CN107447020B - 一种梅花鹿个体识别的分子标签、识别方法及应用 - Google Patents

一种梅花鹿个体识别的分子标签、识别方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种梅花鹿个体识别分子标签，包括24个SNP，其序列分别如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.24所示。本发明还公开了一种梅花鹿个体识别标签的识别方法和应用。本发明首次发现SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.24所示的分子标记，可以很好的标记目前梅花鹿个体，理论上可以标识324只不同基因型的梅花鹿，足以满足目前养殖梅花鹿数量，为今后鹿产品追溯提供技术保证。

Description

一种梅花鹿个体识别的分子标签、识别方法及应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种梅花鹿个体识别的分子标签、识别方法及应用。
背景技术
鹿是我国传统的名贵药用动物，汉代时就有“鹿身百宝”的说法，是灵丹妙药的象征。《本草纲目》记载鹿茸、鹿角、鹿角胶、鹿角霜、鹿血、鹿脑、鹿尾、鹿肾、鹿筋、鹿脂、鹿肉、鹿头肉、鹿骨、鹿齿、鹿髓等都可入药，有极高的药用价值和保健功效，能够预防和治疗多种疾病。而鹿的初生幼角——鹿茸更是被视作“宝中之宝”。
目前，市场上鹿产品假货泛滥，如果能引入鹿产品原材料追溯系统，即使产品出现假货问题，厂家也能快速找出原因。然而，鹿产品还无法进行产品追踪，购买假的鹿产品的消费者利益往往得不到保证。另外，梅花鹿种公鹿价格昂贵，1头好的种公鹿能卖到100万。养殖种公鹿目的主要用于配种，出售其昂贵的生殖细胞(精液)。然后，这种产品无法进行跟踪和标识，导致很多不法分子对其进行更换。
因此，非常有必要在DNA水平上进行梅花鹿个体身份的识别，发明一种梅花鹿个体识别标签势在必行。通过开发一种在DNA分子水平上的梅花鹿个体识别标签，有助于我们对鹿产品进行跟踪，保证消费者利益。
发明内容
本发明提供的一种梅花鹿个体识别的分子标签、识别方法及应用，能够识别标记不同的梅花鹿个体，有助于对鹿产品进行跟踪，保证消费者利益。
本发明的第一个目的是提供梅花鹿个体识别的分子标签，包括24个SNP，其序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24所示。
本发明的第二个目的是提供一种利用上述分子标签识别梅花鹿个体的方法，包括以下步骤：
S1，提取待鉴定材料基因组DNA；
S2，分别利用SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24各自对应的引物进行PCR扩增，分别得到24组扩增产物；
其中，获得SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24的分子标记所对应使用的引物序列分别如SEQ ID NO.25-SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27-SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29-SEQ IDNO.30、SEQ ID NO.31-SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33-SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35-SEQ IDNO.36、SEQ ID NO.37-SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39-SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41-SEQ IDNO.42、SEQ ID NO.43-SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45-SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47-SEQ IDNO.48、SEQ ID NO.49-SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51-SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53-SEQ IDNO.54、SEQ ID NO.55-SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57-SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59-SEQ IDNO.60、SEQ ID NO.61-SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63-SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65-SEQ IDNO.66、SEQ ID NO.67-SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69-SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71-SEQ IDNO.72所示；
(1)PCR扩增体系为10μL：包括DNA0.2μL、正向引物0.5μL、反向引物0.5μL；2×TapPCR Master Mix 5.0μL；ddH2O 3.8μL；
(2)PCR扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸45s；循环35次；72℃终延伸10min，4℃冷却10min；
24组扩增产物分别在2％琼脂糖凝胶上100V电泳35min，并于凝胶成像系统下观察，分别回收24组扩增产物；
S3，测序鉴定
分别测序鉴定24组扩增产物核苷酸序列，根据相应SNP位点的基因型确定待测样品的24位的数字串，相应的SNP位点如果为其中一种纯合子基因型，则定义为0；如果是另一种纯合子基因型，则定义为1；如果为杂合子，则定义为2；从而每个待测样品分别产生一个24位的数字串，所述24位的数字串即为识别该待测样品的分子标签，从而完成对梅花鹿个体的识别。
本发明的第三个目的是提供一种上述梅花鹿个体识别的分子标签在梅花鹿个体产品流通路径跟踪或标识中的应用。
与现有技术相比，本发明提供的一种梅花鹿个体识别标签、识别方法及应用，具有以下有益效果：
目前，市场上鹿产品假货泛滥，如果能引入鹿产品原材料追溯系统，即使产品出现假货问题，厂家也能快速找出原因。因此，非常有必要在DNA水平上进行梅花鹿个体身份的识别，发明一种梅花鹿个体识别标签势在必行。本发明首次发现SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.24所示的SNP分子标记，可以很好的对梅花鹿个体进行识别标记，理论上可以标识324只不同基因型的梅花鹿，足以满足目前养殖梅花鹿数量，为今后鹿产品追溯提供技术保证。这些个体识别标签在梅花鹿个体产品流通路径跟踪或标识中具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明提供的一种梅花鹿个体识别的分子标签，包括24个SNP，其序列分别如SEQID NO.1-SEQ ID NO.24所示。其中“[]”内的两个碱基表示SNP位点，若待测样品的基因型为与“/”前碱基相同的纯合子，则定义为0；若待测样品的基因型为与“/”后碱基相同的纯合子，则定义为1；若待测样品的基因型为“[]”内两个碱基的杂合子，则定义为2，从而每只梅花鹿个体可分别产生一个24位的数字串，所述24位的数字串即为识别该梅花鹿个体的识别标签，24个SNP共计可产生324个24位的识别标签。
一、24个SNP的获得：
S1，分别提取待测100个梅花鹿个体的基因组DNA。
S2，通过简化基因组测序(dd-RADseq)的Reads在参考基因组上的定位结果，利用GATK软件进行局部重比对(Local Realignment)和变异检测，同时采用STACKS软件进行变异检测，取GATK软件和STACKS软件两种方法得到的交集变异位点等步骤，以保证检测得到的SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)的准确性，通过大样本检测梅花鹿、马鹿和杂交鹿基因组上的物种特异SNP位点，同时检测SNP位点的连锁情况，最终共计筛选出在参考基因组上距离相差远而不易发生连锁的24个SNP作为鉴定杂交茸的候选位点。
S3，不同梅花鹿个体的SNP分析
对梅花鹿纯合子基因型一、梅花鹿纯合子基因型二、梅花鹿杂合子的SNP基因型如表1所示。
表1不同鹿茸品种的SNP分析
Figure BDA0001401417010000051
Figure BDA0001401417010000061
二、利用上述SNP分子标签的识别梅花鹿个体的方法，具体步骤如下：
S1、利用CTAB法提取待鉴定材料基因组DNA，4℃冰箱保存备用。
使用时，用0.8％的琼脂糖检测DNA的浓度，稀释到工作浓度用于PCR扩增。
S2、分别利用SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24各自对应的引物进行PCR扩增，分别得到24组扩增产物。其中，获得SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24的分子标记所对应使用的引物序列分别如SEQ ID NO.25-SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27-SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29-SEQ IDNO.30、SEQ ID NO.31-SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33-SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35-SEQ IDNO.36、SEQ ID NO.37-SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39-SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41-SEQ IDNO.42、SEQ ID NO.43-SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45-SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47-SEQ IDNO.48、SEQ ID NO.49-SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51-SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53-SEQ IDNO.54、SEQ ID NO.55-SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57-SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59-SEQ IDNO.60、SEQ ID NO.61-SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63-SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65-SEQ IDNO.66、SEQ ID NO.67-SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69-SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71-SEQ IDNO.72所示；具体如表2所示。
需要说明的是，利用个表2中的引物扩增得到的16组扩增产物片段在300-800bp之间，SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24对应的101bp的序列是鹿的特征序列，包含在扩增产物片段之内，序列比对的时候将扩增产物分别与相应的，SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24分子标记相对比即可。
表2不同分子标记的引物序列
Figure BDA0001401417010000071
Figure BDA0001401417010000081
Figure BDA0001401417010000091
(1)PCR扩增体系为10μL：包括DNA0.2μL(1ng/μL)、正向引物0.5μL、反向引物0.5μL；2×Tap PCR Master Mix(带染料，康为世纪公司购买)5.0μL；ddH2O 3.8μL。
其中上述引物的浓度均为4pmol/μL。
(2)PCR扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸45s；循环35次；72℃终延伸10min，4℃冷却10min。
24组扩增产物分别在2％琼脂糖凝胶上100V电泳35min，并于凝胶成像系统下观察，分别回收24组101bp的扩增产物。
S3、测序鉴定
分别测序鉴定上述24组扩增产物核苷酸序列，根据相应SNP位点的基因型确定待测样品的24位的数字串，相应的SNP位点如果为其中一种纯合子基因型，则定义为0；如果是另一种纯合子基因型，则定义为1；如果为杂合子，则定义为2；从而每个待测样品分别产生一个24位的数字串，所述24位的数字串即为识别该待测样品的分子标签，从而完成对梅花鹿个体的识别。
根据相应SNP位点的基因型确定待测样品的24位的数字串，获得该待测样品的分子标签，由于每个梅花鹿个体的分子标签是固定不变的，因此，可根据该分子标签对梅花鹿个体产品流通路径跟踪或标识。24个SNP理论上可以标识324只不同基因型的梅花鹿，足以满足目前养殖梅花鹿数量，为今后鹿产品追溯提供技术保证。
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与上述实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<120> 一种梅花鹿个体识别的分子标签、识别方法及应用
<160> 72
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 101
<212> DNA
<213> 鹿
<400> 1
tctaaaagca gaggctcctc tctgcaggaa tgtgtgtggg tgattcatgc [c/t]gagtcatct 60
ctgggaactg agggggagcc cctcagcatg ggggagcata t 101
<210> 2
<211> 101
<212> DNA
<213> 鹿
<400> 2
cgtgcatgtg tcatcatgac caagccacct tgaaaaagat tacttttaag [c/a]tttccataa 60
gtcatcccca agtcaacgct gatggggccc ccttctctgt c 101
<210> 3
<211> 101
<212> DNA
<213> 鹿
<400> 3
caaacgggca gcagcagctg cagtggagtc tgggaccctt ttcatcaacc [a/t]ctgaggcac 60
ccacattcca gttccacagc ccttcacccc atcagcagag c 101
<210> 4
<211> 101
<212> DNA
<213> 鹿
<400> 4
ctttcttgca ccattaattt ttcctgctgc agacattgac cggattctcc [a/g]tgccggctt 60
tactttgcag gaagctcttg gggctttgca tcgagttggt g 101
<210> 5
<211> 101
<212> DNA
<213> 鹿
<400> 5
cttcaattca tcctcaaagt gtaagtcata tactgttgtt ggagaaaata [t/c]aaaagctat 60
gtgaggttct aatcatctat aactcagctc ttcctaaaag c 101
<210> 6
<211> 101
<212> DNA
<213> 鹿
<400> 6
aatgtcactc aaacgagcat tagaaatctt ggtacttgtg caagacacca [g/a]atctgtcat 60
attcgcatgc ctaacctgta agttgaagca ggaaataaat c 101
<210> 7
<211> 101
<212> DNA
<213> 鹿
<400> 7
tggtgattct gatttccaac catgcttact tcatttcttg cagttccaaa [c/t]ttatttatt 60
ttgaaatgat agtattactt cggccttcac tggcttaggt a 101
<210> 8
<211> 101
<212> DNA
<213> 鹿
<400> 8
ctttttctga ttataatgaa aagttcaaaa cttcaaaagt ggctttaaaa [a/g]ggacagatg 60
cttgagtgct tgcttcaccc ctgtgcactg gcaagtgtga g 101
<210> 9
<211> 101
<212> DNA
<213> 鹿
<400> 9
caaaaataaa atgtcttaac aatatatgtt aaatagcttt aatatataaa [g/a]tactcttca 60
aaaccaacaa gaaaataaga taataaatca gttatactgt g 101
<210> 10
<211> 101
<212> DNA
<213> 鹿
<400> 10
acgacctcag agataacttc tgatgtctgt attctgcatt tccactgaag [t/g]agtgagtat 60
agcacagatt tctttgacaa agaccatgct gtacactggg a 101
<210> 11
<211> 101
<212> DNA
<213> 鹿
<400> 11
attgtactta ttgtgtgctt tatttttatt attattgtgt tgagatataa [g/t]gaaataatt 60
gtattaattg caacttatga taatgcagaa tcaatggaac c 101
<210> 12
<211> 101
<212> DNA
<213> 鹿
<400> 12
tcggctatat aaaaaaagac aatagtggct ttcagttata aaattcaaca [g/a]aattcagtt 60
agcaaccttt tttttccaaa caaataaaca ggccaatcag a 101
<210> 13
<211> 101
<212> DNA
<213> 鹿
<400> 13
ctgcagacgg gaactcgagc gtcggcgcag acggtggctg ccggcctgac [c/t]taggtcaga 60
cccccgcagg gctgtgtaca cagacagaag cgtcctgggg c 101
<210> 14
<211> 101
<212> DNA
<213> 鹿
<400> 14
atttatgatt ggtaggaggg atgaaactgt aatttggcat atagcatgag [a/g]tgctatgac 60
atattaggta tatagttagc aattgtacat aaatgatata t 101
<210> 15
<211> 101
<212> DNA
<213> 鹿
<400> 15
gcccacagct gcagcgctgt tttcaagtga gggtgggagt ggaggggaaa [a/c]gtaggaact 60
gtgctcagag ttgtcttgtt cttttgagct tagaaaggca t 101
<210> 16
<211> 101
<212> DNA
<213> 鹿
<400> 16
aggtcaccat ccctttggca attgacaagg agagtgactt aggtggcagc [c/a]gtgatgcac 60
tgatactttt atgcagacct tcctcatgta tttgtaacta a 101
<210> 17
<211> 101
<212> DNA
<213> 鹿
<400> 17
tctctctttt ctgttatttt atttccaact gcaggtgttc tcctttgcca [c/t]agtccctgt 60
tattttcttt tcagttgact ttgagagaaa ttatgaagtc a 101
<210> 18
<211> 101
<212> DNA
<213> 鹿
<400> 18
ccggcgcctc tggagtggct ctacctcagg gcctcagggg cagttctcaa [t/c]ggacccggt 60
gggaaaccag tagggaaacg gaggccttcc caaacacaga a 101
<210> 19
<211> 101
<212> DNA
<213> 鹿
<400> 19
taaggtttcc ttccccctgt acacgcgatg tcctgcaggt tactttctcc [a/g]gctctttgg 60
cacctatctt tgctttagag gccctcctct agtgtctggt g 101
<210> 20
<211> 101
<212> DNA
<213> 鹿
<400> 20
tgattcctta gaagcttact taaaatatga gagaactttt tgagaaaaca [g/a]acaaacgaa 60
aaagaactgc tctttccagt tatcctcaca ttgtgctgtc a 101
<210> 21
<211> 101
<212> DNA
<213> 鹿
<400> 21
atggctttat gctcacaccc atcaccatga cctttccctt ctgcagatcc [t/c]gggagatcc 60
atcacttctt ctgtgaggtc cctgctgtaa tgaagctctc c 101
<210> 22
<211> 101
<212> DNA
<213> 鹿
<400> 22
taggggacag gaccttcatc ctaactcctc tggacactat gagaagtctc [a/g]gtcttgcac 60
ctgacaccac tgcaccatct ctggattatg ccctggtgag t 101
<210> 23
<211> 101
<212> DNA
<213> 鹿
<400> 23
ccataggtga ccaggagagg gctgtcggcc cctgggactg aggttcgagg [g/a]gggggttta 60
gttccgagag acgtggagaa gaataagata cagggacagc g 101
<210> 24
<211> 101
<212> DNA
<213> 鹿
<400> 24
taccttccat ttctagcaga gatactctgt caagtcagtc gctgttattc [c/a]ggtaatatc 60
ttcactgaat tccaattaca ctaatttttt cactctcaga t 101
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gagtgtgtgg accttgaggt ca 22
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
tgaggtccct tgccaggc 18
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tggcgcctgg aacgcgcgtg 20
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
gttcttcagg aggcctcaa 19
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
aaagagaaga gggcaggagc acg 23
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
cgagcccaca gtaagcgc 18
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
ctctttccct cctgccacac tc 22
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
cactgagatg cacagcccc 19
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
gcctggtcac cacgcagcc 19
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
caagacagaa cagtgagatc 20
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
cttggtcagt tccagaga 18
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
acctgtgacc ttggtataa 19
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
acctgtgacc ttggtataa 19
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
gagaaactgt cttatttgc 19
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
ttaatcagat caaattggga cgag 24
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
gtgtgtgctc aatccagg 18
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
gtcctgccgg tgacccccag cc 22
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
ccgggactca ctacctccat a 21
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
atgcaacttg tgaggcttaa a 21
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
gcaaaaggag gcataacac 19
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
cttgacaact acattctgct ga 22
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
ctactcaaga gagtgaaagc 20
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
taggaatggt gacatcctaa t 21
<210> 48
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
ctcacagctg gggagag 17
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
aatggcctct gccagctcct gga 23
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
aaatcttttt aaataatgc 19
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
ctgagtccct ttcccaagga 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
gaattgtaat ctcaggtata 20
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
caatctaaga ttcactgcag g 21
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
ataggcagtg agtgcagatg 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
caagtatagc acgcgcttgc 20
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
tgaggttgca agggccggc 19
<210> 57
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
cgtgagggca gcagacctgc cgga 24
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
agctatctct cttctatgtc 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
ctggagataa ccagagagcg 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
ggtagcggta ttatcggctg 20
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
tctacatgaa gggtctcctc g 21
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
cgctcttcca gggaccatc 19
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
gtgaggacct gtgttcctac g 21
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
tttcatttct gcagcaaaca 20
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
aggccctcct ggggaacaag cc 22
<210> 66
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
gggaagcagt gactcactc 19
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
ccttatttcg gtcagggcat c 21
<210> 68
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
tcagggtccc tctcacata 19
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
ttattcgaat aggagacctt a 21
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
tagtgtgtaa tgtggatgag 20
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
gaagctgcag gatttttaag aag 23
<210> 72
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
gccctgaaat gatgggcagc cg 22

Claims (1)

1.一种梅花鹿个体识别的分子标签在识别梅花鹿个体中的应用，其特征在于，包括24个SNP，其序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24所示；所述应用具体如下：S1，提取待鉴定材料基因组DNA；
S2，分别利用SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24各自对应的引物进行PCR扩增，分别得到24组扩增产物；
其中，获得SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24的分子标记所对应使用的引物序列分别如SEQID NO.25-SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27-SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29-SEQ ID NO.30、SEQID NO.31-SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33-SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35-SEQ ID NO.36、SEQID NO.37-SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39-SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41-SEQ ID NO.42、SEQID NO.43-SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45-SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47-SEQ ID NO.48、SEQID NO.49-SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51-SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53-SEQ ID NO.54、SEQID NO.55-SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57-SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59-SEQ ID NO.60、SEQID NO.61-SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63-SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65-SEQ ID NO.66、SEQID NO.67-SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69-SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71-SEQ ID NO.72所示；
(1)PCR扩增体系为10μL：包括DNA 0.2μL、正向引物0.5μL、反向引物0.5μL；2×Tap PCRMaster Mix 5.0μL；ddH2O 3.8μL；
(2)PCR扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸45s；循环35次；72℃终延伸10min，4℃冷却10min；
24组扩增产物分别在2％琼脂糖凝胶上100V电泳35min，并于凝胶成像系统下观察，分别回收24组扩增产物；
S3，测序鉴定
分别测序鉴定24组扩增产物核苷酸序列，根据相应SNP位点的基因型确定待测样品的24位的数字串，相应的SNP位点如果为其中一种纯合子基因型，则定义为0；如果是另一种纯合子基因型，则定义为1；如果为杂合子，则定义为2；从而每个待测样品分别产生一个24位的数字串，所述24位的数字串即为识别该待测样品的分子标签，从而完成对梅花鹿个体的识别。
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