CN108950064A - 检测眼部微量生物样本中ebv感染的试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明“用于检测眼部微量生物样本EBV感染的试剂盒及方法”，涉及眼部病毒感染的分子检测技术，特别是一种微量生物样本DNA的提取方法，所述微量生物样本指体积不超过10ul‑200ul的液体样本或体积不超过1×1mm的固体类样本。提取的DNA作为PCR检测模版，能够检测到眼部病毒感染情况，准确性达到80％以上，为后续采取合适的治疗手段提供可靠依据，减少治疗手段的盲目性。

Description

检测眼部微量生物样本中EBV感染的试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及病毒感染的分子检测技术，特别是检测眼部微量生物样本中EBV感染的试剂盒和方法。
技术背景
由于眼部结构复杂，且受血脑屏障影响，眼部组织标本的很多检测指标与血液的检测指标相关性很低，大量临床数据研究发现，血液检查不能准确反映眼部的真实病因，特别是感染性眼病的病因；另一方面，眼部标本体积微小，标本种类多种多样，包括各种组织、各种体液(玻璃体、房水、泪液等)、各种膜类(视网膜、角膜内皮等)、多部位分泌物等，眼部液体类样本中病毒DNA含量极低，而固体样本中病毒DNA难以提出，且样本内容物及其复杂，同时受限于取样量极小(其中固体标本一般不超过1mm3；除了泪液，眼部液体标本一般能取的量约为20-100ul，最多不超过200ul))很难满足血液、尿液检验所要求的大体积和均一种类，因此对眼部标本采用常规血液检测方法进行检测，假阴性比例非常高，常常延误治疗。目前尚未见到适合于微量标本，特别是取自眼部的微量标本的病毒检测技术。
EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)的形态与其他疱疹病毒相似，圆形、直径180nm，基本结构含核样物、衣壳和囊膜三部分。EB病毒在人群中广泛感染，根据血清学调查，我国3～5岁儿童EB病毒VCA-lgG抗体阳性率达90％以上，幼儿感染后多数无明显症状，或引起轻症咽炎和上呼吸道感染。青年期发生原发感染，约有50％出现传染性单核细胞增多症。主要通过唾液传播，也可经输血传染。EB病毒在口咽部上皮细胞内增殖，然后感染B淋巴细胞，这些细胞大量进入血液循环而造成全身性感染。并可长期潜伏在人体淋巴组织中，当机体免疫功能低下时，潜伏的EB病毒活化形成得复发感染。
EBV分离培养困难，一般用血清学方法辅助诊断：
(一)EBV特异性抗体的检测用免疫酶染色法或免疫荧光技术检出血清中EBVlgG抗体，可诊断为EBV近期感染。
(二)嗜异性抗体凝集试验主要用于传染性单核白细胞增多症的辅助诊断，患者于发病早期血清可出现lgM型抗体。
在有条件实验室可用核酸杂交和PCR等方法检测细胞内EBV基因组及其表达产物，目前临床上检测病毒感染通常采用血清。
目前做眼部病毒感染的检测，依然采用血液检测，但是大量临床数据研究发现，血液检查不能准确反映眼部的真实病因，特别是感染性眼病的病因，易漏诊误诊。
获得眼部感染的准确检测结果，是后序采取正确治疗手段的前提；但是目前尚缺乏专门针对眼部组织病毒感染的高灵敏检测手段，也未见到以眼部微量样本为标本，采用常规PCR高灵敏度地检测病毒感染的报道。
发明内容
根据上述领域的空白，临床上急需开发一种适合于眼部微量且多样标本的病毒DNA提取方法和高灵敏度病毒检测试剂盒，鉴于此，本发明提供一种适合于眼部各类标本进行EBV病毒检测的方法、荧光探针检测试剂盒及DNA提取方法，本发明请求保护的技术方案如下：
一种微量生物样本DNA模板的制备方法，包括如下步骤：
(1)将待测微量生物样本放入容器中，加入10-30μl蛋白酶K、100-300μl裂解缓冲液AL，于56℃处理至少10分钟；所述微量生物样本指体积不超过10ul-200ul的液体状样本或体积不超过1mm3的固体状样本；
(2)加入与裂解缓冲液等体积的无水乙醇，震荡混匀10-20s,瞬时离心；
(3)将步骤(2)所得的液体放于离心柱中，放入2ml收集管，6000-9000rpm离心0.5-2min；
如果样本量＞140μl，重复上述步骤(3)；
(4)加入300-600μl洗脱缓冲液1,6000-9000rpm，0.5-2min，弃滤液及收集管，换新的收集管；
(5)加入300-600μl洗脱缓冲液2,10000-15000rpm，离心1-5min，弃滤液及收集管；
(6)换新的1.5ml液离心管，空离10000-15000rpm，离心0.5-2min,弃滤液及离心管；
(7)换一新的1.5ml离心管，加入50-100μl洗脱缓冲液3，室温放置0.5-2min，离心6000-9000rpm，0.5-2min得到待测微量生物样本的DNA模板
其中：
所述裂解缓冲液为含10％SDS的Tris饱和酚；
所述洗脱缓冲液1的配方为：饱和酚:氯仿:异戊醇以体积比25:24:1的混合液；
所述洗脱缓冲液2为无水乙醇；
所述洗脱缓冲液3为pH8.0，含1mmol/L EDTA的10mmol/L Tris-HCl溶液。
优选地，所述所述步骤如下：
(1)将待测微量生物样本放入容器中，加入20μl蛋白酶K、200μl裂解缓冲液，于56℃处理至少10分钟；
(2)加入与裂解缓冲液等体积的无水乙醇，震荡混匀10-20s,瞬时离心；
(3)将步骤(2)所得的液体放于离心柱中，放入2ml收集管，6000-9000rpm离心0.5-2min；如果样本量＞140μl，重复上述步骤(3)；
(4)加入500μl洗脱缓冲液1,8000rpm，离心1min，弃滤液及收集管，换新的收集管；
(5)加入500μl洗脱缓冲液2,14000rpm，离心3min，弃滤液及收集管；
(6)换新的1.5ml液离心管，空离14000rpm，离心1min,弃滤液及离心管；
(7)换新的1.5ml离心管，加入50-100μl洗脱缓冲液3，室温放置1min，离心8000rpm，1min得到待测微量生物样本的DNA。
优选地，所述测微量生物样本为液体状样本，步骤(1)中于56℃处理10min之后，再放入70℃环境中处理10min。
优选地，所述测微量生物样本为固体状组织，步骤(1)中于56℃处理5-12个小时。
优选地，所述液体样本指眼部分泌物、房水、泪液和/或玻璃体；所述固体组织指视网膜、角膜内皮、翼状胬肉、结膜、虹膜和/或眼部肿物。
本发明还提供一种用于制备微量生物样本DNA模板的试剂组合，其特征在于，包含如下试剂；
裂解缓冲液：含10％SDS的Tris饱和酚,
洗脱缓冲液1：饱和酚:氯仿:异戊醇以体积比25:24:1的混合液；
洗脱缓冲液2：无水乙醇,
洗脱缓冲液3：pH8.0,含1mmol/LEDTA的10mmol/L Tris-HCl溶液，
所述眼部微量样本指体积不超过10ul-200ul的液体样本或体积不超过1mm3的固体类样本；
所述液体样本指眼部分泌物、房水、泪液和/或玻璃体；
所述固体组织指视网膜、角膜内皮、翼状胬肉、结膜、虹膜和/或眼部肿物。
本发明进一步提供一种用于检测眼部微量样本EBV感染的PCR扩增试剂，其特征在于：包含以下引物探针组，序列如下：
Primer-F：CAACGTGTGCTCTTTCTTCAT
Primer-R：ACCACCAACGGGACTGTCATG
探针：CAACGGGACTGTCATGGAAATT
所述眼部微量样本指体积不超过10ul-200ul的液体样本或体积不超过1mm3的固体类样本；
所述液体样本指眼部分泌物、房水、泪液和/或玻璃体；
所述固体组织指视网膜、角膜内皮、翼状胬肉、结膜、虹膜和/或眼部肿物。
进一步地，用于每个反应的PCR扩增体系含有：
所述PCR扩增试剂在使用前加入眼部微量样本DNA模板及蒸馏水使反应总体积达到20个体积单位。
优选地，所述体积单位可以是1微升、1.5微升、2微升或2.5微升。
进一步地，用于每个反应的PCR扩增体系含有：
本发明另一方面，还提供一种用于通过眼部微量样本检测眼部EBV感染的试剂盒，其特征在于：包含
上述任一用于检测眼部微量样本EBV感染的扩增试剂，
以及上述用于制备用于制备眼部微量样本DNA模板的试剂组，
其中所述眼部微量样本指体积不超过10ul-200ul的液体样本或体积不超过1×1mm的固体类样本。
优选地，所述试剂盒还包含为每个检测反应设置对照反应的对照模版，具体如下：
阳性对照模版:已知EBV病毒DNA片段，用于对检测体系和仪器的质量控制，保证结果的准确性，避免假阴性结果
阳性对照模版:阳性眼部体液；
空白对照模版：超纯水；
阴性对照模版：阴性眼部液体样本；
弱阳性对照模版：阳性眼部体液的稀释液，其临界值设置在△T＝38-40。
本发明的再一方面，提供一种用于通过眼部微量样本检测眼部EBV感染的PCR方法，其特征在于，
包括制备眼部微量样本DNA模板，然后采用任一所述的PCR扩增试剂对所述眼部微量样本DNA模板进行实时定量PCR检测；
所述制备眼部微量样本DNA模板的步骤如下：
(1)将待测微量生物样本放入容器中，加入10-30μl蛋白酶K、100-300μl裂解缓冲液AL，于56℃处理至少10分钟；所述微量生物样本指体积不超过10ul-200ul的液体样本或体积不超过1×1mm的固体类样本；
(2)加入与裂解缓冲液等体积的无水乙醇，震荡混匀10-20s,瞬时离心；
(3)将步骤(2)所得的液体放于离心柱中，放入2ml收集管，6000-9000rpm离心0.5-2min；
如果样本量＞140μl，重复上述步骤(3)；
(4)加入300-600μl洗脱缓冲液1,6000-9000rpm，0.5-2min，弃滤液及收集管，换新的收集管；
(5)加入300-600μl洗脱缓冲液2,10000-15000rpm，离心1-5min，弃滤液及收集管；
(6)换新的1.5ml液离心管，空离10000-15000rpm，离心0.5-2min,弃滤液及离心管；
(7)换一新的1.5ml离心管，加入50-100μl洗脱缓冲液3，室温放置0.5-2min，离心6000-9000rpm，0.5-2min得到待测微量生物样本的DNA模板；
其中：
所述裂解缓冲液为含10％SDS的Tris饱和酚；
所述洗脱缓冲液1的配方为：饱和酚:氯仿:异戊醇以体积比25:24:1的混合液；
所述洗脱缓冲液2为无水乙醇；
所述洗脱缓冲液3为pH8.0，含1mmol/L EDTA的10mmol/L Tris-HCl溶液；
所述眼部微量样本指体积不超过10ul-200ul的液体样本或体积不超过1mm3的固体类样本；所述液体样本指眼部分泌物、房水、泪液和/或玻璃体；所述固体组织指视网膜、角膜内皮、翼状胬肉、结膜、虹膜和/或眼部肿物。
优选地，所述制备眼部微量样本DNA模板的步骤如下：
(1)将待测微量生物样本放入容器中，加入20μl蛋白酶K、200μl裂解缓冲液，于56℃处理至少10分钟；
(2)加入与裂解缓冲液等体积的无水乙醇，震荡混匀10-20s,瞬时离心；
(3)将步骤(2)所得的液体放于离心柱中，放入2ml收集管，6000-9000rpm离心0.5-2min；如果样本量＞140μl，重复上述步骤(3)；
(4)加入500μl洗脱缓冲液1,8000rpm，离心1min，弃滤液及收集管，换新的收集管；
(5)加入500μl洗脱缓冲液2,14000rpm，离心3min，弃滤液及收集管；
(6)换新的1.5ml液离心管，空离14000rpm，离心1min,弃滤液及离心管；
(7)换新的1.5ml离心管，加入50-100μl洗脱缓冲液3，室温放置1min，离心8000rpm，1min得到待测微量生物样本的DNA。
优选地，所述测微量生物样本为液体时，步骤(1)中于56℃处理10min之后，再放入70℃环境中处理10min。
优选地，所述测微量生物样本为固体组织时，步骤(1)中于56℃处理5-12个小时。
优选地，PCR反应的程序如下：
37℃×2min
94℃×2min，上述两个温度和时间循环40次
93℃×15sec，
60℃检测荧光。
本发明一个主要的贡献在于，提出了以取自眼部的微量样本为材料提取DNA制备PCR模板，并采用实时定量PCR(real time-PCR)检测眼部病毒感染。
由于眼部结构复杂，且受血脑屏障影响，眼部组织标本的很多检测指标与血液的检测指标相关性很低，大量临床数据研究发现，血液检查不能准确反映眼部的真实病因，特别是感染性眼病的病因；另一方面，眼部标本体积微小，标本种类多种多样，包括各种组织、各种体液(玻璃体、房水、泪液等)、各种膜类(视网膜、角膜内皮等)、多部位分泌物等，其中固体标本一般不超过1mm3；除了泪液，眼部液体标本一般能取的量约为20-100ul，最多不超过200ul，很难满足血液、尿液检验所要求的大体积和均一种类，因此对眼部标本采用常规血液检测方法进行检测，假阴性比例非常高，常常延误治疗。目前尚未见到适合于微量标本，特别是取自眼部的微量标本的病毒检测技术。
基于此，发明人摸索了适合微量组织样本的DNA提取方法，从提取试剂如蛋白酶K、裂解液、洗脱缓冲液的体积、时间、温度，用量方面进行了摸，提出一种简便易于操作的提取微量组织DNA的方法，该方法适合提取眼部多种临床标本的DNA模版，所得模板用于本发明的PCR检测，能够高灵敏地检测出眼部微量组织中的EBV病毒感染情况。
比如10ul泪液中的DNA，其足够作为4个PCR反应的模版，并且成功地通过泪液检测了解到眼部的病毒感染情况。该方法该DNA提取方法，不仅仅适用于眼部多种微量标本，对于难以获得的其它生物标本，比如取自婴儿的组织样本，微小生物的组织样本，都非常适合，对患者无创或者创伤最小化。
本发明另一个主要的贡献在于，还提供一种用于检测病毒感染，特别是EBV感染的试剂盒，以及提供了检测EBV的PCR扩增试剂，引物探针组，结合上述DNA提取方法，进行检测。实验数据显示，无论是当时采集的临床眼部微量样品，还是采集24-48小时以上从其它城市医院或医院送来的多种眼部微量样品，都能够稳定、灵敏地检测EBV感染情况，方法具有良好的稳定性和可靠性。
鉴于眼部样本的微量、珍贵，为了减少检测过程中由于人为操作失误、试剂污染、失效等原因引起的结果误判以及样本浪费。本发明的试剂盒优选实施例中，为每个检测反应设置了多个对照模版，其中：
阳性对照模版:已知EBV病毒DNA，用于对检测体系和仪器的质量控制，保证结果的准确性，避免假阴性结果
阳性对照模版:阳性眼部体液；
空白对照模版：超纯水；
阴性对照模版：阴性眼部液体样本；
弱阳性对照模版：阳性眼部体液的稀释液，其临界值设置在△T＝38-40。
本发明的再一个主要的贡献在于，提供一种检测微量组织样本中EBV感染的PCR方法，在PCR体系和程序上作出了调整，能够准确检测到微量样本中的EBV感染情况。
附图说明
图1.眼内病毒性角膜内皮炎
图2.是图1所示的眼球经病毒检测确诊后，使用更昔洛韦眼部凝胶，阿昔洛韦口服治疗一周后明显好转，视力恢复。
图3.其中一例待测样本的EBV感染PCR检测结果示意图。
具体实施方式
以下通过具体实施例示例性说明本发明的技术方案，但不作为对本发明专利权范围的限制。
裂解缓冲液：含10％SDS的Tris饱和酚,
洗脱缓冲液1：饱和酚:氯仿:异戊醇以体积比25:24:1的混合液；
洗脱缓冲液2：无水乙醇,
洗脱缓冲液3：pH8.0,含1mmol/LEDTA的10mmol/L Tris-HCl溶液。
对照核酸提取试剂盒：购自达安基因股份有限公司。
对照方法：EBV检测试剂盒：购自达安基因股份有限公司。
实施例1.眼部微量液体待测标本DNA提取方法
材料：
待测标本：采集自收治患者，泪液、房水2、玻璃体。
(1)将采集的待测标本放入容器中，加入10-30μl蛋白酶K、100-300μl裂解缓冲液AL，于56℃处理10分钟以上；
(2)加入与裂解缓冲液等体积的无水乙醇，震荡混匀10-20s,瞬时离心；
(3)将步骤(2)所得的液体放于离心柱中，放入2ml收集管，6000-9000rpm离心0.5-2min；
如果样本量＞140μl，重复步骤(3)；
(4)加入300-600μl洗脱缓冲液1,6000-9000rpm，0.5-2min，弃滤液及收集管，换新的收集管；
(5)加入300-600μl洗脱缓冲液2,10000-15000rpm，离心1-5min，弃滤液及收集管；
(6)换新的1.5ml液离心管，空离10000-15000rpm，离心0.5-2min,弃滤液及离心管；
(7)换一新的1.5ml离心管，加入50-100μl洗脱缓冲液3，室温放置0.5-2min，离心6000-9000rpm，0.5-2min得到待测微量生物样本的DNA模版，最终能获得80-150μlDNA模版。
(8)取1ul样品，通过DNA含量检测仪器nanodrop2000检测OD260、OD280，计算得到DNA浓度为30-70ng/μl)
对照：采用核酸提取试剂盒(购自达安基因。作为对照试剂，根据其说明书操作DNA提取以及PCR扩增。
检测结果
可以看出，采用常规试剂盒提取眼部微量样本，所得DNA纯度显著低于本发明方法所得提取物。特别是对照方法所得提取物的OD280值明显高于本发明方法所得提取物的OD280值。说明本发明提供的DNA提取方法能够有效地将DNA与其它细胞成分及蛋白分离，针对微量样本的特殊性，该步骤的改进是检测方法灵敏度、特异性高的保障。
实施例2.眼部微量固体待测标本DNA提取方法
材料：
待测标本：采集自收治患者，采集视网膜、角膜内皮、翼状胬肉、结膜、虹膜、眼部肿物，采集量1×1mm；
步骤：
(1)将采集的待测标本放入容器中，加入10-30μl蛋白酶K、100-300μl裂解缓冲液AL，于56℃处理6-12小时；
(2)加入与裂解缓冲液等体积的无水乙醇，震荡混匀10-20s,瞬时离心；
(3)将步骤(2)所得的液体放于离心柱中，放入2ml收集管，6000-9000rpm离心0.5-2min；
(4)加入300-600μl洗脱缓冲液1,6000-9000rpm，0.5-2min，弃滤液及收集管，换新的收集管；
(5)加入300-600μl洗脱缓冲液2,10000-15000rpm，离心1-5min，弃滤液及收集管；
(6)换新的1.5ml液离心管，空离10000-15000rpm，离心0.5-2min,弃滤液及离心管；
(7)换一新的1.5ml离心管，加入50-100μl洗脱缓冲液3，室温放置0.5-2min，离心6000-9000rpm，0.5-2min得到待测微量生物样本的DNAμl。
(8)取1ul样品，通过DNA含量检测仪器nanodrop2000检测OD260、OD280。
对照：采用核酸提取试剂盒(购自达安基因。作为对照试剂，根据其说明书操作DNA提取；
检测结果：
可以看出，采用常规试剂盒提取眼部微量样本，所得DNA纯度比本发明方法所提得提取物的低。对照方法提取结膜囊分泌物，眼部肿物所得的提取物的OD280值得明显高于本发明，即提取物中蛋白质或氨基酸含量较高，用作扩增模版，容易影响扩增的灵敏度。而本发明的方法对于取自眼部的各种组织微量样本，都能够获得高纯度模版。
实施例3.用于通过眼部微量样本检测眼部EBV感染的试剂盒
DNA提取试剂组：
裂解缓冲液：含10％SDS的Tris饱和酚,
洗脱缓冲液1：饱和酚:氯仿:异戊醇以体积比25:24:1的混合液；
洗脱缓冲液2：无水乙醇,
洗脱缓冲液3：pH8.0,含1mmol/LEDTA的10mmol/L Tris-HCl溶液。
用于PCR扩增的特异性引物和探针
Primer-F：CAACGTGTGCTCTTTCTTCAT
Primer-R：ACCACCAACGGGACTGTCATG
探针：CAACGGGACTGTCATGGAAATT
实施例4.用于通过眼部微量样本检测眼部EBV感染的试剂盒
DNA提取试剂组：
裂解缓冲液：含10％SDS的Tris饱和酚,
洗脱缓冲液1：饱和酚:氯仿:异戊醇以体积比25:24:1的混合液；
洗脱缓冲液2：无水乙醇,
洗脱缓冲液3：pH8.0,含1mmol/LEDTA的10mmol/L Tris-HCl溶液。
用于PCR扩增的特异性引物和探针：
Primer-F：CAACGTGTGCTCTTTCTTCAT
Primer-R：ACCACCAACGGGACTGTCATG
探针：CAACGGGACTGTCATGGAAATT
PCR扩增对照模版：
阳性对照模版:已知EBV病毒DNA片段作用是对检测体系和仪器的质量控制，保证结果的准确性，避免假阴性结果；
阳性对照模版:阳性眼部液体样本；
弱阳性对照模版：阳性眼部体液的稀释液，其临界值设置在△T＝38-40。
空白对照模版：超纯水；
阴性对照模版：阴性眼部液体样本；
实施例5.标本中EBV病毒的检测方法的建立
标本为临床诊断为血液中感染EBV的患者血清，共5例。
步骤1.采用实施例1中的方法制备样本DNA模板
步骤2.引物探针设计和合成
Primer-F：CAACGTGTGCTCTTTCTTCAT
Primer-R：ACCACCAACGGGACTGTCATG
探针：CAACGGGACTGTCATGGAAATT
步骤3:反应体系配制
设置的对照反应采用的对照模版分别如下：
阳性对照模版:已知EBV病毒DNA对照试剂盒中自带
阳性对照模版:阳性眼部液体样本；
弱阳性对照模版：阳性眼部体液的稀释液，其临界值设置在△T＝38-40。
空白对照模版：超纯水；
阴性对照模版：阴性眼部液体样本；
步骤4.PCR程序：
37℃2min
94℃2min
循环上述两个温度和时间,循环30-40次
93℃15sec,60℃检测荧光
对照方法：
试剂：
对照提取方法：采用核酸提取试剂盒(购自达安基因。作为对照试剂，根据其说明书操作DNA提取。
对照检测方法：以医院常用的血清EBV检测试剂盒作为对照方法，购自达安基因，步骤为试剂盒内附实验步骤。
检测结果如下表：
上面表格中，随着血清标本量递减至10微升，本发明的方法对于液体标本的最低检测限为10ul；可见本发明的检测方法检测准确性为4/5＝0.80,即80％。
对照试剂盒仅仅能检测2ml血清标本量，随着样本量递减，无法获得有意义的检测结果。
同样也进行了“对照提取方法+本发明PCR方法”：结果与“对照提取方法+对照检测方法”的结果一致，说明现有常规方法提取大量样本所得模板液可以进行有效检测，但是当样本量无法达到毫升级别时，提取所得模板液不能进行有效检测。
实施例6临床眼部标本检测验证
DNA来自临床收治患者眼部标本，提取方法见实施例1.
PCR扩增方法同实施例3。
对照方法：医院常用的血清EBV检测试剂盒作为对照方法，购自达安基因，步骤为试剂盒内附的实验操作步骤。
检测结果如下：
图3示意了其中一例阳性样本的检测结果：阳性检测样本与弱阳性对照相近。
实施例7眼部病毒感染和血液中病毒感染有较大差异
样本：来自1名临床收治患者不同阶段的的房水和血液
检测方法：本发明方法：DNA来自临床收治患者的眼部标本和血液，提取方法见实施例1。
对照方法：采用医院常用的血清EBV检测试剂盒作为对照方法，购自达安基因，步骤为试剂盒内附实验步骤。
样本检测结果
第一阶段治疗前：眼部和静脉血均检出EBV阳性；
第二阶段：是根据常规治疗方法，对患者给予全身抗EBV病毒药－1％醋酸泼尼松龙一个月后改用0.1％艾氟治疗两个月之后对眼部标本和静脉血检测，结果显示经治疗后血液中EBV转阴，但是全身抗病毒治疗对眼部EBV感染无效。
第三阶段：三个月之后复查，对眼部标本和静脉血检测，眼部EBV感染转阴。
以上数据显示，眼部感染情况和血液感染并不同步。如果按照目前医院常用检测方法仅仅检测血液感染，根据检测结果对全身整用抗病毒药，对于眼部感染并不管用。因此，准确检出眼部感染是有效治疗的关键。
而采用常规方法和试剂盒检测眼部标本，检测不到眼部EBV感染，也就无法对其眼部进行对应的治疗。
检测后治疗
采样本发明检测方法检测呈EBV感染阳性的患者，对其给予针对EBV的个体化治疗方案，如给予感染部位局部更昔洛韦、阿昔洛韦等抗病毒药物注射，并于给药后定期采集眼部标本进行病毒检测，检测用药后病毒DNA情况，根据检测结果进行用药周期、浓度的调整，直至检测结果转阴，如图1-2所示。
图1.眼内病毒性角膜内皮炎
图2.是图1所示的眼球经病毒检测确诊后为EBV病毒感染，使用更昔洛韦眼部凝胶，阿昔洛韦口服治疗一周后明显好转，视力恢复。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京大学第三医院
<120> 检测眼部微量生物样本中EBV感染的试剂盒和方法
<130> P170784-BYS
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer-F
<400> 1
caacgtgtgc tctttcttca t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer-R
<400> 2
accaccaacg ggactgtcat g 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 探针
<400> 3
caacgggact gtcatggaaa tt 22

Claims (10)

1.一种用于检测眼部微量样本EBV感染的PCR扩增试剂，其特征在于：包含以下引物探针组，序列如下：
Primer-F：CAACGTGTGCTCTTTCTTCAT
Primer-R：ACCACCAACGGGACTGTCATG
探针：CAACGGGACTGTCATGGAAATT
所述眼部微量样本指体积不超过10ul-200ul的液体样本或体积不超过1mm3的固体类样本；
所述液体样本指眼表分泌物、房水、泪液和/或玻璃体；
所述固体组织指视网膜、角膜内皮、翼状胬肉、结膜、虹膜和/或眼部肿物。
2.根据权利要求1所述的PCR扩增试剂,其特征在于，用于每个反应的PCR扩增体系含有：
25mM Mg2+ 2个体积单位 10×buffer 2个体积单位 5mM dNTPs 1个体积单位 0.3-0.5μM上游引物 1个体积单位 0.3-0.5μM上游引物 1个体积单位 0.5μM探针 1个体积单位 Taq酶 0.2个体积单位；
所述PCR扩增试剂在使用前加入眼部微量样本DNA模板及蒸馏水使反应总体积达到20个体积单位。
3.根据权利要求2所述的PCR扩增试剂,其特征在于，用于每个反应的PCR扩增体系含有：
4.根据权利要求2或3所述的PCR扩增试剂,所述体积单位是1微升、1.5微升、2微升或2.5微升。
5.一种用于通过眼部微量样本检测眼部EBV感染的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1-4任一所述的用于检测眼部微量样本EBV感染的扩增试剂，以及用于制备眼部微量样本DNA模板的试剂组，所述试剂组包含如下试剂；
裂解缓冲液：含10％SDS的Tris饱和酚,
洗脱缓冲液1：饱和酚:氯仿:异戊醇以体积比25:24:1的混合液；
洗脱缓冲液2：无水乙醇,
洗脱缓冲液3：pH8.0,含1mmol/LEDTA的10mmol/L Tris-HCl溶液；
所述眼部微量样本指体积不超过10ul-200ul的液体样本或体积不超过1mm3的固体类样本；所述液体样本指眼表分泌物房水、泪液和/或玻璃体；所述固体组织指视网膜、角膜内皮、翼状胬肉、结膜、虹膜和/或眼部肿物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：还包含为每个检测反应设置对照反应的对照模版，具体如下：
阳性对照模版:已知EBV病毒DNA片段；
阳性对照模版:阳性眼部体液；
空白对照模版：超纯水；
阴性对照模版：阴性眼部液体样本；
弱阳性对照模版：阳性眼部体液的稀释液，其临界值设置在△T＝38-40。
7.一种用于通过眼部微量样本检测眼部EBV感染的PCR方法，其特征在于，
包括制备眼部微量样本DNA模板，然后采用权利要求1-4任一所述的PCR扩增试剂对所述眼部微量样本DNA模板进行实时定量PCR检测；
所述制备眼部微量样本DNA模板的步骤如下：
(1)将待测微量生物样本放入容器中，加入10-30μl蛋白酶K、100-300μl裂解缓冲液AL，于56℃处理至少10分钟；所述微量生物样本指体积不超过10ul-200ul的液体样本或体积不超过1×1mm的固体类样本；
(2)加入与裂解缓冲液等体积的无水乙醇，震荡混匀10-20s,瞬时离心；
(3)将步骤(2)所得的液体放于离心柱中，放入2ml收集管，6000-9000rpm离心0.5-2min；如果样本量＞140μl，重复上述步骤(3)；
(4)加入300-600μl洗脱缓冲液1,6000-9000rpm，0.5-2min，弃滤液及收集管，换新的收集管；
(5)加入300-600μl洗脱缓冲液2,10000-15000rpm，离心1-5min，弃滤液及收集管；
(6)换新的1.5ml液离心管，空离10000-15000rpm，离心0.5-2min,弃滤液及离心管；
(7)换一新的1.5ml离心管，加入50-100μl洗脱缓冲液3，室温放置0.5-2min，离心6000-9000rpm，0.5-2min得到待测微量生物样本的DNA模板：
其中：
所述裂解缓冲液为含10％SDS的Tris饱和酚；
所述洗脱缓冲液1的配方为：饱和酚:氯仿:异戊醇以体积比25:24:1的混合液；
所述洗脱缓冲液2为无水乙醇；
所述洗脱缓冲液3为pH8.0，含1mmol/L EDTA的10mmol/L Tris-HCl溶液；
所述眼部微量样本指体积不超过10ul-200ul的液体样本或体积不超过1mm3的固体类样本；所述液体样本指眼部分泌物、房水、泪液和/或玻璃体；所述固体组织指视网膜、角膜内皮、翼状胬肉、结膜、虹膜和/或眼部肿物。
8.根据权利要求7所述的PCR方法，其特征在于，所述制备眼部微量样本DNA模板的步骤如下：
(1)将待测微量生物样本放入容器中，加入20μl蛋白酶K、200μl裂解缓冲液，于56℃处理至少10分钟；
(2)加入与裂解缓冲液等体积的无水乙醇，震荡混匀10-20s,瞬时离心；
(3)将步骤(2)所得的液体放于离心柱中，放入2ml收集管，6000-9000rpm离心0.5-2min；如果样本量＞140μl，重复上述步骤(3)；
(4)加入500μl洗脱缓冲液1,8000rpm，离心1min，弃滤液及收集管，换新的收集管；
(5)加入500μl洗脱缓冲液2,14000rpm，离心3min，弃滤液及收集管；
(6)换新的1.5ml液离心管，空离14000rpm，离心1min,弃滤液及离心管；
(7)换新的1.5ml离心管，加入50-100μl洗脱缓冲液3，室温放置1min，离心8000rpm，1min得到待测微量生物样本的DNA。
9.根据权利要求7或8所述的PCR方法，其特征在于，所述测微量生物样本为液体时，步骤(1)中于56℃处理10min之后，再放入70℃环境中处理10min。
10.根据权利要求7或8所述的PCR方法，其特征在于，所述测微量生物样本为固体组织时，步骤(1)中于56℃处理5-12个小时。
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