CN107441135A - 小蓟总黄酮在制备治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血药物中的应用 - Google Patents

小蓟总黄酮在制备治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及小蓟总黄酮在制备治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血药物中的应用，可有效解决小蓟总黄酮作为唯一活性成分制备治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血的药物问题，所述的小蓟总黄酮是，将小蓟粉碎成粗粉，乙醚回流提取脱脂，药渣挥干乙醚，加80%乙醇浸泡，回流提取，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水分散成相当于含生药0.3g/mL的分散液，分散液上AB‑8型大孔吸附树脂，依次用蒸馏水、10%乙醇、80%乙醇洗脱，收集80%乙醇洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，冷冻干燥，粉碎，得小蓟总黄酮。本发明可有效解决从小蓟中提取小蓟总黄酮，有效用于治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血，开拓了小蓟的新用途和药用价值，有显著的经济和社会效益。

Description

小蓟总黄酮在制备治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血药物中的 应用
技术领域
本发明涉及医药，特别是一种小蓟总黄酮在制备治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血药物中的应用。
背景技术
脑缺血性疾病是一组由多种原因导致大脑、小脑或脑干局部或多部位供血不足，从而引起相应神经系统症状的疾病。包括反复脑缺血和局灶性脑缺血，形成病因复杂，反复脑缺血是指脑缺血反复发作；局灶性脑缺血是指短暂性脑缺血发作(TIA)，颈动脉或椎-基底动脉系统发生短暂性血液供应不足，引起局灶性脑缺血导致突发的、短暂性、可逆性神经功能障碍。发作持续数分钟，通常在30分钟内完全恢复，超过2小时常遗留轻微神经功能缺损表现，或CT及MRI显示脑组织缺血征象。TIA好发于34～65岁，65岁以上占25.3％，男性多于女性。发病突然，多在体位改变、活动过度、颈部突然转动或屈伸等情况下发病。发病无先兆，有一过性的神经系统定位体征，一般无意识障碍，给人的身体健康带来伤害，因此对反复脑缺血和局灶性脑缺血的治疗是人们非常关心的问题，但目前虽有多种药物，由于种种原因，其疗效并不尽人意。
小蓟味甘、苦，凉，归心、肝经，具有凉血止血，祛瘀消肿的作用，或有效用于衄血，吐血，尿血，便血，崩漏下血，外伤出血，痈肿疮毒。但至今未见有小蓟中提取小蓟总黄酮在制备治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血药物中的应用。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明就是提供一种小蓟总黄酮在制备治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血药物中的应用，可有效解决小蓟总黄酮作为唯一活性成分制备治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血的药物问题。
本发明解决的技术方案是，一种小蓟总黄酮在制备治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血药物中的应用，所述的小蓟总黄酮是，将小蓟粉碎成粗粉，乙醚回流提取脱脂，弃去乙醚；小蓟药渣挥干乙醚，加质量浓度80％乙醇浸泡，回流提取，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水分散成相当于含生药0.3g/mL的分散液，分散液上AB-8型大孔吸附树脂，依次用蒸馏水、质量浓度10％乙醇、质量浓度80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，冷冻干燥，粉碎，得小蓟总黄酮。
本发明可有效解决从小蓟中提取小蓟总黄酮，并有效用于治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血，开拓了小蓟的新用途和药用价值，是药物上的一大创新，有显著的经济和社会效益。
具体实施方式
以下结合具体情况为本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，一种小蓟总黄酮在制备治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血药物中的应用，所述的小蓟总黄酮是，将小蓟粉碎成过20-30目筛的粗粉，先加10倍重量的乙醚回流提取1h，脱脂，弃去乙醚；小蓟药渣挥干乙醚，加小蓟10倍重量的、质量浓度80％乙醇浸泡0.5h，回流提取1h，过滤，得第一次滤液；药渣再加小蓟10倍重量的、质量浓度80％乙醇，回流提取1h，过滤，得第二次滤液，合并两次滤液，减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水分散成相当于含生药0.3g/mL的分散液，分散液上AB-8型大孔吸附树脂，先用2倍柱体积蒸馏水洗脱，弃去水液；继用4倍柱体积的、质量浓度10％乙醇洗脱，弃去洗脱液；再用6倍柱体积的、质量浓度80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，冷冻干燥，粉碎，得小蓟总黄酮，小蓟总黄酮质量含量50％以上。
本发明所制备的小蓟总黄酮经实验具有抗反复脑缺血和局灶性脑缺血之功效，有效用于制备治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血的药物，是治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血药物上的创新，并经实验取得了非常好的有益技术效果，有关实验资料如下：
实验一小蓟总黄酮对小鼠脑膜微循环的影响
1实验材料
1.1实验药物
本发明小蓟总黄酮；
尼莫地平片，主要成分：尼莫地平，每片含20mg，适用于蛛网膜下腔出血造成的脑血管痉挛、急性期血液循环改善。厂家：亚宝药业集团股份有限公司批号：140445；
脑络通胶囊，主要成分：丹参、黄芪、川芎、盐酸托哌酮、甲基橙皮苷、维生素B6，可补血行气，松弛血管，增加脑血流灌注量，临床用于动脉粥样硬化，血栓，脑损伤、眩晕，半身不遂，肢体发麻，神疲乏力等症,每粒0.5g。厂家：吉林金宝药业股份有限公司批号：140201。
1.2实验试剂
羧甲基纤维素钠，厂家：天津市恒兴化学试剂有限公司，批号：20140106；
水合氯醛，厂家：天津市致远化学试剂有限公司，批号：131220；
生理盐水，厂家：河南科伦药业有限公司生产，批号：A14081801-2；
医用乙醇，厂家：新乡市三伟消毒有限公司，批号：20140805；
青霉素，厂家：华北制药集团有限责任公司，批号：F3098610。
1.3仪器
电子称：上海精密科学仪器有限公司，型号：YP1201N；
DZKW-4型电子恒温水浴锅，北京永光明医疗仪器厂；
超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；
1ml注射器，河南曙光健士医疗器械集团有限公司生产；
BI-2000图像分析系统，成都泰盟科学仪器有限公司；
散斑全帧实时扫描成像系统，型号：PIM3厂商：帕瑞医学科技(北京)有限公司；
电子天平，上海精密科学仪器有限公司，型号：FA2204B。
1.4实验动物
KM小鼠，SPF，雌雄各半，体重18-22g，购自河南省实验动物中心，本批小鼠合格证号：NO.41003100001113许可证号SCXK(豫)2010-0001。
2实验方法
2.1造模与给药
取18-21g健康小鼠84只，雌雄各半，称重，随机均分为：空白组，模型组，脑络通组，尼莫地平组，总黄酮大、中、小剂量组，共7组，每组12只。除空白组外，其余6组造小鼠双侧颈总动脉结扎模型。尼莫地平组(阳性药，按0.1ml/10g配成3mg/ml的混悬液，30mg/kg，临床用量的15倍)；脑络通胶囊组(阳性药，按0.1ml/10g配成75mg/ml的混悬液，750mg/kg，临床用量的15倍)；总黄酮大、中、小剂量组(按0.1ml/10g配成40mg/ml、20mg/ml、10mg/ml的混悬液，400mg/kg、200mg/kg、100mg/kg，临床用量的15倍)；术前，给予各对应组小鼠尼莫地平、脑络通、总黄酮大、中、小剂量的混悬液灌服，空白组、模型组只灌服同量羧甲基纤维素钠(0.5％CMC)，1次1d，连服7d。于第6d晚上8点按批禁食不禁水，第7d上午8点按批称重给药1h后，开始试验。首先启动计算机和其它外周设备，然后启动Perimed仪器，预热5分钟，当仪器的LED灯停止闪烁时可以开始监测，双击桌面上的PIMsoft软件，选择PeriCam PSI系统。点击工具，设置操作距离为10cm，监测区域的宽度和高度为2cm，步长设为中，频率设为23张/s。小鼠用5％水合氯醛0.06ml/10g腹腔注射麻醉(小鼠的翻正反射消失)，俯卧位固定，将颅骨正中皮肤矢状切开，用止血钳将两侧皮肤拉开，用标记笔在小鼠脑部矢状缝与冠状缝交叉处作一标记，将小鼠置于仪器的推荐距离范围内，并使仪器与监测部位平行，光束照在标记处，并与检测部位垂直，调整仪器距离与设定距离相一致，圈定扫描面积点击记录按钮开始记录，记录小鼠平静后2分钟内血流灌注量。松开小鼠，仰卧位固定，结扎双侧颈总动脉(空白组即假手术组只分离双侧颈总动脉，不做结扎处理)，然后松开小鼠，并俯卧位固定，记录小鼠平静后2分钟内血流灌注量。
2.2检测指标
取截扎前1分50秒--2分钟的血流灌注量平均值作为截扎前的血流平均灌注量，取3分50秒--4分钟的血流灌注量平均值作为截扎后的血流平均灌注量，用结扎后的血流灌注量减去结扎前的血流灌注量除以结扎前的血流灌注量得出脑血流的下降率。
2.2.1测定方法
除空白组外，其余小鼠均做双侧颈总结扎，然后于术前分批给药1小时后开始试验，启动计算机和其它外周设备，然后启动Perimed仪器，预热5分钟，当仪器的LED灯停止闪烁时可以开始监测，双击桌面上的PIMsoft软件，选择PeriCam PSI系统。点击工具，设置操作距离为10cm，监测区域的宽度和高度为2cm，步长设为中，频率设为23张/s。小鼠用5％水合氯醛0.06ml/10g腹腔注射麻醉(小鼠的翻正反射消失)，俯卧位固定，将颅骨正中皮肤矢状切开，用止血钳将两侧皮肤拉开，用标记笔在小鼠脑部矢状缝与冠状缝交叉处作一标记，将小鼠置于仪器的推荐距离范围内，并使仪器与监测部位平行，光束照在标记处，并与检测部位垂直，调整仪器距离与设定距离相一致，圈定扫描面积点击记录按钮开始记录，记录小鼠平静后2分钟内血流灌注量。松开小鼠，并仰卧位固定，每一侧颈总动脉结扎(空白组即假手术组只分离双侧颈总动脉，不做结扎处理)，然后松开小鼠，并俯卧位固定，记录小鼠平静后2分钟内血流灌注量，导出报告，进行分析。
3.统计学处理方法
数据分析用SPSS 17.0统计软件包进行数据资料的统计学处理，计量资料：平均数±标准差各组间比较：单因素方差分析，方差齐用最小显著差数(LSD)法，方差不齐用Games-Howell法检验。
4.实验结果
4.1总黄酮对小鼠脑膜微循环的影响
表1总黄酮对小鼠脑膜微循环的影响
注：相比模型组，用药组具有显著性差异(**P<0.01)，明显性差异(*P<0.05)
由表1可知：颈总结扎前各组小鼠脑膜微循环血流量差异不明显，说明分组均匀。与假手术组比，模型组脑膜微循环血流量显著减少(P<0.01)，说明造模成功，但因侧枝循环和局部血液循环，虽结扎双侧颈总动脉，脑血流并未完全阻断；与模型组比，大、中、小剂量小蓟总黄酮组、尼莫地平组和脑络通组均可显著改善双侧颈总动脉结扎所致的小鼠脑血流量减少(P<0.01)；与颈总结扎前比，颈总动脉结扎后各组小鼠脑膜微循环血流量均显著减少(P<0.01)
实验二小蓟总黄酮对小鼠反复脑缺血再灌注模型的影响
1实验材料
1.1实验药物
本发明小蓟总黄酮；
尼莫地平片，批号：140445，厂家：亚宝药业集团股份有限公司。
脑络通胶囊，批号：140201，厂家：吉林金宝药业股份有限公司。
1.2实验试剂
羧甲基纤维素钠，厂家：天津市恒兴化学试剂有限公司，批号：20140106；
LDH试剂盒，厂家：南京建成生物工程研究所，批号：20140818；
青霉素，厂家：华北制药集团有限责任公司，批号：F3098610；
水合氯醛，厂家：天津市致远化学试剂有限公司，批号：131220；
纯净水，厂家：新乡娃哈哈食品有限公司，批号：20140415；
生理盐水，厂家：河南科伦药业有限公司，批号：13102207B；
甲醛溶液，分析纯，厂家：烟台市双双化工有限公司，批号：20141003；
医用乙醇，厂家：新乡市三伟制剂有限公司，批号：20140805；
MDA试剂盒，厂家：南京建成生物工程研究所，批号：20140903
NSE试剂盒，厂家：江苏卡尔文生物科技有限公司，批号：20140901A；
考马斯亮蓝测定试剂盒，厂家：南京建成生物工程研究所；批号：20140915；
LD试剂盒，厂家：南京建成生物工程研究所，批号：20140905；
SOD试剂盒，厂家：南京建成生物工程研究所，批号：20140903；
S-100β试剂盒，厂家：江苏卡尔文生物科技有限公司，批号：20140901A；
ATP试剂盒，厂家：南京建成生物工程研究所，批号：20140910。
1.3仪器
紫外可见分光光度计，上海天美科学仪器有限公司，型号：UV1000；
电子天平，上海精密科学仪器有限公司，型号：FA2204B；
电子称，上海精密科学仪器有限公司，型号：YP1201N；
DZKW-4型电子恒温水浴锅，北京永光明医疗仪器厂；
可调式移液器，上海雷勃分析仪器有限公司；
超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；
玻璃匀浆器，郑州玻璃仪器厂；
台式低速自动平衡离心机,由长沙湘智离心机仪器公司提供，型号：TDL-40B；
酶标仪，美国BIO-RAD公司，型号：BIORAD-680。
1.4实验动物
KM种小鼠，SPF，雄性，体重22-27g，由河南省实验动物中心提供，许可证号SCXK(豫)2010-0001，本批小鼠合格证号：41003100001167。
2实验方法
2.1造模与给药
取健康小鼠105只，雄性，体重28-31g，称重，随机均分7组，每组15只，空白组﹑模型组、脑络通组、尼莫地平组、小蓟总黄酮大、中、小剂量组。除假手术组外，其余6组均造小鼠反复脑缺血再灌注模型。尼莫地平组(阳性药，按0.1ml/10g配成3mg/ml的混悬液，30mg/kg，临床用量的15倍)；脑络通胶囊组(阳性药，按0.1ml/10g配成75mg/ml的混悬液，750mg/kg，临床用量的15倍)；小蓟总黄酮大、中、小剂量组(按0.1ml/10g配成40mg/ml、20mg/ml、10mg/ml的混悬液，400mg/kg、200mg/kg、100mg/kg，临床用量的15倍)；术前，给予各对应组小鼠尼莫地平、脑络通、小蓟总黄酮大、中、小剂量的混悬液灌服，空白组、模型组只灌服同量0.5％CMC，1次1d，连服7d。
于第6d晚上8点分批禁食不禁水，第7d上午8点分批称重给药1h后，按0.03ml/10gip10％水合氯醛(小鼠的翻正反射消失)，用医用乙醇颈部消毒，然后用手术刀切颈部正中偏左部位，分离周围肌肉，用弯头精密镊剥离旁边神经，分离CCA，每一侧颈总动脉用针灸针钩起来(直径0.3mm)，角度约90，缺血10min，灌流10min，再缺血10min，去掉针灸针，手术处敷撒青霉素粉，缝合颈部伤口。空白组只剥离血管，其它同造模组。
2.2检测指标及测定方法
2.2.1检测指标
所有小鼠再灌注24h后，取眼血清测NSE、S-100β的含量。然后脱颈椎处死，迅速置冰盒上取脑，矢状切取一半置10％福尔马林液中，固定一周，石蜡包埋，作HE染色；另一半用生理盐水冲洗血迹，再用滤纸吸净生理盐水，称重，根据此重计算应加入的冰生理盐水量，以生理盐水(ml)：脑组织(g)＝9∶1的比例，用匀浆器在盛有冰块的大烧杯中配成10％的脑匀浆，3000r/min 4℃，离心10min，取上清液于低于-20℃保存，分别按试剂盒说明书测定脑匀浆中蛋白、LD、MDA的含量及LDH、SOD、ATP酶的活力。
2.2.2考马斯亮兰蛋白的测定方法
考马斯亮兰蛋白测定操作程序
摇匀，等10min，595nm，1cm光径，调零，测吸光度。
注：A，B，C分别为标准空白管，标准管，测定管蛋白浓度(gprot/l)＝(C值–A值)/(B值-A值)*0.563(标准品浓度gprot/l)
2.2.3脑匀浆中LD的测定方法
LD测定操作顺序表
摇匀，530nm，1cm光径，调零，测吸光度。
注：A，B，C分别为标准空白管，标准管，测定管
组织中LD含量(mmol/gprot)＝(C值－A值)*标准浓度(3mmol/L)/(B值－A值)/样本中的蛋白含量(gprot/L)
2.2.4脑匀浆中LDH的测定方法
脑组织LDH的操作方法
摇匀，置室温放3分钟，440nm，调零，1cm光径，测吸光度。
注：A：标准管B：对照管C：测定管D：测定对照管
组织中LDH活力(U/gprot)＝(C值－D值)/(A值-B值)*标准浓度(2mmol/L)/样品蛋白含量(gprot/ml)
2.2.5ATP酶的测定方法
脑匀浆中ATP酶测定方法
摇匀，离心(4000rpm)10分钟，取上清0.2ml定磷
定磷
摇匀，37度水浴30分钟，冷至室温，660nm，1cm光径，蒸馏水调零比色
注：A、B、C、D管分别为对照管、Na+K+-ATP酶管、Mg++-ATP酶管、Ca++-ATP酶管；组织中Na+K+-ATP酶、Mg++-ATP酶及Ca++-ATP酶活力(μmolPi/mgprot/hour)＝(B、C及D值－A值)/标准值*标准管浓度(0.5μmol/ml)*反应体系中样品稀释倍数(2.5)×6/样本蛋白含量(mgprot/ml)
2.2.6脑匀浆中总T-SOD的测定方法
脑匀浆中总T-SOD测定顺序表
摇匀，室温10min，550nm处，1cm光径，蒸馏水调零，比色。
注：A：测定管B：对照管
总SOD活力(U/mgprot)＝(B值-A值)/B值/50％*反应液总体积/取样量/待测样本蛋白浓度(mgprot/ml)
2.2.7脑匀浆中MDA的测定方法
脑匀浆中MDA的操作方法
混匀，95℃水浴40分钟，取出流水冷却，以4000转/分的转速，离心10min，取上清液于532nm，1cm光径处，蒸馏水调零，测各管OD值。
注：A：空白管B：标准管C：测定管D：对照管
组织中MDA含量(nmol/mgprot)＝(C值－D值)*标准品浓度(10nmol/ml)/(B值－A值)/蛋白含量(mgprot/ml)
2.2.8血清中NSE的测定方法
血清中NSE的测定操作顺序表
15分钟内，450nm波长处测各孔吸光度。
在Excel中，横坐标：标准品浓度，纵坐标：对应OD值，绘出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度。
2.2.9血清中S-100β的测定方法
检测原理、操作步骤：同NSE。
3统计学处理方法
数据分析用SPSS 17.0进行处理，计量资料：平均数±标准差各组间比较：单因素方差分析，方差齐:最小显著差数(LSD)法，方差不齐:Games-Howell法检验，等级资料:Ridit检验。
4实验结果
4.1对小鼠反复脑缺血再灌注死亡率的影响结果见表2
表2对小鼠脑缺血再灌注模型死亡率的影响
由表2可看出，死亡率：模型组最高，给药各组均不同程度的降低，说明给药各组能降低死亡率，减少缺血区脑组织损伤，保护脑组织。
4.2对小鼠脑缺血再灌注脑匀浆LD、MDA的影响结果见表3
表3对小鼠反复脑缺血再灌注模型组织LD、MDA含量的影响
注：相比模型组，用药组具有显著性差异(**P<0.01)，明显性差异(*P<0.05)
由表3可知，与假手术组相比，模型组脑匀浆中LD、MDA的含量提高均显著(P<0.01)，说明造模成功；与模型组相比，尼莫地平组、脑络通组、小蓟总黄酮大、中、小剂量组均能降低脑组织LD、MDA的含量，表明小蓟总黄酮各组对小鼠脑缺血再灌注脑组织LD、MDA含量有显著的调节作用，减轻脑组织的脂质过氧化程度，减轻乳酸的堆积，尤其是小蓟总黄酮大剂量最佳。
4.3对反复脑缺血再灌注模型小鼠脑匀浆中ATP酶活力的影响结果见表4
表4对小鼠脑缺血再灌注模型脑组织ATP酶活力的影响
注：相比模型组，用药组具有显著性差异(**P<0.01)，明显性差异(*P<0.05)
由表4可看出：模型组的小鼠脑组织中的Na+K+-ATP酶、Mg++-ATP酶、Ca++-ATP酶活力比假手术组显著降低(P<0.01)，说明脑缺血再灌注模型成功；与模型组相比，尼莫地平组、脑络通组、小蓟总黄酮各剂量组均升高脑组织中Na+K+-ATP酶、Mg++-ATP酶、Ca++-ATP酶活力。实验结果证实：小蓟总黄酮通过提高脑组织Na+K+-ATP酶、Mg++-ATP酶、Ca++-ATP酶的活力，进而抑制缺血脑组织的能量代谢障碍，从而改善小鼠脑缺血再灌注损伤。
4.4对反复脑缺血模型小鼠脑匀浆中LDH和SOD活力的影响见表5
表5对小鼠反复脑缺血模型脑匀浆中LDH和SOD活力的影响
注：相比模型组，用药组具有显著性差异(**P<0.01)，明显性差异(*P<0.05)
由表5可看出，与假手术组相比，模型组小鼠缺血侧脑组织中LDH活性和SOD水平均显著降低(P<0.01)，说明小鼠反复脑缺血再灌注模型造模成功；与模型组比较，尼莫地平组、脑络通组、小蓟总黄酮各剂量组可显著升高脑组织中LDH的活性(P<0.01)。表明小蓟总黄酮可以显著升高反复脑缺血模型小鼠脑组织LDH的活性和超氧化酶的活性，进而保护脑组织，尤其小蓟总黄酮大剂量效果最佳。
4.5对反复脑缺血模型小鼠血清中NSE、S-100β含量的影响见表6
表6对小鼠反复脑缺血模型血清中NSE、S-100β含量的影响
注：相比模型组，用药组具有显著性差异(**P<0.01)，明显性差异(*P<0.05)
由表6可看出：与假手术组比较，模型组小鼠血清中NSE、S-100β含量显著升高(P<0.01)，说明反复脑缺血再灌注模型造模成功；与模型组比，尼莫地平组、脑络通组、小蓟总黄酮大、中、小剂量组均能降低血清中NSE、S-100β含量，表明小蓟总黄酮可以减轻缺血损伤小鼠血清中的NSE、S-100β含量，进而保护缺血造成的小鼠神经元损伤和神经元坏死。
4.6对反复脑缺血再灌注小鼠脑组织海马区病理改变的影响见表7
表7对反复脑缺血再灌注小鼠脑组织海马区病理改变的影响
“—”神经细胞无损伤；“+”大脑海马区神经细胞轻微水肿，神经元个别变性，结构模糊，胞浆淡染；“++”大脑海马区神经细胞中度水肿，神经元多数变性甚至坏死，结构模糊，胞浆淡染；“+++”大脑海马区神经细胞重度水肿，神经元坏死，结构模糊，胞浆淡染。
由表7可得知：空白组大脑海马神经细胞无损伤；模型组大脑神经元坏死、海马神经细胞重度水肿；尼莫地平组大脑海马少数神经元变性，神经细胞轻微水肿；脑络通组大脑海马神经元个别变性，神经细胞轻微水肿；大剂量小蓟总黄酮组大脑海马神经元个别变性，神经细胞轻微水肿；中剂量小蓟总黄酮组大脑海马神经元个别变性、部分神经细胞水肿，结构模糊，胞浆淡染；小剂量小蓟总黄酮组大脑海马神经元大面积变性、神经细胞水肿、细胞核固缩、胞浆淡染。
经Ridit检验，模型组相比假手术组有显著的统计意义(P<0.01)，说明缺血再灌注模型成功。与模型组相比，小蓟总黄酮大、中、小剂量组有明显的统计学意义(P<0.05)；结果提示：小蓟总黄酮可改善缺血再灌注模型小鼠脑组织海马区免受损伤，从而起到保护脑组织的作用。
4.7对反复脑缺血再灌注小鼠脑皮质区病理改变的影响见表8
表8对反复脑缺血再灌注小鼠脑组织皮质区病理改变的影响
“—”大脑皮质区无损伤；“+”大脑皮质区神经元个别坏死、神经细胞水肿、胞浆淡染、结构模糊；“++”大脑皮质区神经元大部分坏死及神经细胞水肿、胞浆淡染、结构模糊；“+++”大脑皮质区重度水肿，神经元坏死，胞浆淡染、结构模糊。
由表8可得知：空白组大脑皮质神经细胞无损伤；模型组大脑皮质神经元大部分坏死、神经细胞重度水肿；尼莫地平组大脑皮质神经元少部分变性、神经细胞轻微水肿，结构模糊，胞浆淡染；脑络通组大脑皮质神经元少部分变性、神经细胞轻微水肿，结构模糊，胞浆淡染；大剂量小蓟总黄酮组大脑皮质少数神经元变性、神经细胞水肿，结构模糊，胞浆淡染；中剂量小蓟总黄酮组大脑皮质极个别神经元变性、神经细胞水肿、结构模糊、胞浆淡染；小剂量小蓟总黄酮大脑皮质神经元大部分变性甚至坏死、神经细胞严重水肿、胞浆淡染、结构模糊。
经Ridit分析，模型组相比假手术组有显著的统计学意义(P<0.01)，说明造模成功；脑络通组、尼莫地平组、大、中、小剂量小蓟总黄酮组与模型组相比有显著的统计学意义(P<0.01)，说明各用药组均能显著保护缺血再灌注小鼠脑组织皮质区免受损伤，因此，对实验小鼠做病理观察具有直观的诊断意义。
实验三小蓟总黄酮对大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的影响
1实验材料
1.1实验药物
本发明小蓟总黄酮；
脑络通胶囊，由吉林金宝药业股份有限公司提供，批号：140201；
尼莫地平片，由亚宝药业集团股份有限公司提供，批号：140445。
1.2实验试剂
羧甲基纤维素钠，厂家：天津市恒兴化学试剂有限公司，批号：20140106；
生理盐水：厂家：河南科伦药业有限公司生产，批号：A14081801-2；
冰醋酸，厂家：天津市致远化学试剂有限公司，批号：20130602；
水合氯醛，厂家：天津市致远化学试剂有限公司，批号：131220；
医用乙醇，厂家：新乡市三伟消毒制剂有限公司，批号：20140805；
青霉素，厂家：华北制药集团有限责任公司，批号：F3098610；
ATP酶测试盒，厂家：南京建成生物工程研究所，批号：20141218；
考马斯亮兰测试盒，厂家：南京建成生物工程研究所，批号：20141212；
NO测试盒，厂家：南京建成生物工程研究所，批号：20141211；
NOS测试盒，厂家：南京建成生物工程研究所，生产批号：20141218；
纯净水，厂家：新乡娃哈哈食品有限公司，批号：20140415；
TNF-α检测试剂盒，厂家：江苏卡尔文生物科技有限公司，批号：20141201A；
VCAM-1检测试剂盒，厂家：江苏卡尔文生物科技有限公司，批号：20141201A
ICAM-1检测试剂盒，厂家：江苏卡尔文生物科技有限公司，批号：20141201A；
NSE检测试剂盒，厂家：江苏卡尔文生物科技有限公司，批号：20141201A；
MPO检测试剂盒，厂家：江苏卡尔文生物科技有限公司，批号：20141201A；
IL-1β检测试剂盒，厂家：江苏卡尔文生物科技有限公司，批号：20141201A；
甲醛溶液，分析纯，厂家：烟台市双双化工有限公司，批号：20141003。
1.3仪器
紫外可见分光光度计，上海天美科学公司，型号：UV1000；
台式低速自动平衡离心机，长沙湘智离心机公司，型号：TDL-40B；
电子天平，上海精密科学仪器有限公司，型号：FA2204B；
电子称，上海精密科学仪器有限公司，型号：YP1201N；
超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；
专业图像分析系统，NIS-Elements AR 4.10.01；
DZKW-4型电子恒温水浴锅，北京永光明医疗仪器厂；
可调式移液器，上海雷勃分析仪器有限公司；
MCAO线栓，沙东生物技术有限公司,批号：2838-A4；
玻璃匀浆机，郑州玻璃仪器厂生产；
酶标仪，美国BIO-RAD公司，型号：BIORAD-680。
1.4实验动物
Wistar大鼠，雄性，SPF，112只，体重230-250g，本批大鼠合格证号：0021964，山东鲁抗医药股份有限公司，许可证号SCXK(鲁)20130001。
2实验
2.1造模与给药
取健康雄性大鼠112只，体重280-300g，称重，随机分7组，每组16只，分别为空白组﹑模型组、尼莫地平组、脑络通组、小蓟总黄酮大、中、小剂量组。尼莫地平(阳性对照药，给药体积为1ml/100g，给药剂量为20mg/kg，相当于临床剂量的10倍，临用前配成药物浓度2mg/ml)；脑络通胶囊(阳性对照药，给药体积为1ml/100g，给药剂量为500mg/kg，临用前配成药物浓度50mg/ml，相当于临床用量的10倍)；小蓟总黄酮大、中、小剂量组(给药体积为1ml/100g，给药剂量分别为0.2g/kg、0.1g/kg、0.05g/kg，临用前配成药物浓度0.02g/ml、0.01g/ml、0.005g/ml)；空白组、模型组灌服同量羧甲基纤维素钠(0.5％CMC)，1次1d，连续给药7d。
第6天晚上8点分批禁食不禁水，第7天上午8点按批称重，给药1h后，10％水合氯醛ip麻醉大鼠，切颈部正中偏左，逐层分离左侧颈总动脉CCA，颈外动脉(ECA)，颈内动脉(ICA)，结扎CCA和ECA，微动脉夹夹闭颈内动脉，于CCA距离分叉1mm处剪一个约0.2mm宽的小口，将线栓插入，经CCA分叉部进入ICA，向上深入至分叉以上8-10mm，直至有阻力，即阻断大脑中动脉入口处，结扎ICA切口和栓线，2h后轻轻抽出栓线，实现再灌注，建立大脑中动脉阻塞-再灌注(MCAO)动物模型。空白组做假手术处理，只露左侧血管，不阻断血流。
2.2检测指标和测定
2.2.1.所有大鼠再灌注22h后，进行神经行为学评分：采用Longa评分法。死亡，5分；不能以自我意识行走，4分；行走时，身体向患侧倾倒，3分；爬行时出现向患侧转圈，2分；偏瘫对侧前爪不能完全伸展，1分；神经功能，活动正常，0分。评分为0、5分者剔除；摘眼球取血，30分钟后，离心，取上清液测NSE、MPO含量；大鼠断头后，迅速置冰盘中，剥取脑组织，一半左侧大脑制备10％的脑匀浆用于检测NO、NOS、TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1、ATP酶及蛋白含量；另一半左侧脑组织，用10％甲醛溶液固定，用于HE染色，观察脑组织形态学改变；观察动物死亡率。
2.2.2NO试剂盒测定方法：
脑匀浆中NO测定顺序表
注：A，B，C管为别为空白管，标准管，测定管。
NO含量(μmol/gprot)＝(C值－A值)*标准品浓度/(B值－A值)/蛋白含量(gprot/L)2.2.3NOS试剂盒测定方法：
脑匀浆中NOS测定顺序表
注：A：空白管B：总NOS测定管
总NOS(U/mgprot)＝(B值-A值)/呈色物纳摩尔消光系数*(反应液总体积÷取液量)/(比色光径×反应时间)/样品蛋白含量(mgrot/L)
2.2.4大鼠IL-1β检测试剂盒测定方法
检测原理、操作步骤：同实验二中NSE
2.2.5大鼠NSE检测试剂盒测定方法
检测原理、操作步骤：同实验二中NSE
2.2.6大鼠TNF-α检测试剂盒测定方法
检测原理、操作步骤：同实验二中NSE
2.2.7大鼠ICAM-1检测试剂盒测定方法
检测原理、操作步骤：同实验二中NSE
2.2.8大鼠VCAM-1检测试剂盒测定方法
检测原理、操作步骤：同实验二中NSE
2.2.9大鼠MPO检测试剂盒测定方法
检测原理、操作步骤：同实验二中NSE
2.2.10大鼠ATP酶试剂盒测定方法
检测原理、操作步骤同实验二中ATP酶
2.2.11考马斯亮蓝蛋白试剂盒的测定方法
检测原理、操作步骤同实验二中考马斯亮蓝蛋白
3统计学处理
数据分析用SPSS 17.0进行处理，计量资料：平均数±标准差各组间比较：单因素方差分析，方差齐：最小显著差数(LSD)法，方差不齐：Games-Howell法检验，等级资料：Ridit检验。
4实验结果
4.1对大鼠局灶性脑缺血模型神经功能缺失评分、死亡率的影响见表9
表9对大鼠局灶性脑缺血模型神经功能缺失评分、死亡率的影响
注：相比模型组，用药组具有显著性差异(**P<0.01)，明显性差异(*P<0.05)
由表9可以看出，模型组的死亡率比较高，尼莫地平组、脑络通组、大、中剂量小蓟总黄酮组大鼠的死亡率均有所降低，说明用药组均能不同程度的降低局灶性脑缺血再灌注大鼠死亡率，减少脑组织损伤，保护脑组织。模型组大鼠相比假手术组神经功能评分显著升高(P<0.01)，说明造模成功；尼莫地平组、脑络通组、大、中、小剂量小蓟总黄酮组相比模型组大鼠神经功能评分显著降低(P<0.01)，说明用药组可显著改善局灶性脑缺血再灌注大鼠脑神经状况的作用。
4.2对局灶性脑缺血模型大鼠脑匀浆中NO和NOS活力的影响见表10
表10对大鼠局灶性脑缺血模型脑匀浆中NO和NOS活力的影响
注：相比模型组，用药组具有显著性差异(**P<0.01)，明显性差异(*P<0.05)
由表10可看出，与假手术组相比，模型组大鼠脑匀浆中NO含量显著升高，NOS活力显著增强，说明局灶性脑缺血再灌注模型成功。与模型组相比，尼莫地平组、脑络通组、小蓟总黄酮各剂量组均可显著降低NO含量(P<0.01)，显著减弱NOS活力(P<0.01)，表明小蓟总黄酮对局灶性脑缺血再灌注模型大鼠脑匀浆中NO含量和NOS活力的变化有改善作用。4.3对大鼠局灶性脑缺血模型脑匀浆中TNF-α、IL-1β含量的的影响见表11
表11对大鼠局灶性脑缺血模型脑匀浆中TNF-α、IL-1β含量的影响
注：相比模型组，用药组具有显著性差异(**P<0.01)，明显性差异(*P<0.05)
由表11可看出：与假手术组比较，模型组大鼠缺血侧脑组织中TNF-α、IL-1β含量显著升高(P<0.01)，说明大鼠局灶性脑缺血再灌注模型成功；与模型组比较，尼莫地平组、脑络通组、小蓟总黄酮大、中、小剂量组均能降低脑组织中的TNF-α、IL-1β含量。表明小蓟总黄酮可以显著降低大鼠局灶性脑缺血模型脑组织TNF-α、IL-1β含量，从而抑制炎症因子和炎症介质的产生，可改善缺血再灌注造成的损伤，尤其小蓟总黄酮大剂量效果最佳。
4.4对局灶性脑缺血模型大鼠脑匀浆中ICAM-1、VCAM-1含量的影响见表12
表12对局灶性脑缺血模型大鼠脑匀浆中ICAM-1、VCAM-1含量的影响
注：相比模型组，用药组具有显著性差异(**P<0.01)，明显性差异(*P<0.05)
由表12可看出：与假手术组比较，模型组大鼠缺血侧脑组织中ICAM-1VCAM-1含量显著升高(P<0.01)，说明局灶性脑缺血再灌注模型成功；与模型组比较，尼莫地平组、脑络通组、小蓟总黄酮大剂量组均能降低脑组织中的ICAM-1、VCAM-1含量，表明小蓟总黄酮可降低大鼠局灶性脑缺血模型脑组织ICAM-1、VCAM-1含量。尤其小蓟总黄酮大剂量效果最佳。
4.5对局灶性脑缺血模型大鼠脑匀浆中ATP酶活力的影响见表13
表13对局灶性脑缺血模型大鼠脑匀浆中ATP酶活力的影响
注：相比模型组，用药组具有显著性差异(**P<0.01)，明显性差异(*P<0.05)
由表13可看出：与假手术相比，模型组的大鼠脑组织中的Na+K+-ATP酶、Mg++-ATP酶、Ca++-ATP酶活力显著降低(P<0.01)，说明局灶性脑缺血再灌注模型成功；与模型组相比，尼莫地平组、脑络通组、小蓟总黄酮各剂量组脑组织中Na+K+-ATP酶、Mg++-ATP酶、Ca++-ATP酶活力均明显升高，表明小蓟总黄酮对大鼠局灶性脑缺血再灌注脑组织中Na+K+-ATP酶、Mg++-ATP酶、Ca++-ATP酶活力的变化有改善作用，可改善脑组织中能量代谢障碍，尤其是小蓟总黄酮大剂量最佳。
4.6对局灶性脑缺血模型大鼠血清中NSE、MPO含量的影响见表14
表14对局灶性脑缺血模型大鼠血清中NSE、MPO含量的影响
注：相比模型组，用药组具有显著性差异(**P<0.01)，明显性差异(*P<0.05)
由上表可看出：与假手术组比较，模型组大鼠血清中NSE、MPO含量显著升高(P<0.01)，说明造模成功；与模型组比较，尼莫地平组、脑络通组、小蓟总黄酮各剂量组均能降低大鼠血清中NSE、MPO含量，表明小蓟总黄酮可以降低局灶性脑缺血模型大鼠血清中的NSE、MPO含量。尤其小蓟总黄酮大剂量效果最佳。
4.7对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织海马区病理改变的影响见表15
表15对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织海马区病理改变的影响
“—”神经细胞无损伤；“+”大脑海马区神经细胞轻微水肿，少数神经元变性，胞浆淡染，结构不清；“++”大脑海马区神经细胞中度水肿，神经元变性，个别坏死，胞浆淡染，结构不清；“+++”大脑海马区神经细胞严重水肿，神经元坏死。
由上表可知，空白组大脑海马细胞无损伤；模型组脑海马神经细胞重度水肿，神经元重度坏死；尼莫地平组大脑海马神经细胞轻微水肿，个别神经元变性，个别坏死，胞浆淡染，结构不清；脑络通组大脑海马神经细胞轻微水肿，少数神经元变性，胞浆淡染，结构不清；大剂量小蓟总黄酮组大脑海马神经细胞个别水肿，个别神经元变性，胞浆淡染，结构不清；中剂量小蓟总黄酮组大脑海马神经细胞轻微水肿，神经元轻微变性，个别坏死，胞浆淡染，结构不清；小剂量小蓟总黄酮组大脑海马神经细胞严重水肿，神经元变性及个别坏死，胞浆淡染，结构不清。
经Ridit检验，造模组相比假手术组有显著的统计意义(P<0.01)，说明模型成功，尼莫地平组、小蓟中、小剂量组相比模型组有明显的统计学意义(P<0.05)，脑络通组、小蓟大剂量组相比模型组有显著的统计学意义(P<0.01)，因此，小蓟总黄酮可保护缺血再灌注大鼠脑海马区免受损伤。
4.8对大鼠局灶性缺血再灌注脑皮质区病理改变的影响见表16
表16对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑皮质区病理改变的影响
“—”大脑皮质区无损伤；“+”大脑皮质区轻微水肿，神经元个别坏死，梗死面积占脑组织的1/3以内；“++”大脑皮质区水肿，成片神经元坏死，梗死面积占脑组织的1/3～2/3以内；“+++”大脑皮质区水肿，大片神经元坏死，梗死面积占脑组织的2/3以上。
由上表可知，空白组大脑皮质无损伤；模型组大脑皮质神经细胞重度水肿，神经元坏死；尼莫地平组大脑皮质神经细胞轻微水肿，个别神经元变性，个别坏死；脑络通组大脑皮质神经细胞轻微水肿，少数神经元变性；大剂量小蓟总黄酮组大脑皮质神经细胞个别水肿，个别神经元变性；中剂量小蓟总黄酮组大脑皮质神经细胞轻微水肿，神经元轻微变性，个别坏死；小剂量小蓟总黄酮组大脑皮质神经细胞严重水肿，神经元变性及个别坏死，胞浆淡染，结构不清。
经Ridit检验，造模组相比假手术组有显著的统计意义(P<0.01)，说明造模成功。尼莫地平组、脑络通组、小蓟总黄酮大、中、小剂量组相比模型组有显著的统计学意义(P<0.01)，说明小蓟总黄酮可保护缺血再灌注大鼠脑皮质区免受损伤。
实验四临床应用资料
在动物试验确保安全的基础上，在临床上进行了对比试验，对照组采用氯吡格雷，治疗组采用氯吡格雷加小蓟花总黄酮，有关试验情况如下：
选择符合全国第四次脑血管病学术会议制订的短暂脑缺血诊断标准:即为短暂的、可逆的、局部的脑血液循环障碍，可反复发作，少者1～2次，多至数十次，每次发作持续时间通常在数分钟至1h左右，症状和体征应该在24h内完全消失。
ABCD2评分标准:年龄＞60岁(1分)；血压为收缩压＞140mmHg或舒张压＞90mmHg(1分)；临床症状为单侧无力(2分)，不伴无力的言语障碍(1分)；症状持续时间＞60min(2分)，10～59min(1分)；患有糖尿病(1分)。危险分层:0～3分为低危组；4～5分为中危组；6～7分为高危组。
选择ABCD2评分标准在低危层的患者60人，随机分为2组，每组30人，对照组口服氯吡格雷(商品名为波立维，75mg/片，法国赛诺菲公司)，每次75mg，1d 1次，首剂300mg。治疗组除按对照组方法服用氯吡格雷外，加用小蓟总黄酮(总黄酮制成胶囊，每粒0.3g)，每次2粒，每天2次。以上两组均治疗30d，治疗期间常规调控血压及血糖，停用其他能够影响凝血功能的药物。
氯吡格雷组与氯吡格雷加小蓟总黄酮组7d内短暂脑缺血发作终止的例数分别为25例、27例，7d内短暂脑缺血发作终止时的时间分别为(9.72±1.18)d、(0.52±1.14)d、，7d后仍有发作的例数分别为5例、3例，30d内短暂脑缺血加重的例数均为0例。小蓟总黄酮加氯吡格雷对短暂脑缺血患者的总体疗效优于常规氯吡格雷治疗组。
总之，由上以实验表明，本发明小蓟总黄酮具有改善脑膜微循环，有效用于制备治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血的药物，实现小蓟总黄酮在制备治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血药物中的应用，开拓了小蓟的新用途和药用价值，有显著的经济和社会效益。

Claims (1)

1.一种小蓟总黄酮作为唯一活性成分在制备治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血药物中的应用，所述的小蓟总黄酮是，将小蓟粉碎成过20-30目筛的粗粉，先加10倍重量的乙醚回流提取1h，脱脂，弃去乙醚；小蓟药渣挥干乙醚，加小蓟10倍重量的、质量浓度80%乙醇浸泡0.5h，回流提取1h，过滤，得第一次滤液；药渣再加小蓟10倍重量的、质量浓度80%乙醇，回流提取1h，过滤，得第二次滤液，合并两次滤液，减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水分散至相当于含生药0.3g/mL的分散液，分散液上AB-8型大孔吸附树脂，先用2倍柱体积蒸馏水洗脱，弃去水液；继用4倍柱体积的、质量浓度10%乙醇洗脱，弃去洗脱液；再用6倍柱体积的、质量浓度80%乙醇洗脱，收集80%乙醇洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，冷冻干燥，粉碎，得小蓟总黄酮。
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