CN107436311A - 一种鉴别胰岛素单体或胰岛素多聚体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,涉及一种鉴别胰岛素单体或胰岛素多聚体的方法,同时建立了一种含锌胰岛素多聚体解聚为稳定单体的方法。具体而言涉及一种使用差示扫描量热法检测胰岛素单体或胰岛素多聚体的方法。本发明的鉴别方法,样品不需要进行标记或使用人造探针等复杂的样品预处理过程,具有操作简便,快速、灵敏度高等特点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种鉴别胰岛素单体或胰岛素多聚体的方法,同时建立了一种含锌胰岛素多聚体解聚为稳定单体的方法。
背景技术
糖尿病是一类与胰岛素产生和作用异常相关、以血糖增高(高糖血症)为特征的慢性疾病群,对人体造成极大的危害,它的并发症几乎波及人体的所有组织和器官,尤其是心脏、血管、神经末梢、眼睛和肾脏,是导致中风、心脏病、肾病、失明及截肢的主要原因之一。2015年12月1日IDF在世界糖尿病大会上发布的《糖尿病地图》显示,全球范围内,每11名成年人就有1人患有糖尿病(总计4.15亿),II型糖尿病不再只是发达国家的专利,随着城市化进程的加剧以及饮食和生活方式的改变,IDF估计75%的糖尿病人群生活在中低收入国家。其中中国约有1.1亿名糖尿病患者,约占中国成年人总数的1/10。预计中国该数字将在2040年增至1.5亿人,给民众健康和社会经济带来严重影响。目前,每6秒钟就有1人因糖尿病死亡,年死亡率已经超过了疟疾、结核和艾滋病的总和。因此,胰岛素类药物作为糖尿病的主要治疗药物,应加快研发进度,尤其是生物类似药的研发。
差示扫描量热法(DSC)是指在程序升温时,将待测物与参比物置于等同的温度条件下,建立两者之间无温差条件所需供给的能量对时间或温度记录的一种方法。温度变化会引起生物大分子特定空间构象的改变,进而发生热容变化,而差示扫描微量热法可以直接测定溶液的热容变化,并获得相关的热力学参数,因其灵敏度高、快速可靠、可定量热分析、操作简便等特点,已广泛用于药物发现和开发,例如,用于鉴定和选择生物治疗药物开发过程中最稳定的蛋白质或潜在候选药物;用于配体相互作用研究;用于纯化和生产条件的快速优化;用于简易、快速确定液体制剂的最佳条件;对用于筛选的靶蛋白进行快速稳定性指示分析等。然而,差示扫描量热法用于胰岛素单体或胰岛素多聚体的鉴别未见报道。
发明内容
本发明涉及一种鉴别胰岛素单体或胰岛素多聚体的方法,其特征在于,使用差示扫描量热法检测含有胰岛素的溶液,并获得相应的DSC图谱,图谱中若出现明显吸热峰则该胰岛素以多聚体形式存在,图谱中若无吸热峰则该胰岛素以单体形式存在。
在本发明的一个实施方案中,所述胰岛素包括人胰岛素、胰岛素类似物等。优选的,所述胰岛素选自德谷胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素、谷赖胰岛素、甘精胰岛素或地特胰岛素。更优选的,所述胰岛素选自德谷胰岛素或门冬胰岛素。
在本发明的一个实施方案中,所述多聚体选自六聚体或双六聚体。
在本发明的一个实施方案中,上述含有胰岛素的溶液,其特征在于,胰岛素最终浓度为0.05-1.50mmol/L,优选的浓度为0.1-1.0mmol/L,更优选的浓度为0.2-0.7mmol/L。
在本发明的一个实施方案中,上述含有胰岛素的溶液,进一步包括制备稳定的胰岛素单体溶液,其特征在于,含锌胰岛素制剂中加入EDTA,再加入柠檬酸钠缓冲液作为缓冲体系;上述EDTA和含锌胰岛素制剂的摩尔比范围选自10-0.5:1,优选8-2:1,最优选4:1;上述柠檬酸缓冲液的pH范围选自5.0-7.0,优选6.5;柠檬酸缓冲液的浓度选自10mmol/L-100mmol/L,优选20mmol/L-50mmol/L。
在本发明的一个实施方案中,上述所用差示扫描微量热仪的仪器型号为MicroCalVP-Capillary DSC,所述检测的起始温度为20℃,终止温度为110℃;升温速率为220℃/Hr.;保护气体为氮气,压力50-60psi;具体仪器参数如下:
在本发明的一个实施方案中,上述DSC图谱采集软件为MicroCal-Capillary DSC analysissoftware 2.0,数据处理软件为MicroCal VP-Capillary DSC Automated Analysis-Origin 7。
在本发明的一个优选实施方案中,具有明显吸热峰的DSC图谱基本上如图2所示。
在本发明的另一个优选实施方案中,具有明显吸热峰的DSC图谱基本上如图3所示。
在本发明的又一个优选实施方案中,具有明显吸热峰的DSC图谱基本上如图4所示。
在本发明的再一个优选实施方案中,具有明显吸热峰的DSC图谱基本上如图5所示。
本发明的另一方面涉及一种胰岛素多聚体转化为单体的方法,其特征在于,含锌胰岛素制剂中加入EDTA络合剂,再加入柠檬酸钠缓冲液作为缓冲体系;上述EDTA和含锌胰岛素制剂的摩尔比范围为10-0.5:1,优选8-2:1,最优选4:1;上述柠檬酸缓冲液的pH范围选自5.0-7.0,优选6.5;柠檬酸缓冲液的浓度选自10mmol/L-100mmol/L,优选20mmol/L-50mmol/L。
在本发明的一个实施方案中,所述胰岛素包括人胰岛素、胰岛素类似物等。优选的,所述胰岛素选自德谷胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素、谷赖胰岛素、甘精胰岛素或地特胰岛素。更优选的,所述胰岛素选自德谷胰岛素或门冬胰岛素。
在本发明的一个实施方案中,所述多聚体选自六聚体或双六聚体。
在本发明的一个实施方案中,上述制得的稳定胰岛素单体样品可用于体外活性测定。
本发明的又一方面涉及一种德谷胰岛素双六聚体,其具有基本上如图4所示的DSC图谱。
本发明的再一方面涉及一种门冬胰岛素六聚体,其具有基本上如图5所示的DSC图谱。
本发明中,“胰岛素类似物”表示多肽,其通过除去和/或取代存在于天然胰岛素上的至少一个氨基酸残基和/或通过添加至少一个氨基酸残基,具有形式上可从天然存在胰岛素(例如人胰岛素)的结构所衍生的分子结构。添加和/或取代的氨基酸残基可以为编码氨基酸残基或为其它天然存在的氨基酸残基或为纯合成的氨基酸残基。
本发明可快速鉴别胰岛素单体或胰岛素多聚物,且样品可直接进行检测,不需要进行标记或使用人造探针等复杂的样品预处理过程,操作简便,经济可靠,同时还具有灵敏度高等特点。
附图说明
图1为德谷胰岛素原料DSC图谱。
图2为德谷胰岛素市售制剂DSC图谱。
图3为门冬胰岛素市售制剂DSC图谱。
图4为徳谷胰岛素自制制剂DSC图谱。
图5为门冬胰岛素自制制剂DSC图谱。
图6为柠檬酸钠缓冲液(pH6.5,50mmol/L)中的DSC对比图谱,
(A):德谷胰岛素自制制剂(B):德谷胰岛素市售制剂(C):EDTA-德谷胰岛素配合液(D):德谷胰岛素原料水溶液。
图7为柠檬酸钠缓冲液(pH6.5,20mmol/L)中的DSC对比图谱,
(A):德谷胰岛素自制制剂(B):德谷胰岛素市售制剂(C):EDTA-德谷胰岛素配合液(D):德谷胰岛素原料水溶液。
具体实施方式
以下以具体的实施例说明本发明的技术方案,但本发明的保护范围不限于所述的实施例范围。所采用的试剂均为市售产品。
实施例1:德谷胰岛素原料的鉴别
德谷胰岛素原料水溶液配制:精确称取德谷胰岛素原料冻干粉,以适量去离子水复溶后配制为0.2mmol/L德谷胰岛素原料水溶液。
差示扫描微量热仪(型号为MicroCal VP-Capillary DSC)检测:以供试品的空白溶液作为参比物,按400μl/孔将样品转移至96孔板中,保护气体为氮气,数据采集软件为MicroCal-Capillary DSC analysis software 2.0,具体参数设置如下表所示:
采用数据采集软件MicroCal-Capillary DSC analysis software 2.0和数据处理软件MicroCalVP-Capillary DSC Automated Analysis-Origin 7对实验结果进行处理,绘制相应的DSC图谱,其中以温度(℃)为横坐标,以样品与参比物间温差为零所需提供的热量Cp[kcal/(mole·℃)]为纵坐标。
实验结果如图1所示,德谷胰岛素原料DSC图谱中无明显吸热峰,故判断胰岛素样品为单体形式。
实施例2:德谷胰岛素市售制剂的鉴别
德谷胰岛素市售制剂溶液配制:精确量取德谷胰岛素市售制剂(Insulin Degludec诺和诺德公司,浓度3.66mg/ml,0.60mmol/L)适量,以其空白辅料溶液稀释配制为0.2mmol/L德谷胰岛素制剂溶液。
按实施例1所述差示扫描微量热仪检测的方法进行检测,并按实施例1所述的数据采集和处理软件进行处理,得到DSC图谱。
实验结果如图2所示,德谷胰岛素市售制剂DSC图谱中出现明显吸热峰,故判断市售徳谷胰岛素在制剂中为双六聚体形式。
实施例3:门冬胰岛素市售制剂的鉴别
门冬胰岛素市售制剂溶液配制:精确量取门冬胰岛素市售制剂(Insulin Aspart Injection诺和诺德公司,浓度为3.66mg/ml,即0.63mmol/L)400μl,作为供试品溶液。
差示扫描微量热仪检测:以供试品的空白溶液作为参比物,按400μl/孔将样品转移至96孔板中,保护气体为氮气,数据采集软件为MicroCal-Capillary DSC analysis software 2.0,具体参数设置如下表所示:
采用数据采集软件MicroCal-Capillary DSC analysis software 2.0和数据处理软件MicroCalVP-Capillary DSC Automated Analysis-Origin 7对实验结果进行处理,绘制相应的DSC图谱,其中以温度(℃)为横坐标,以样品与参比物间温差为零所需提供的热量Cp[kcal/(mole·℃)]为纵坐标。
实验结果如图3所示,门冬胰岛素市售制剂DSC图谱中出现明显吸热峰,故判断市售门冬胰岛素在制剂中为六聚体形式。
实施例4:德谷胰岛素自制制剂的鉴别
德谷胰岛素自制制剂溶液配制:精确量取自制胰岛素制剂(浓度3.66mg/ml)适量,以其空白辅料溶液稀释配制为0.2mmol/L自制胰岛素制剂溶液。
按实施例1所述差示扫描微量热仪检测的方法进行检测,并按实施例1所述的数据采集和处理软件进行处理,得到DSC图谱。
实验结果如图4所示,德谷胰岛素自制制剂DSC图谱中出现明显吸热峰,故判断自制徳谷胰岛素在自制制剂形成双六聚体。
实施例5:门冬胰岛素自制制剂的鉴别
门冬胰岛素自制制剂溶液配制:精确量取门冬胰岛素自制制剂(浓度为3.66mg/ml,即0.63mmol/L)400μl,作为供试品溶液。
按实施例3所述差示扫描微量热仪检测的方法进行检测,并按实施例1所述的数据采集和处理软件进行处理,得到DSC图谱。
实验结果如图5所示,门冬胰岛素自制制剂DSC图谱中出现明显吸热峰,故判断门冬胰岛素在自制制剂中形成六聚体。
实施例6:从胰岛素制剂制备胰岛素单体并鉴别
Tris-HCl缓冲液配制:准确称取Tris-base(Amresco公司)60.55±0.1mg,加入超纯水8ml溶解,用盐酸(国药集团化学试剂有限公司,优级纯)调节pH值至8.0±0.1,加超纯水定容至10ml,配得50mmol/LTris-HCl缓冲液。
EDTA络合剂配制:准确称取乙二胺四乙酸二钠(C10H14N2Na2O8·2H2O,国药集团化学试剂有限公司,分析纯)268mg±0.1g,溶于100ml Tris-HCl缓冲液,涡旋混匀,配得摩尔浓度为7.2mmol/L的EDTA络合剂。
柠檬酸钠缓冲液(pH6.5,50mmol/L)配制:准确称取柠檬酸(国药集团化学试剂有限公司,分析纯)1.050±0.01g,加入超纯水80ml,溶解混匀,定容至100ml,获得50mmol/L柠檬酸溶液;准确称取柠檬酸钠(国药集团化学试剂有限公司,分析纯)1.471±0.01g,加入超纯水80ml,溶解混匀,定容至100ml,获得50mmol/L柠檬酸钠溶液;取约10ml 50mmol/L柠檬酸溶液,缓慢加入50mmol/L柠檬酸钠溶液调节pH到6.5±0.01。
德谷胰岛素原料配制:精确称取德谷胰岛素原料冻干粉,以适量去离子水复溶后配制为0.2mmol/L德谷胰岛素原料水溶液,并以此作为阳性对照品。
德谷胰岛素制剂溶液配制:分别以未添加EDTA的德谷胰岛素自制制剂及德谷胰岛素市售制剂为阴性对照品,并以其空白制剂分别稀释至0.2mmol/L。
EDTA-德谷胰岛素配合液的配制:分别精确移取适量体积的EDTA络合剂及德谷胰岛素自制制剂,确保摩尔比为4:1,涡旋混匀,加入适量的pH6.5,50mmol/L柠檬酸钠缓冲液作为缓冲体系,配得胰岛素终浓度为0.2mmol/L的配合液,室温下涡旋混匀30min。
按实施例1所述差示扫描微量热仪检测的方法进行检测,并按实施例1所述的数据采集和处理软件进行处理,得到DSC图谱。
实验结果如图6所示,德谷胰岛素自制制剂和德谷胰岛素市售制剂的DSC图谱中,均有明显的吸热峰。而EDTA-德谷胰岛素配合液,其DSC图谱中无明显的吸热峰,且与德谷胰岛素原料水溶液的DSC图谱一致,由此可知在EDTA-德谷胰岛素配合液中德谷胰岛素以单体形式存在。在pH6.5,50mmol/L柠檬酸钠缓冲液体系,EDTA可以络合德谷胰岛素制剂中的锌离子,使其从双六聚体结构解聚形成稳定的德谷胰岛素单体。
实施例7:从胰岛素制剂制备胰岛素单体并鉴别
Tris-HCl缓冲液配制:准确称取Tris-base(Amresco公司)60.55±0.1mg,加入超纯水8ml溶解,用盐酸(国药集团化学试剂有限公司,优级纯)调节pH值至8.0±0.1,加超纯水定容至10ml,配得50mmol/LTris-HCl缓冲液。
EDTA络合剂配制:准确称取乙二胺四乙酸二钠(C10H14N2Na2O8·2H2O,国药集团化学试剂有限公司,分析纯)268mg±0.1g,溶于100ml Tris-HCl缓冲液,涡旋混匀,配得摩尔浓度为7.2mmol/L的EDTA络合剂。
柠檬酸钠缓冲液(pH6.5,20mmol/L)配制:准确称取柠檬酸(国药集团化学试剂有限公司,分析纯)420.20±0.1mg,加入超纯水80ml,溶解混匀,定容至100ml,获得20mmol/L柠檬酸溶液;准确称取柠檬酸钠(国药集团化学试剂有限公司,分析纯)588.20±0.1mg,加入超纯水80ml,溶解混匀,定容至100ml,获得20mmol/L柠檬酸钠溶液;取约10ml 20mmol/L柠檬酸溶液,缓慢加入20mmol/L柠檬酸钠溶液调节pH到6.5±0.01。
德谷胰岛素原料配制:精确称取德谷胰岛素原料冻干粉,以适量去离子水复溶后配制为0.2mmol/L德谷胰岛素原料水溶液,并以此作为阳性对照品。
德谷胰岛素制剂溶液配制:分别以未添加EDTA的德谷胰岛素自制制剂及德谷胰岛素市售制剂为阴性对照品,并以其空白制剂分别稀释至0.2mmol/L。
EDTA-德谷胰岛素配合液的配制:分别精确移取适量体积的EDTA络合剂及德谷胰岛素自制制剂,确保摩尔浓度比为4:1,涡旋混匀,加入适量的pH6.5,20mmol/L柠檬酸钠缓冲液作为缓冲体系,配得胰岛素终浓度为0.2mmol/L的配合液,室温下涡旋混匀30min。
按实施例1所述差示扫描微量热仪检测的方法进行检测,并按实施例1所述的数据采集和处理软件进行处理,得到DSC图谱。
实验结果如图7所示,德谷胰岛素自制制剂和德谷胰岛素市售制剂的DSC图谱中,均有明显的吸热峰。而EDTA-德谷胰岛素配合液,其DSC图谱中无明显的吸热峰,且与德谷胰岛素原料水溶液的DSC图谱一致,由此可知在EDTA-德谷胰岛素配合液中德谷胰岛素以单体形式存在。在pH6.5,20mmol/L柠檬酸钠缓冲液体系,EDTA可以络合德谷胰岛素制剂中的锌离子,使其从双六聚体结构解聚形成稳定的德谷胰岛素单体。
Claims (12)
1.一种鉴别胰岛素单体或胰岛素多聚体的方法,其特征在于,使用差示扫描量热法检测含有胰岛素的溶液,并获得相应的DSC图谱,图谱中若出现明显吸热峰则该胰岛素以多聚体形式存在,图谱中若无吸热峰则该胰岛素以单体形式存在。
2.权利要求1的鉴别方法,其中所述胰岛素选自人胰岛素、胰岛素类似物;优选德谷胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素、谷赖胰岛素、甘精胰岛素或地特胰岛素。
3.权利要求1的鉴别方法,其中所述多聚体选自六聚体或双六聚体。
4.权利要求1的鉴别方法,其中所述含有胰岛素的溶液,其特征在于,胰岛素最终浓度为0.05-1.50mmol/L,优选的浓度为0.1-1.0mmol/L,更优选的浓度为0.2-0.7mmol/L。
5.权利要求1的鉴别方法,其中所述含有胰岛素的溶液,进一步包括制备稳定的胰岛素单体溶液,其特征在于,含锌胰岛素制剂中加入EDTA,再加入柠檬酸钠缓冲液作为缓冲体系;上述EDTA和含锌胰岛素制剂的摩尔比范围为10-0.5:1,优选8-2:1,最优选4:1;上述柠檬酸缓冲液的pH范围为5.0-7.0,优选6.5;柠檬酸缓冲液的浓度为10mmol/L-100mmol/L,优选20mmol/L-50mmol/L。
6.权利要求1的鉴别方法,其中所述差示扫描量热法,其特征在于,所用差示扫描微量热仪的仪器型号为MicroCal VP-Capillary DSC;所述检测的起始温度为20℃,终止温度为110℃;升温速率为220℃/Hr.;保护气体为氮气;压力50-60psi。
7.权利要求1的鉴别方法,所述具有明显吸热峰的DSC图谱基本上如图2、图3、图4或图5所示。
8.一种胰岛素多聚体转化为胰岛素单体的方法,其特征在于,含锌胰岛素制剂中加入EDTA络合剂,再加入柠檬酸钠缓冲液作为缓冲体系;上述EDTA和含锌胰岛素制剂的摩尔比范围为10-0.5:1,优选8-2:1,最优选4:1;上述柠檬酸缓冲液的pH范围为5.0-7.0,优选6.5;柠檬酸缓冲液的浓度为10mmol/L-100mmol/L,优选20mmol/L-50mmol/L。
9.权利要求8的方法,其中所述胰岛素选自人胰岛素、胰岛素类似物;优选德谷胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素、谷赖胰岛素、甘精胰岛素或地特胰岛素。
10.权利要求8的方法,其中所述多聚体为六聚体或双六聚体。
11.一种德谷胰岛素双六聚体,其具有基本上如图4所示的DSC图谱。
12.一种门冬胰岛素六聚体,其具有基本上如图5所示的DSC图谱。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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