2、关于降尿酸的造模剂的配制
精密称取氧嗪酸钾5g,研磨后加入0.5%CMC-Na溶液至0.4L,超声分散,配置成12.5mg/ml的氧嗪酸钾混悬液,临用前摇匀,使其均匀分散;
步骤3、关于降尿酸的阳性药的配制
取别嘌醇100mg1片,研磨后加入0.5%CMC-Na溶液至0.4L,超声分散,配置成0.25mg/ml的混悬液,临用前摇匀,使其均匀分散;
步骤4、关于降尿酸的造模与给药
小鼠每组10只,随机分为12组,依次为空白对照组、模型对照组、别嘌醇组,木藤蓼高、中、低剂量组;分组后开始给药造高尿酸模型,除正常对照组给予等容积的溶媒,其余每组小鼠均给氧嗪酸钾250mg/kg制备高尿酸模型,造模1h后除正常对照组和模型对照组给与等溶剂的溶媒外,其余各组分别给于相应地治疗药物,以上给药方式均为灌胃给药,给药容积为0.2ml/10g,每日造模和给药各一次,持续给药7天;
步骤5、关于降尿酸的取材与检测
末次给药1h后眼眶取血,室温下自然凝血1h,3000rpm离心5min,分离得到血清;按尿酸测试剂盒说明书采用磷钨酸还原法测量血清尿酸Serum Rric Acid,SUA;
计算公式:
其中标准品浓度50mg/L
解剖取适量小鼠肝组织称重,加入9倍量的生理盐水,制备10%肝匀浆液,3 000rpm离心10min,取上清液,按照黄嘌呤氧化酶检测试剂盒方法测定黄嘌呤氧化酶活性XanthineOxidase,XOD;计算公式:
其中黄嘌呤摩尔消光系数为12.6×10-3,光径为1cm,匀浆蛋白含量为227g/L,反应时间为20min,于530nm处测吸光度值;
步骤6、关于降尿酸的统计学处理
所得数据用SPSS 16.0软件分析,用表示;采用单因素方差分析进行组间显著性检验;
步骤7、关于降血糖的供试品的制备
依据药材常用量2~6g,本试验以口服生药量6g作为成人60kg最大日用量,按照实验动物与人用药量的换算公式计算,得到小白鼠的用药量1.2g/Kg;取木藤蓼冻干粉,均用蒸馏水溶解准确配置供试溶液;
步骤8、关于降血糖的造模剂的配制
四氧嘧啶很容易氧化,必须在临用前配制;将四氧嘧啶用生理盐水溶解,配成2%的溶液;
步骤9、关于降血糖的阳性药的配制
取盐酸二甲双胍1片500mg,加入生理盐水至0.4L,配置成浓度为12.5mg/ml;
步骤10、糖尿病模型的建立
步骤11、关于降血糖的动物分组及给药
选取造模成功的小鼠50只,按照血糖值均衡原则分为5个组,分别为模型组、阳性对照组盐酸苯乙双胍组木藤蓼提取物组;分组次日开始每天灌胃均按0.2ml/10g给相应的药物,空白对照组和模型对照组予以等体积蒸馏水,连续给药7天;末次给药后禁食不禁水12h,尾静脉取血测空腹血糖值;
步骤12、给药前后体重变化
记录造模后给药前的体重与给药后的体重变化;
步骤13、脏器系数的变化
给药后,处死小鼠,解剖,取其肝脏、肾脏、脾脏、胰腺,称重,并计算脏器系数;
步骤14、关于降血糖的统计学处理
采用计算机的统计软件spss16.0对实验数据进行分析,计量资料数据以表示。
2.根据权利要求1所述的木藤蓼降尿酸降血糖作用的研究方法,其特征在于,步骤10中所述糖尿病模型的建立,具体为:
取80只健康小鼠,雄性,体重18~22g;每天早上固定时间点空腹称重;适应性饲养3天后,禁食不进水12h;随机取8只作为空白对照组;其余小鼠腹腔注射四氧嘧啶100mg/Kg,连续给药2天;空白对照组腹腔注射等体积无菌注射用水;恢复饮食72h后称重,同时禁食不禁水12小时,尾静脉取血,用GA-3型血糖仪测血糖值,选取血糖>11.1mmol/L的小鼠作为造模成功的实验性糖尿病小鼠。
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