CN107460253B - 一种与HIV-1新发感染相关的血浆miRNA标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与HIV‑1新发感染相关的血浆miRNA标志物，具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。同时，发明人还设计并制备了血浆miRNA标志物hsa‑miR‑3162‑3p的引物或探针。由于HIV‑1既往感染者血浆中hsa‑miR‑3162‑3p表达量较新发感染者明确下降，应用本发明能够有效区分HIV‑1感染者为HIV‑1新发感染还是既往感染，具有巨大价值。据此，发明人还制备了相应诊断试剂盒并建立了相应检查方法，以用于检测血浆中的hsa‑miR‑3162‑3p，而且该法只涉及real‑time PCR检测这一常用方法，易于掌握，操作快速，根据PCR的CT值计算hsa‑miR‑3162‑3p相对表达量即可判断检测对象是否为新发感染病例。

Description

一种与HIV-1新发感染相关的血浆miRNA标志物及其应用
技术领域
本发明属于艾滋病检测技术领域，尤其涉及一种与HIV-1新发感染相关的血浆miRNA标志物及其应用。
背景技术
艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)从20世纪80年代开始肆虐全球，已经成为危害人类健康的重大公共卫生问题。据联合国艾滋病规划署(UNAIDS)报告，截至2015年底，有3670万存活的艾滋病病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)感染者，仅2015年新报告HIV感染病例数达210万。
通常评估某地HIV疫情情况时，卫生部门采用当地当年HIV新发病例数作为一个指标。故结合文献报道及实际应用，对HIV新发感染病例的定义即为估计感染时长(估计被感染的时间至抽血采样时的时间间隔)不超过1年(365天)的病例。确定某段时间某地区的HIV新发感染情况，有利于评价当地的HIV疫情情况及判断某项干预措施的有效性。目前在全世界范围内应用最为广泛的判断新发感染的实验方法主要为BED检测，其在许多国家的艾滋病疫情检测中发挥着重要作用。BED检测是通过测定HIV-1特异性IgG占总IgG抗体的比例，确定是否新发感染。然而，BED检测严格限制于人群新发感染率的估计，结果不能反馈给个人或其监护人及监管场所。
microRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度在22nt左右的单链非编码RNA，其能够在转录后水平调控基因表达情况。目前已知，部分发现的miRNA能够通过特定途径对多种疾病的发生发展具有一定的调控作用。其能够起到调控作用的原理在于通过miRNA表达量的增加或者减少来调控其目标mRNA(messenger RNA)的表达，进而影响某些蛋白的表达及其功能的改变。因此，某些miRNA在体内表达量的变化可以作为某些疾病发生发展的预测指标。miRNA存在于多种样本中，包括PBMCs、血浆、血清、尿液、脑脊液等等。其中血浆miRNA具有高稳定性，使其更加适合作为疾病发生发展的生物标记物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种与HIV-1新发感染相关的血浆miRNA标志物及其应用，以便于建立针对个人判断HIV-1新发感染的实验方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：与HIV-1新发感染相关的血浆miRNA标志物，具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。
与HIV-1新发感染相关的血浆miRNA标志物为hsa-miR-3162-3p。
以上述与HIV-1新发感染相关的血浆miRNA标志物为目标设计的引物或探针。
探针为美国应用生物系统公司Assay ID：478814_mir。
血浆miRNA标志物在制备HIV-1新发感染诊断试剂盒中的应用。
引物或探针在制备HIV-1新发感染诊断试剂盒中的应用。
HIV-1新发感染诊断试剂盒包括以血浆miRNA标志物hsa-miR-3162-3p为目标的引物或探针。
针对BED检测不能反馈给个人或其监护人及监管场所的问题，发明人经深入研究发现了一种与HIV-1新发感染相关的血浆miRNA标志物，具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。发明人首次利用血浆中差异表达的血浆miRNA标志物hsa-miR-3162-3p的表达量来判断HIV-1新发感染，为建立针对个人判断HIV-1新发感染的实验方法提供了依据。同时，发明人还设计并制备了血浆miRNA标志物hsa-miR-3162-3p的引物或探针。由于HIV-1既往感染者血浆中hsa-miR-3162-3p表达量较新发感染者明确下降，应用本发明能够有效区分HIV-1感染者为HIV-1新发感染还是既往感染，具有巨大价值。据此，发明人还制备了相应诊断试剂盒并建立了相应检查方法，以用于检测血浆中的hsa-miR-3162-3p，而且该法只涉及real-time PCR检测这一常用方法，易于掌握，操作快速，根据PCR的CT值计算hsa-miR-3162-3p相对表达量即可判断检测对象是否为新发感染病例。
附图说明
图1是MT2未染毒细胞。
图2是MT2细胞被HIV-1 IIIB病毒感染后1天的细胞状态。
图3是MT2细胞被HIV-1 IIIB病毒感染后2天的细胞状态。
图4是MT2细胞被HIV-1 IIIB病毒感染后4天的细胞状态。
图5是MT2细胞被HIV-1 IIIB病毒感染后8天的细胞状态。
图6是hsa-miR-3162-3p在MT2-HIV-1 IIIB感染模型中的培养上清中的表达量与培养时间的关系。
图7是hsa-miR-3162-3p在不同HIV-1感染情况的研究对象血浆中的相对表达量。
图8是血浆hsa-miR-3162-3p检测人群HIV-1新发感染的检测受试者工作特征曲线(ROC)。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用到的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置两次重复实验，结果取平均值。使用的单独引物或探针可以通过商业渠道购买获得，也可以在了解此miRNA序列之后由技术人员自行设计合成。
试验材料如下：
人血浆：从健康人或HIV-1感染者外周血中分离出。
ath-miR-159a：上海吉玛制药技术有限公司合成。
RNA提取试剂盒：美国生命科技公司(Life Technologies Corporation)，Cat No：AM1556。
逆转录试剂盒：美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Inc.，ABI)，CatNo：A28007。
miRNA探针：Assay ID：478814mir，美国应用生物系统公司(Applied BiosystemsInc.，ABI)合成。
荧光定量Mix：美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Inc.，ABI)，Cat No：4444554。
荧光定量PCR仪：购自美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Inc.，ABI)，Cat No：4376598。
实施例1 miRNA探针合成
由美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Inc.，ABI)合成hsa-miR-3162-3p和ath-miR-159a对应的检测探针，目标序列分别为5’-UCCCUACCCCUCCACUCCCCA-3’(SEQ.ID.No.2)和5’-UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA-3’(SEQ.ID.No.3)。
实施例2 建立MT2-HIV-1 IIIB病毒感染模型
(1)MT2细胞复苏后，用10％FBS-RPMI-1640培养液培养至第三代。
(2)对MT2细胞进行计数，后将细胞重悬至1*106cells/2ml的浓度，分两瓶装，每瓶不少于16ml。
(3)用HIV-IIIB病毒培养上清，以100μl/8*106cells的浓度对其中一瓶MT2细胞进行染毒，混匀后移至12孔板，每孔2ml细胞悬液(约1*106cells)，种4孔，放入C02细胞培养箱进行培养，CO2浓度5％，温度37℃。
(4)未染毒的MT2细胞悬液混匀后也移至12孔板，每孔2ml细胞悬液(约1*106cells)，种4孔，放入CO2细胞培养箱进行培养，C02浓度5％，温度37℃。
实施例3 MT2-HIV-1 IIIB病毒感染模型细胞培养上清液miRNA提取
(1)分别在种板后第1、2、4、8天的种板时间点收集一孔染毒和一孔不染毒MT2细胞培养上清液至1.5ml EP管中，1600rpm/min离心6分钟后取上层300μl培养上清备用。图1-5分别为不染毒、染毒后第1天、第2天、第4天、第8天的MT2细胞状态。
(2)每300μl培养上清中加入2μl(约2.5*107copies)ath-miR-159a作为外部参照物，根据RNA提取试剂盒说明书提取血浆中的总RNA。
实施例4 人血浆样本miRNA提取
(1)经对象同意后，用含EDTA-K2抗凝剂的真空采血管采集其外周血10ml，800g/min，常温离心8分钟。
(2)离心后将上层血浆移至1.5mlEP管中备用。
(3)取300μl血浆，加入2μl(约2.5*107copies)ath-miR-159a作为外部参照物，根据RNA提取试剂盒说明书提取血浆中的总RNA。
实施例5 miRNA表达量测定
(1)按照逆转录试剂盒说明书对提取出的miRNA进行逆转录，合成cDNA模板。
(2)用DNase/RNase-Free Deionized Water按1∶10比例稀释cDNA模板。
按下表1比例配制单孔PCR反应液(冰上操作，每样品设立重复孔)。
表1 PCR反应液
Figure BDA0001423999480000041
(1)PCR扩增条件：95℃ 20s酶活化，95℃ 1s变性，60℃ 20s退火及延伸，再重复95℃ 1s变性及60℃ 20s退火及延伸循环，共40个循环。
(2)采用实时荧光定量PCR分析程序分析CT值，取平均值，然后计算同一样品其相应ΔCT值，各hsa-miR-3162-3p的CT值减去外参ath-miR-159a的CT值即为ΔCT。MT2-HIV-1IIIB病毒感染模型中，染毒细胞培养上清的ΔCT减去同一时点未染毒细胞培养上清的ΔCT即为ΔΔCT，以2-ΔΔCT表示各时间点染毒MT2细胞培养上清的待测miRNA的相对表达量，hsa-miR-3162-3p在MT2-HIV-1 IIIB病毒感染模型的培养上清中的表达随培养时间延长而减少，见图6。利用Pearson相关性分析发现，hsa-miR-3162-3p表达水平与HIV染毒后培养时间具有明显相关性(r＝-0.9984，p＝0.0016)。
(3)hsa-miR-3162-3p在人群HIV-1新发感染组和既往感染组的相对表达量见图7。血浆hsa-miR-3162-3p检测人群HIV-1新发感染的检测受试者工作特征曲线(ROC)见图8。人群样本以2-ΔCT表示各对象待测miRNA的相对表达量，根据2-ΔCT值判定结果，当2-ΔCT＞0.916时，待测样品为HIV-1新发感染；当2-ΔCT≤0.916时为既往感染(灵敏度＝100.00％，特异度＝71.43％)。结果见表2。
表2.各组样品的hsa-miR-3162-3p的2-ΔCT值及hsa-miR3162-3p判断新发感染的灵敏度及特异度
Figure BDA0001423999480000051
注：灵敏度(％)＝根据hsa-miR-3162-3p判断为新发感染样品/实际为新发感染样品*100％，特异度＝根据hsa-miR-3162-3p判断为非新发感染样品/实际为非新发感染样品*100％。
序列表
<110> 广西医科大学
<120> 一种与HIV-1新发感染相关的血浆miRNA标志物及其应用
<130> YLH2017103
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 82
<212> DNA/RNA
<213> HIV-1(HIV-1)
<400> 1
ctgacttttt tagggagtag aagggtgggg agcatgaaca atgtttctca ctccctaccc 60
ctccactccc caaaaaagtc ag 82
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ucccuacccc uccacucccc a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uuuggauuga agggagcucu a 21

Claims (2)

1.与HIV-1新发感染相关的血浆miRNA标志物在制备HIV-1新发感染诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述血浆miRNA标志物为hsa-miR-3162-3p，它具有序列表SEQ.ID.No.2的碱基序列。
2.引物或探针在制备HIV-1新发感染诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述引物或探针是以与HIV-1新发感染相关的血浆miRNA标志物为目标设计，所述血浆miRNA标志物为hsa-miR-3162-3p，它具有序列表SEQ.ID.No.2的碱基序列。
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Homo sapiens microRNA 3162 (MIR3162), microRNA, NR_036120.1;Kozomara A;《NCBI Genbank》;20110624;序列 *
MiR-3162-3p Is a Novel MicroRNA That Exacerbates Asthma by Regulating β-Catenin;Chao Fang;《PLOS One》;20160309;第11卷(第3期);e0149257 *

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