CN107428794A - 沉默k‑ras的不对称干扰rna组合物及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于沉默K‑Ras基因表达的新型组合物。更具体地,本发明提供了作为K‑Ras表达抑制剂的新型不对称干扰RNA分子,和药物组合物及其在治疗哺乳动物癌症或相关疾病中的用途。
Description
技术领域
本发明通常涉及用于沉默K-Ras基因表达的组合物。更具体地,本发明涉及作为K-Ras表达抑制剂的新型不对称干扰RNA分子,和药物组合物及其在治疗哺乳动物癌症或相关疾病中的用途。
背景技术
通过使用小或短干扰RNA(siRNA)经由RNAi(RNA干扰)实现基因沉默已作为治疗工具出现。然而,除突出的递送问题外,基于RNAi药物的开发还面临着如下挑战:siRNA的有限效能、siRNA的非特异性作用,例如,干扰素样应答和有义链介导的脱靶基因沉默、以及与siRNA合成相关的高得惊人的或高昂的成本。对于哺乳动物细胞中大多数基因而言,siRNA的基因沉默效能局限在约50%或更低。这些分子的制造是昂贵的(比制造反义脱氧核苷酸昂贵得多)、低效的、且需要化学修饰。最后,观察到胞外施用合成的siRNA可触发干扰素样应答,这给基于RNAi的研究和基于RNAi的治疗开发增加了显著的障碍。
K-Ras蛋白是一种分子开关,在正常状态下调节细胞生长和细胞分裂。该蛋白的突变通过连续的细胞生长导致肿瘤的形成。约30%的人类癌症具有突变的Ras蛋白,其由于降低的GTP酶活性和对GAP作用的不敏感性而组成型结合GTP。Ras在许多癌症中也是重要因子,在这些癌症中,其没有突变而是通过其他信号转导元件的不当活性而功能上活化。所有肿瘤细胞的绝大部分中都发现突变的K-Ras蛋白。K-Ras蛋白居于利害的核心地位。在许多人类癌症中,致癌突变的K-Ras的鉴定,引起了主要努力去靶向该组成型活化蛋白作为合理的和选择的治疗。虽然对活性剂有数十年的研究,但开发K-Ras治疗抑制剂仍有重大挑战。
已经从具有多种肿瘤类型的癌症患者中分离出高度致瘤性和转移性的高度恶性癌细胞,发现其具有高的干性特性,被称为癌症干细胞(CSCs)。认为这些高干性的癌细胞基本上与癌症转移和复发有关。许多干性基因,例如β-catenin、Nanog、Sox2、Oct3/4与癌细胞干性有关。然而,癌基因(例如K-Ras)在癌细胞干性中的作用未知。
因此,需要开发具有更好效能和效力、作用启动快速、更持久和更少不良副作用的新型组合物和在诊断患有癌症的受试者中用于选择性沉默K-Ras基因表达或K-Ras活性的方法。
发明概述
为了阐明K-Ras在维持癌细胞干性中的作用,本发明人采用不对称沉默RNA技术(aiRNA),其可高效且精确沉默靶基因。此外,aiRNA技术可容易地应用于CSCs。本发明惊奇地发现,CSCs不仅依赖于K-Ras的活化突变、或活化Ras通路的下游调节子,而且具有扩增的突变的K-Ras的CSCs变得对K-Ras沉默高度敏感。进一步地,本发明人惊奇地发现,突变的K-Ras的DNA拷贝数直接预示着癌症干细胞对K-Ras沉默的敏感性,这表明扩增的突变的K-Ras是维持恶性和癌细胞干性所需的,这对于了解癌基因和癌细胞干性之间的联系以及开发癌症干细胞抑制剂具有重要的意义。
本发明提供了组合物和使用一类可在哺乳动物细胞中诱导有效的基因沉默的小双链RNA的方法,在此称为不对称干扰RNAs(aiRNA)。对aiRNA的描述,例如,在PCT公开号WO2009/029688中的内容,其完整内容引入本文作为参考。该类RNAi-诱导物通过两条RNA链的长度不对称来识别。该结构设计不仅在实现基因沉默方面是功能上有效的,而且提供了优于现有技术siRNA的几个优点。在这些优点中,aiRNA可具有比其他siRNA长度短得多的RNA双链体结构,其将减少合成成本且消除/减少长度依赖性的非特异性干扰素样应答的触发。此外,aiRNA结构的不对称还消除和/或减少有义链介导的脱靶效应。更进一步地,aiRNA在诱导基因沉默方面比siRNA更有效、有力、作用启动更快和更持久。aiRNA可以用于目前siRNA或shRNA正在应用或考虑应用的所有领域,包括生物学研究、生物技术和医药工业中的R&D研究和基于RNAi的治疗。
双链体RNA分子包括具有18-23个核苷酸长度的第一链和具有12-17个核苷酸长度的第二链,其中第二链与第一链基本上互补,且与第一链形成双链区,其中第一链具有1-9个核苷酸的3’-突出端和0-8个核苷酸的5’-突出端,其中所述双链体RNA分子能够在真核细胞中实现选择性K-Ras基因沉默。在一些实施方案中,第一链包括与靶K-Ras mRNA序列基本上互补的序列。在进一步的实施方案中,第一链包括与靶K-Ras mRNA序列至少70%互补的序列。在另一个实施方案中,真核细胞是哺乳动物细胞或禽类细胞。
在一些实施方案中,靶K-Ras mRNA序列是人K-Ras靶序列。在一些实施方案中,靶K-Ras mRNA序列是人K-Ras靶序列,其至少选自部分GenBank Accession No.NM_004985中显示的部分序列,以SEQ ID NO:1显示如下:
在一些实施方案中,靶K-Ras mRNA序列是下表1中显示的靶序列。
表1.靶K-Ras序列
在一些实施方案中,RNA双链体分子,本文也指不对称干扰RNA分子或aiRNA分子,包括选自下表2中显示的有义链序列、反义链序列或有义链序列与反义链序列的组合。
表2.
在一些实施方案中,RNA双链体分子(aiRNA)包括选自SEQ ID NOs:320-637的有义链序列。在一些实施方案中,RNA双链体分子(aiRNA)包括选自SEQ ID NOs:638-955的反义链序列。在一些实施方案中,RNA双链体分子(aiRNA)包括选自SEQ ID NOs:320-637的有义链序列和选自SEQ ID NOs:638-955的反义链序列。
在一些实施方案中,RNA双链体分子(aiRNA)包括与选自SEQ ID NOs:320-637的序列至少,例如,50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多相同的有义链序列。在一些实施方案中,RNA双链体分子(aiRNA)包括与选自SEQ ID NOs:638-955的序列至少,例如,50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多相同的反义链序列。在一些实施方案中,RNA双链体分子(aiRNA)包括与选自SEQ ID NOs:320-637的序列至少,例如,50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多相同的有义链序列和与选自SEQ ID NOs:638-955的序列至少,例如,50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多相同的反义链序列。
在一些实施方案中,5’突出端序列的至少一个核苷酸选自A、U和dT。
在一些实施方案中,双链区GC含量是20%-70%。
在一些实施方案中,第一链具有19-22个核苷酸的长度。
在一些实施方案中,第一链具有21个核苷酸的长度。在进一步的实施方案中,第二链具有14-16个核苷酸的长度。
在一些实施方案中,第一链具有21个核苷酸的长度,且第二链具有15个核苷酸的长度。在进一步的实施方案中,第一链具有2-4个核苷酸的3’-突出端。在更进一步的实施方案中,第一链具有3个核苷酸的3’-突出端。
在一些实施方案中,双链体RNA分子包含至少一个经修饰的核苷酸或其类似物。在进一步的实施方案中,至少一个经修饰的核苷酸或其类似物是糖、主链、和/或碱基经修饰的核糖核苷酸。在更进一步的实施方案中,主链经修饰的核糖核苷酸在与另一个核糖核苷酸的磷酸二酯键连接中具有修饰。在一些实施方案中,磷酸二酯键连接经修饰包含氮或硫杂原子中的至少一种。在另一个实施方案中,核苷酸类似物是包含硫代磷酸酯基团的主链经修饰的核糖核苷酸。
在一些实施方案中,至少一个经修饰的核苷酸或其类似物是稀有碱基或经修饰的碱基。在另一个实施方案中,至少一个经修饰的核苷酸或其类似物包括肌苷或三苯甲基化碱基。
在进一步的实施方案中,核苷酸类似物是糖经修饰的核糖核苷酸,其中2’-OH基团由选自H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基团替代,其中每个R独立地是C1-C6烷基、链烯基或炔基、且卤素是F、Cl、Br或I。
在一些实施方案中,第一链包括至少一个脱氧核苷酸。在进一步的实施方案中,该至少一个脱氧核苷酸在选自3’-突出端、5’-突出端和双链区的一个或多个区域中。在另一个实施方案中,第二链包括至少一个脱氧核苷酸。
本发明还提供了在细胞或生物中调节K-Ras表达的方法,例如,沉默K-Ras表达或减少K-Ras表达,其包括步骤:在可发生选择性K-Ras基因沉默的条件下,使所述细胞或生物与本公开的不对称双链体RNA分子接触,介导由针对具有与该双链RNA基本上对应的序列部分的K-Ras或核酸的该双链体RNA分子实现的选择性K-Ras基因沉默。在进一步的实施方案中,所述接触步骤包括步骤:将所述双链体RNA分子引入在培养中的或在生物体中的靶细胞内,在所述靶细胞中可以发生选择性K-Ras沉默。。在更进一步的实施方案中,该引入步骤选自转染、脂转染、电穿孔、感染、注射、经口施用、吸入、局部和区域施用。在另一个实施方案中,该引入步骤包括使用药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂,其选自药学载体、正电荷载体、脂质体、蛋白质载体、聚合物、纳米颗粒、纳米乳液、脂质和类脂。
在一些实施方案中,该调节方法用于确定细胞或生物体中基因的功能或效用。
在一些实施方案中,该调节方法用于治疗或预防疾病或非期望状况。在一些实施方案中,疾病或非期望状况是癌症,例如,胃癌。
本公开提供靶向K-Ras来治疗、预防、延迟胃癌进展或改善胃癌症状的组合物和方法。在一些实施方案中,该方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的本公开的双链体RNA分子。在一些实施方案中,受试者是人。在一些实施方案中,受试者患有胃癌。在一些实施方案中,受试者被诊断为胃癌。在一些实施方案中,受试者倾向于有胃癌。
本公开还提供靶向K-Ras以抑制癌症干细胞存活和/或增殖的组合物和方法。在一些实施方案中,该方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的本公开的双链体RNA分子。在一些实施方案中,受试者是人。在一些实施方案中,受试者患有胃癌。在一些实施方案中,受试者被诊断为胃癌。在一些实施方案中,受试者倾向于有胃癌。
本公开还提供靶向K-Ras以抑制CSCs的存活和/或增殖来治疗、预防、延迟胃癌进展或改善胃癌症状的组合物和方法。在一些实施方案中,该方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的本公开的双链体RNA分子。在一些实施方案中,受试者是人。在一些实施方案中,受试者患有胃癌。在一些实施方案中,受试者被诊断为胃癌。在一些实施方案中,受试者倾向于有胃癌。
本公开还提供在选定患者人群中治疗癌症的方法,该方法包括步骤:(a)检测从诊断患有癌症的患者候选者中获取的生物样本中突变K-Ras基因扩增的水平;(b)确定该患者候选者的突变K-Ras基因扩增的水平高于基准水平;和(c)给该患者候选者施用双链体RNA分子,其包括具有18-23个核苷酸长度的核苷酸序列的第一链,其中第一链的核苷酸序列与靶K-Ras mRNA序列基本上互补,和具有12-17个核苷酸长度的核苷酸序列的第二链,其中第二链与第一链基本上互补,且与第一链形成双链区,其中第一链具有1-9个核苷酸的3’-突出端和0-8个核苷酸的5’-突出端,其中所述双链体RNA分子能实现选择性K-Ras基因沉默。
在一些实施方案中,步骤(a)、(b)和(c)可由一位或多位实施者实施。
在一些实施方案中,患者候选者的突变K-Ras基因扩增的水平如果相比对照患者(对根据本发明所保护的治疗方法无良好响应)高出至少,例如2倍,则被认为是高于基准水平。同样地,基于本发明公开的数据,熟练的医生可确定DNA拷贝数的最优基准水平是相比非响应患者而言高出,例如,约3倍或4倍。
本公开还提供在选定患者人群中治疗癌症的方法,该方法包括步骤:(a)检测从诊断患有癌症的患者候选者中获取的生物样本中突变K-Ras蛋白的表达水平;(b)确定该患者候选者的突变K-Ras蛋白的表达水平高于基准水平;和(c)给该患者候选者施用双链体RNA分子,其包括具有18-23个核苷酸长度的核苷酸序列的第一链,其中第一链的核苷酸序列与靶K-Ras mRNA序列基本上互补,和具有12-17个核苷酸长度的核苷酸序列的第二链,其中第二链与第一链基本上互补,且与第一链形成双链区,其中第一链具有1-9个核苷酸的3’-突出端和0-8个核苷酸的5’-突出端,其中所述双链体RNA分子能实现选择性K-Ras基因沉默。
在一些实施方案中,步骤(a)、(b)和(c)可由一位或多位实施者实施。
在一些实施方案中,患者候选者的突变K-Ras蛋白表达水平如果相比对照患者(对根据本发明所保护的治疗方法无良好响应)高出至少,例如2倍,则被认为是高于基准水平。同样地,基于本发明公开的数据,熟练的医生可确定突变K-Ras蛋白表达的最优基准水平是相比非响应患者而言高出,例如,约3倍或4倍。
本发明进一步提供一种试剂盒。该试剂盒包括具有18-23个核苷酸长度的第一RAN链和具有12-17个核苷酸长度的第二RNA链,其中第二链与第一链基本上互补,且能与第一链形成双链体RNA分子,其中该双链体RNA分子具有1-9个核苷酸的3’-突出端和0-8个核苷酸的5’-突出端,其中所述双链体RNA分子能实现K-Ras特异的基因沉默。
本发明还提供制备双链体RNA分子的方法。该方法包括步骤:合成第一链和第二链、在形成能实现序列特异的基因沉默的双链体RNA分子的条件下,组合所合成的链。在一些实施方案中,该方法进一步包括在合成步骤过程中、在合成后且在组合步骤前、或组合步骤后将至少一个经修饰的核苷酸或其类似物引入该双链体RNA分子内的步骤。在另一个实施方案中,该RNA链是化学合成的或生物合成的。
本发明提供一种表达载体。该载体包括与至少一个表达控制序列可操作地连接的编码双链体RNA分子的一个或多个核酸。在一些实施方案中,该载体包括与第一表达控制序列可操作地连接的编码第一链的第一核酸,和与第二表达控制序列可操作地连接的编码第二链的第二核酸。在另一个实施方案中,该载体是病毒、真核表达载体或细菌表达载体。
本发明还提供一种细胞。在一些实施方案中,该细胞包括载体。在另一个实施方案中,该细胞包括双链体RNA分子。在进一步的实施方案中,该细胞是哺乳动物细胞、禽类细胞或细菌细胞。
调节方法还可以用于体外或体内研究药物靶点。本发明提供包括双链体RNA分子的试剂。
本发明还提供制备本公开双链体RNA分子的方法,包括步骤:合成第一链和第二链、在形成能实现K-Ras序列特异的基因沉默的双链体RNA分子的条件下组合合成的链。在一些实施方案中,该RNA链是化学合成或生物合成的。在另一个实施方案中,该第一链和第二链是分开或同时合成的。
在一些实施方案中,该方法进一步包括在合成步骤过程中、在合成后且在组合步骤前、或组合步骤后,将至少一个经修饰的核苷酸或其类似物引入该双链体RNA分子内的步骤。
本发明进一步提供药物组合物。该药物组合物包括至少一种双链体RNA分子作为活性剂和一种或多种载体,该载体选自药学载体、正电荷载体、脂质体、蛋白质载体、聚合物、纳米颗粒、胆固醇、脂质和类脂。
从本文提供的其他描述中,包括不同实施例,本发明的其他特征和优点是显而易见的。所提供的实施例举例说明在实践本发明中有用的不同组分和方法。实施例不限制请求保护的本发明。基于本公开的内容,本领域技术人员可以鉴定和采用对于实践本发明有用的其他组分和方法。
附图简述
图1(A)显示体外研究使用aiRNA ID NO:21(“aiK-Ras#1”)靶向K-Ras靶SEQ IDNO:22来确定aiK-Ras#1的IC50。
图1(B)显示体外研究使用aiRNA ID NO:142(“aiK-Ras#2”)靶向K-Ras靶SEQ IDNO:142来确定aiK-Ras#2的IC50。
图2(A)显示通过northern印迹分析检测装载在RISC中的siRNA和aiRNA。
图2(B)显示检测TLR3/aiRNA或siRNA的结合。
图2(C)显示抗-HA抗体免疫共沉淀TLR3/RNA复合物。
图3(A)显示转染了aiK-Ras#1或aiK-Ras#2的AGS和DLD1的克隆形成试验。
图3(B)显示免疫印迹分析AGS和DLD1的裂解物。
图3(C)显示在大孔板(large cell panel)中克隆形成试验的结果。
图4显示免疫印迹分析K-Ras和EGFR-RAS的通路分子。
图5(A)显示在K-Ras突变体大孔板(large cell panel)中,aiK-Ras敏感性与K-Ras扩增相关。
图5(B)显示在K-Ras突变体大孔板(large cell panel)中,aiK-Ras敏感性与K-Ras扩增相关。
图6(A)显示CSC培养中干性基因的表达。
图6(B)显示在多种细胞系中成球试验的结果。
图6(C)显示具有aiK-Ras#1和aiK-Ras#2的AGS和DLD1细胞CD44-高的细胞群缺失。
图7(A)显示转染了aiK-Ras的癌细胞中CSC相关基因的热图。
图7(B)显示通过蛋白质印迹证实Notch信号的下调。
发明详述
本发明涉及在真核细胞中能实现选择性K-Ras基因沉默的不对称双链体RNA分子。在一些实施方案中,该双链体RNA分子包括第一链和第二链。第一链长于第二链。第二链与第一链基本上互补,且与第一链形成双链区。
K-Ras蛋白是一种分子开关,在正常状态下调节细胞生长和细胞分裂。该蛋白的突变通过连续的细胞生长导致肿瘤的形成。约30%的人类癌症具有突变的Ras蛋白,其由于降低的GTP酶活性和对GAP作用的不敏感性而组成型结合GTP。Ras在许多癌症中也是重要因子,在这些癌症中,其没有突变而是通过其他信号转导元件的不当活性而功能上活化。所有肿瘤细胞的绝大部分中都发现突变的K-Ras蛋白。K-Ras蛋白居于厉害的核心地位。在许多人类癌症中,致癌突变的K-Ras的鉴定,引起了主要努力去靶向该组成型活化蛋白作为合理的和选择的治疗。虽然对活性剂有数十年的研究,但开发K-Ras治疗抑制剂仍有重大挑战。
本文提供的组合物和方法用于阐明K-Ras在癌症发展和维持中的作用。该组合物和方法使用不对称干扰RNAs(aiRNAs)能高效沉默靶基因,导致持久的敲低、减少脱靶效应、和研究在几种人类癌细胞系中细胞存活与K-Ras的依赖关系。令我们十分惊讶的是,我们发现与其他癌症类型相比,K-Ras对胃癌的维持扮演着更重要的角色。与其他癌症类型相比,发现aiRNA-诱导的K-Ras沉默抑制胃癌细胞增殖和胃癌细胞形成克隆的能力。大量证据表明癌症干细胞(CSCs)与预后、转移和复发高度相关。为了研究K-Ras对CSCs的作用,我们在体外CSC培养系统中检测了K-Ras基因沉默作用。结果是,与其他癌症类型相比,抑制K-Ras减少了源于胃CSCs的克隆,改变了“干性”相关的许多基因的基因表达模式。这些研究的结果表明,胃癌和胃CSCs受K-Ras致癌基因的影响,且Kras aiRNAs是治疗胃癌的很有希望的治疗候选物。因此,本公开提供靶向K-Ras来治疗、预防、延迟胃癌进展或改善胃癌症状的组合物和方法。本发明还提供靶向K-Ras以抑制CSCs存活和/或增殖的组合物和方法,以及靶向K-Ras以抑制CSCs的存活和/或增殖来治疗、预防、延迟胃癌进展或改善胃癌症状的组合物和方法。在一些实施方案中,该方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的本公开的双链体RNA分子。在一些实施方案中,该受试者是人。在一些实施方案中,该受试者患有胃癌。在一些实施方案中,该受试者被诊断为胃癌。在一些实施方案中,该受试者倾向于有胃癌。
在一些实施方案中,本发明组合物和方法中使用的双链体RNA分子具有一个1-8个核苷酸的3’-突出端和一个1-8个核苷酸的5’-突出端,一个1-10个核苷酸的3’-突出端和一个平末端,或一个1-10个核苷酸的5’-突出端和一个平末端。在另一个实施方案中,该双链体RNA分子具有两个1-8个核苷酸的5’-突出端或两个1-10个核苷酸的3’-突出端。在进一步的实施方案中,第一链具有1-8个核苷酸的3’-突出端和1-8个核苷酸的5’-突出端。在更进一步的实施方案中,该双链体RNA分子是分离的双链体RNA分子。
在一些实施方案中,第一链具有1-10个核苷酸的3’-突出端和1-10个核苷酸的5’-突出端或5’-平末端。在另一个实施方案中,第一链具有1-10个核苷酸的3’-突出端和1-10个核苷酸的5’-突出端。在可选的实施方案中,第一链具有1-10个核苷酸的3’-突出端和5’-平末端。
在一些实施方案中,第一链具有5-100个核苷酸、12-30个核苷酸、15-28个核苷酸、18-27个核苷酸、19-23个核苷酸、20-22个核苷酸或21个核苷酸的长度。
在另一个实施方案中,第二链具有3-30个核苷酸、12-26个核苷酸、13-20个核苷酸、14-23个核苷酸、14或15个核苷酸的长度。
在一些实施方案中,第一链具有5-100个核苷酸长度,第二链具有3-30个核苷酸长度;或第一链具有10-30个核苷酸长度,第二链具有3-29个核苷酸长度;或第一链具有12-30个核苷酸长度,第二链具有10-26个核苷酸长度;或第一链具有15-28个核苷酸长度,第二链具有12-26个核苷酸长度;或第一链具有19-27个核苷酸长度,第二链具有14-23个核苷酸长度;或第一链具有20-22个核苷酸长度,第二链具有14-15个核苷酸长度。在进一步的实施方案中,第一链具有21个核苷酸长度,第二链具有13-20个核苷酸、14-19个核苷酸、14-17个核苷酸、14或15个核苷酸长度。
在一些实施方案中,第一链比第二链长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。
在一些实施方案中,双链体RNA分子进一步包括1-10个未配对或错配的核苷酸。在进一步的实施方案中,未配对或错配的核苷酸在3’凹缺末端处或附近。在可选的实施方案中,未配对或错配的核苷酸在5’凹缺末端处或附近。在可选的实施方案中,未配对或错配的核苷酸在双链区处。在另一个实施方案中,未配对或错配的核苷酸序列具有1-5个核苷酸长度。在更进一步的实施方案中,未配对或错配的核苷酸形成环结构。
在一些实施方案中,第一链或第二链包含至少一个切口或由2个核苷酸片段形成。
在一些实施方案中,基因沉默通过RNA干扰、翻译调节和DNA表观遗传调节中的一种或两种或全部来达到。
在一些实施方案中,被沉默的靶K-Ras mRNA序列是表1中所示的靶序列。
在一些实施方案中,RNA双链体分子,本文也指不对称干扰RNA分子或aiRNA分子,包括选自表2中所示的有义链序列、反义链序列或有义链序列与反义链序列的组合。
在一些实施方案中,RNA双链体分子(aiRNA)包括选自SEQ ID NOs:320-637的有义链序列。在一些实施方案中,RNA双链体分子(aiRNA)包括选自SEQ ID NOs:638-955的反义链序列。在一些实施方案中,RNA双链体分子包括选自SEQ ID NOs:320-637的有义链序列和选自SEQ ID NOs:638-955的反义链序列。
在一些实施方案中,RNA双链体分子(aiRNA)包括与选自SEQ ID NOs:320-637的序列至少,例如,50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多相同的有义链序列。在一些实施方案中,RNA双链体分子(aiRNA)包括与选自SEQ ID NOs:638-955的序列至少,例如,50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多相同的反义链序列。在一些实施方案中,RNA双链体分子(aiRNA)包括与选自SEQ ID NOs:320-637的序列至少,例如,50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多相同的有义链序列和与选自SEQ ID NOs:638-955的序列至少,例如,50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多相同的反义链序列。
在说明书和权利要求中,除非上下文另有明确说明,单数形式“a”、“an”和“the”包括对复数的提及。例如,术语“细胞”包括多个细胞,包括其混合物。
如本文所使用的,“双链RNA”、“双链体RNA”或“RNA双链体”指具有2条链并且具有至少一个双链区的RNA,其包括在双链区内或在2个相邻的双链区之间具有至少一个缺口、切口、凸起和/或鼓泡的RNA分子。如果一条链在2个双链区之间具有缺口或未配对的核苷酸单链区,那么该链视为具有多个片段。如本文所使用的,双链RNA可以在任一末端或2个末端上具有末端突出。在一些实施方案中,双链体RNA的两条链可以通过某些化学接头连接。
如本文所使用的,“反义链”指与靶信使RNA具有基本上的序列互补性的RNA链。
本文所用的术语“分离的”或“纯化的”指物质基本上或实质上不含在其天然状态下与其正常相伴的成分。纯度和均质性一般利用分析化学技术来确定,例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱。
如本文所使用的,“调节”及其语法等同体指增加或减少(例如,沉默),换言之,上调或下调。如本文所使用的,“基因沉默”指基因表达的减少,并且可以指靶基因的基因表达减少约,例如,20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。
如本文所使用的,术语“受试者”指接受特定治疗的任何的动物(例如,哺乳动物),包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿类动物等。在某些情况下,术语“受试者”和“患者”就人类受试者而言在本文可互换使用。
本文所用的术语如“治疗”或“缓解”指(1)治愈、减缓、减轻所诊断病情或疾病的症状,和/或中断其进展的治疗性措施,和(2)预防或减缓所靶向病情或疾病发展的防范性或预防性措施。因此,需要治疗的那些包括已经患有疾病的那些;易患疾病的那些;以及欲预防疾病的那些。如果受试者显示出以下一种或多种状况,则受试者是根据本发明的方法成功“治疗”的:癌细胞数量上减少或完全消失;肿瘤大小减小;抑制或不存在癌细胞向周围器官的浸润、包括癌向软组织和骨的扩散;抑制或不存在肿瘤的转移;抑制或不存在肿瘤的生长;与具体癌症相关的一种或多种症状的减轻;发病率和死亡率的减少;和生活质量的提高。
如本文所使用的,当用在生物活性的语境中时,术语“抑制”及其语法等同体是指生物活性的下调,其可减小或消除所靶向的功能,例如蛋白质的产生或分子的磷酸化。当用在生物体(包括细胞)的语境中,该术语指生物体生物活性的下调,其可减小或消除所靶向的功能,例如蛋白质的产生或分子的磷酸化。在特定的实施方案中,抑制可以指所靶向的活性减少约,例如,20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。当用于病症或疾病的语境中时,该术语指成功地防止症状发作、缓解症状或消除疾病、病情或病症。
如本文所使用的,术语“基本上互补”指,2个核酸之间的碱基配对双链区而非任何单链区(例如末端突出端或2个双链区之间的缺口区)中的互补。互补无需是完全的;例如,在2个核酸之间可以存在任何数目的碱基对错配。然而,如果错配数目大到即使在最低严格杂交条件下也无法发生杂交时,该序列不是基本上互补序列。当2个序列在文中指作“基本上互补”,其意味着这两个序列彼此充分互补以在所选反应条件下杂交。核酸的互补性和足以达到特异性杂交的严格性之间的关系是本领域公知的。2条基本上互补的链可以是,例如,完全互补或可以包含1个至多个错配,只要杂交条件足以允许,例如区分配对序列和非配对序列即可。因此,基本上互补的序列可以指双链区中具有,例如,100%、95%、90%、80%、75%、70%、60%、50%或更少或之间的任何百分数的碱基对互补性的序列。
RNA干扰(缩写为RNAi)是由双链RNA(dsRNA)诱导的用于靶向破坏单链RNA(ssRNA)的细胞过程。该ssRNA是基因转录物,例如信使RNA(mRNA)。RNAi是一种转录后基因沉默形式,其中dsRNA可以特异地干扰与dsRNA具有互补序列的基因的表达。dsRNA的反义RNA链靶向互补基因转录物,例如信使RNA(mRNA),以实现由核糖核酸酶的切割。
在RNAi过程中,长dsRNA通过核糖核酸酶蛋白Dicer加工成称为小干扰RNA(siRNA)的短形式。siRNA分离成向导(或反义)链和随从(或有义)链,向导链整合到RNA诱导沉默复合体(RISC)内,其是含有核糖核酸酶的多蛋白复合体。该复合体随后特异性靶向互补基因转录物进行破坏。
已证实RNAi是许多真核生物中的常见细胞过程。RISC以及Dicer在真核生物界中是保守的。RNAi被认为在针对病毒和其他外来遗传物质的免疫应答中起作用。
小干扰RNAs(siRNAs)是一类短的双链RNA(dsRNA)分子,发挥多种生物学作用。最显著地,其参与RNA干扰(RNAi)途径,在此途径中siRNA干扰特定基因的表达。此外,siRNA还在例如抗病毒机制或基因组的染色质结构成形等过程中起作用。在一些实施方案中,siRNA具有短的(19-21nt)双链RNA(dsRNA)区以及2-3个核苷酸的3’突出端和5’-磷酸和3’-羟基末端。
Dicer是RNA酶III核糖核酸酶家族成员。Dicer将长双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)前体和短发卡RNA(shRNA)切割成约20-25个核苷酸长度的、通常在3’末端上具有2个碱基突出的短双链RNA片段,称为小干扰RNA(siRNA)。Dicer催化RNA干扰途径的第一个步骤,起始RNA诱导沉默复合体(RISC)的形成,该复合体的催化组分argonaute是能够降解信使RNA(mRNA)的核酸内切酶,其中该信使RNA的序列与siRNA向导链的序列互补。
如本文所使用的,有效的siRNA序列是在触发RNAi以降解靶基因的转录物方面有效的siRNA。并非与靶基因互补的每一个siRNA都可以有效地触发RNAi降解基因的转录物。事实上,通常需要费时的筛选以确定有效的siRNA序列。在一些实施方案中,该有效的siRNA序列能够使靶基因表达减少90%以上、80%以上、70%以上、60%以上、50%以上、40%以上或30%以上。
本发明使用称为不对称干扰RNA(aiRNA)的结构支架,其可用于实现siRNA样结果,还可调节miRNA途经活性,这最初在PCT公开文本WO 2009/029688和WO 2009/029690中详细描述,其完整内容引入本文作为参考。
aiRNA的结构设计不仅在实现基因调节方面是功能上有效的,还提供超过现有技术RNAi调节剂(主要是反义,siRNA)的几个优点。在这些优点中,aiRNA具有可以比现有siRNA构建体长度短得多的RNA双链体结构,其将减少合成成本和消除或减少长度依赖性的、来自宿主细胞的非特异干扰素样免疫应答的触发。aiRNA随从链的较短长度还将消除或减少RISC中的随从链的非故意掺入,从而减少miRNA介导的基因沉默中观察到的脱靶效应。aiRNA可用于目前基于miRNA的技术正在应用或考虑应用的所有领域,包括生物学研究、生物技术和医药工业中的R&D研究、以及基于miRNA的诊断和治疗。
在一些实施方案中,第一链包括与靶K-Ras mRNA序列基本上互补的序列。在另一个实施方案中,第二链包括与靶K-Ras mRNA序列基本上互补的序列。
本发明与能够实现K-Ras基因沉默的不对称双链RNA分子有关。在一些实施方案中,本发明的RNA分子包括第一链和第二链,其中第二链与第一链基本上互补或部分互补,并且第一链和第二链形成至少一个双链区,其中第一链长于第二链(长度不对称)。本发明的RNA分子具有至少一个双链区和两个独立选自5’-突出端、3’-突出端和平末端的末端。
本发明RNA分子的任何单链区,包含任何末端突出和两个双链区之间的缺口,其可以通过化学修饰或二级结构进行抵抗降解的稳定化处理。RNA链可以具有错配的或不完全配对的核苷酸。每条链可具有一个或多个切口(在核酸主链中的切口)、缺口(具有一个或多个缺失核苷酸的片段链),和经修饰的核苷酸或核苷酸类似物。不仅RNA分子中的任何或所有核苷酸都可以经化学修饰,而且每条链可以与一个或多个结构部分结合以增强其功能性,例如,与诸如一个或多个肽、抗体、抗体片段、适体、聚合物等的结构部分。
在一些实施方案中,第一链比第二链长至少1nt。在进一步的实施方案中,第一链比第二链长至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20nt。在另一个实施方案中,第一链比第二链长20-100nt。在进一步的实施方案中,第一链比第二链长2-12nt。在更进一步的实施方案中,第一链比第二链长3-10nt。
在一些实施方案中,第一链或长链具有5-100nt、或优选地10-30或12-30nt、或更优选地15-28nt的长度。在一个实施方案中,第一链长度是21个核苷酸。在一些实施方案中,第二链或短链具有3-30nt、或优选地3-29nt或10-26nt、或更优选地12-26nt的长度。在一些实施方案中,第二链具有15个核苷酸的长度。
在一些实施方案中,双链区具有3-98个碱基对(bp)的长度。在进一步的实施方案中,双链区具有5-28bp的长度。在更进一步的实施方案中,双链区具有10-19bp的长度。双链区的长度可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30bp。
在一些实施方案中,RNA分子的双链区不包含任何的错配或凸起,且两条链在双链区彼此完全互补。在另一个实施方法中,RNA分子的双链区包含错配和/或凸起。
在一些实施方案中,末端突出是1-10个核苷酸。在进一步的实施方案中,末端突出是1-8个核苷酸。在另一个实施方案中,末端突出是3nt。
本发明还提供在细胞或生物体中调节K-Ras基因表达的方法(沉默方法)。该方法包括步骤:在可发生选择性K-Ras基因沉默的条件下,使所述细胞或生物体与双链体RNA分子接触,介导由针对具有与该双链RNA基本上对应的序列部分的靶K-Ras核酸的所述双链体RNA分子实现的选择性K-Ras基因沉默。
在一些实施方案中,接触步骤包括步骤:将所述双链体RNA分子引入培养中的或在生物体中的靶细胞内,在所述靶细胞中可发生选择性基因沉默。在进一步的实施方案中,引入步骤包括转染、脂转染、感染、电穿孔或其他递送技术。
在一些实施方案中,该沉默方法用于确定细胞或生物体中基因的功能或效用。
该沉默方法可以用于在细胞或生物体中调节基因的表达。在一些实施方案中,该基因与疾病有关,例如,人类疾病或动物疾病、病理状况或非期望状况。在一些实施方案中,该疾病是胃癌。
本发明的RNA分子可以用于治疗或预防多种疾病或非期望状况,包括胃癌。在一些实施方案中,本发明可以用作癌症治疗或预防或延迟癌症进展。本发明RNA分子可以用于沉默或敲低k-Ras,其与细胞增殖或其他癌症表型有关。
本发明提供治疗疾病或非期望状况的方法,该方法包括使用不对称双连体RNA分子,以实现与疾病或非期望状况有关的基因的基因沉默。
本发明进一步提供药物组合物。药物组合物包括(作为活性剂)至少一种不对称双链体RNA分子。在一些实施方案中,药物组合物包括选自药学载体、正电荷载体、脂质体、蛋白质载体、聚合物、纳米颗粒、纳米乳液、脂质和类脂的一种或多种载体。在一些实施方案中,组合物用于诊断用途。在一些实施方案中,组合物用于治疗用途。
本发明的药物组合物和制剂,除RNA成分外,可以与针对siRNA、miRNA和反义RNA开发的药物组合物和制剂相同或相似(参见例如,de Fougerolles et al.,2007,“Interfering with disease:a progress report on siRNA-based therapeutics.”NatRev Drug Discov 6,443453;Kim和Rossi,2007,“Strategies for silencing humandisease using RNA interference.”Nature reviews 8,173-184)。本公开的双链体RNA分子可以替换这些药物组合物和制剂中的siRNA、miRNA和反义RNA。药物组合物和制剂还可以进一步经修饰以适应本发明的双链体RNA分子。
本公开的双链体RNA分子的“药学上可接受的盐”或“盐”是所公开的双链体RNA分子的产物,其包含离子键,其一般通过使所公开的双链体RNA分子与酸或碱反应而产生,适于给受试者施用。药学上可接受的盐可包括但不限于,酸加成盐,包括盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、乙酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐和酒石酸盐;碱金属阳离子,例如Na、K、Li,碱土金属盐,例如Mg或Ca,或有机胺盐。
“药物组合物”是包含本公开双链体RNA分子的适于给受试者施用的形式的制剂。在一个实施方案中,药物组合物是散装或单位剂型。单位剂型可以是各种形式,包括,例如,胶囊、IV袋、片剂、气雾剂吸入器上的单泵、或小瓶。组合物的单位计量中活性成分(例如,本公开双链体RNA分子或其盐的制剂)的量是有效量,可以根据所涉及的具体治疗而改变。本领域技术人员将了解依赖于患者的年龄和状况,有时必须对剂量进行常规的改变。剂量还依赖于施用途径。可以考虑各种途径,包括经口、肺、直肠、肠胃外、经皮、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、鼻内等。用于本发明双链体RNA分子的局部或经皮施用剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、溶液、贴剂和吸入剂。在一个实施方案中,活性双链体RNA分子在无菌条件下与药学上可接受的载体以及所需的任何防腐剂、缓冲剂或抛射剂混合。
本发明提供治疗方法,包括给有需要的受试者施用有效量的药物组合物。在一些实施方案中,药物组合物经由选自iv、sc、局部、po和ip的途径进行施用。在另一个实施方案中,有效量是1ng至1g/天、100ng至1g/天或1ug至1mg/天。
本发明还提供药物组合物,包括与至少一种药学上可接受的赋形剂或载体组合的本发明双链体RNA分子。如本文所使用的,“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体”意欲包括与药学施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。合适的载体描述于“Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第20版,”,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA.,其引入本文作为参考。此类载体或稀释剂的例子包括但不限于,水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。还可使用脂质体和非水性媒介物,例如不挥发性油。此类介质和试剂用于药学活性物质的使用是本领域众所周知的。除非任何方便的介质或试剂与活性双链体RNA分子不相容,否则考虑其在组合物中的使用。增补性活性双链体RNA分子也可掺入组合物内。
本发明的双链体RNA分子可以以合适的剂型进行施用,合适的剂型的制备根据常规工艺(即,通过产生本发明的药物组合物),将治疗有效量(例如,足以通过抑制肿瘤生长、杀死肿瘤细胞、治疗或预防细胞增殖性病症等达到所需疗效的有效水平)的本发明的双链体RNA分子(作为活性成分)与标准药学载体或稀释剂结合。这些工艺可以适当包括混合、粒化、压片或溶解成分以获得所需制剂。在另一个实施方案中,治疗有效量的本发明的双链体RNA分子在不含标准药学载体或稀释剂的合适剂型中施用。
药学上可接受的载体包括固体载体,例如乳糖、白土、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。示例性液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、水等。类似地,载体或稀释剂可以包括本领域已知的时间延迟材料,例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯,单独地或连同蜡、乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、甲基丙烯酸甲酯等。其他填充剂、赋形剂、调味剂和其他添加剂,例如本领域已知的那些,也可以包括在根据本发明的药物组合物中。
包含本发明的活性双链体RNA分子的药物组合物可以以通常已知的方式进行制造,例如,通过常规的混合、溶解、粒化、锭剂制造、研细、乳化、封装、截留或冻干工艺。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体,包括赋形剂和/或辅助剂,以常规方式配制,其促进活性双链体RNA分子加工成药学上可使用的制剂。当然,合适的制剂依赖于所选择的施用途径。
本发明的双链体RNA分子或药物组合物可以通过目前用于化学治疗的许多熟知方法施用给受试者。例如,对于癌症的治疗,本发明的双链体RNA分子可以直接注射到肿瘤内、注射到血流内或体腔内或口服或用贴剂通过皮肤应用。对于银屑病的治疗,全身施用(例如,经口施用)或局部施用于受影响的皮肤区是优选的施用途径。所选择的剂量应足以构成有效治疗,但又不高至引起无法接受的副作用。在治疗过程中和治疗后的一段合理时期应紧密监视疾病(例如,胃癌)的状况和患者的健康。
实施例
下文提供的实施例进一步举例说明本发明的不同特征。实施例还举例说明对于实践本发明有用的方法。这些实施例不限制请求保护的本发明。
实施例1:aiK-Ras的体外效力
图1(A)显示体外研究使用aiRNA ID NO:21(“aiK-Ras#1”)靶向K-Ras靶SEQ IDNO:22来确定aiK-Ras#1的IC50。用aiK-Ras#1转染DLD1细胞(ATCC)。转染后48小时,收集细胞,分离RNA。用qPCR确定aiK-Ras#1的IC50。剩余的mRNA以GAPDH表达水平来标准化。IC50为3.1pM说明aiK-Ras#1高效沉默K-Ras基因表达。
图1(B)显示体外研究使用aiRNA ID NO:142(“aiK-Ras#2”)靶向K-Ras靶SEQ IDNO:142来确定aiK-Ras#2的IC50。用aiK-Ras#2转染DLD1细胞。转染后48小时,收集细胞,分离RNA。用qPCR确定aiK-Ras#2的IC50。剩余的mRNA以GAPDH表达水平来标准化。IC50为3.5pM说明aiK-Ras#2高效沉默K-Ras基因表达。
实施例2:aiK-Ras减少的脱靶效应
图2(A)显示通过northern印迹分析检测装载在RISC中的siRNA和aiRNA。为了分析小RNA RISC的装载,用aiRNA或siRNA双链体转染HEK293Flag-Ago2稳定细胞系。在指定时间点裂解细胞,用Flag抗体(Sigma,Catalog#F1804)免疫共沉淀。洗涤免疫沉淀物,从复合物中用TRIZOL(Life Technologies,15596-018)抽提分离RNA,并上样到15%TBE-Urea PAGE或15%TBE非变性PAGE凝胶。经电泳后,转移RNA到Hybonad-XL Nylon膜上。接着将r-P32标记的检测有义链或反义链的探针与膜上RNA杂交。用siRNA或aiRNA转染表达Flag-Ago2的HEK293细胞(Invivogen,Catalog#293-null),之后进行免疫共沉淀试验。通过瞬时转染FLAG-Ago2新霉素质粒DNA载体,形成稳定表达FLAG-Ago2的FLAG-Ago2HEK293细胞。在含新霉素的选择性培养基培养后,用免疫印迹选择单克隆群体。用非变性凝胶检测dsRNA。
图2(B)显示aiRNA减少的脱靶。用融合了基于反义链或有义链的aiRNA或siRNA靶序列和aiK-Ras#2或siK-Ras#2(5nM)的荧光素酶报告基因转染HeLa细胞。图2(C)显示TLR3/RNA复合物与抗-HA抗体(Invivogen,Catalog#ab-hatag)免疫共沉淀。从沉淀物中提取RNA,进行northern印迹分析确定aiRNA/siRNA和TLR3受体之间的相互作用。
图2(A)-(C)显示aiK-Ras#1和aiK-Ras#2的不对称结构减少有义链介导的脱靶效应以及LTR3的结合。
实施例3:K-Ras突变细胞中aiK-Ras敏感性
图3(A)显示转染了aiK-Ras#1或aiK-Ras#2的AGS(ATCC)和DLD1的克隆形成试验。用1nM GFP aiRNA(对照;GGTTATGTACAGGAACGCA(SEQ ID NO:956))或1nM aiK-Ras#1或aiK-Ras#2转染细胞24小时。然后用胰蛋白酶消化细胞,并以500-2000个细胞/孔转移到6-孔板中以检测细胞的克隆形成能力。11-14天后,用Giemsa染色剂染色克隆并计数。对于免疫印迹分析,细胞用冰预冷的PBS洗涤,在裂解缓冲液[50mM Hepes(pH 7.5),1%Nonidet P-40,150mM NaCl,1mM EDTA,1X Halt蛋白酶体抑制剂混合物(Thermo Scientefic,Catalog#87786)]中裂解。溶解的蛋白(10μg)用SDS/PAGE分离,转移至PVDF膜上。本试验中使用第一抗体。通过增强的化学发光(BioRad,Catalog#170-5060)使抗原-抗体复合物可视化。
图3(B)显示免疫印迹分析AGS和DLD1的裂解物,以及aiK-Ras#1和aiK-Ras#2的转染对于K-Ras表达、裂解的caspase 3和裂解的PARP的影响。
图3(C)显示在大孔板(large cell panel)中克隆形成试验结果。在板中的所有细胞系从ATCC中获得。有K-Ras突变体的细胞是突出显示的。
实施例4:aiK-Ras敏感性与K-Ras扩增之间的相关性
图4显示免疫印迹分析K-Ras和EGFR-RAS的通路分子。上样裂解物(10μg/泳道)并检测总的和磷酸化形式的EGFR、cRaf、MEK和ERK。K-Ras的活化形式(K-Ras GTP)采用GST-Raf-RBD从细胞裂解物中亲和纯化,并通过免疫印迹用K-Ras抗体分析。免疫印迹采用以下抗体:肌动蛋白(Sigma,Catalog#A5316)、K-RAS(Santa Cruz,sc30和Cell signaling,Catalog#8955)、裂解的PARP(Cell Signaling,Catalog#5625)、裂解的Caspase-3(CellSignaling,Catalog#9664)、磷酸化-EGF受体(Cell Signaling,Catalog#3777)、EGF受体(Cell Signaling,Catalog#4267)、磷酸化-c-Raf(Cell Signaling,Catalog#9427)、c-Raf(Cell Signaling,Catalog#9422)、磷酸化-MEK1/2(Cell Signaling,Catalog#9154)、MEK1/2(Cell Signaling,Catalog#8727)、磷酸化-p44/42MAPK(Erk1/2)(Cell Signaling,Catalog#4370)、p44/42MAPK(Erk1/2)(Cell Signaling,Catalog#4695)、Jagged 1(CellSignaling,Catalog#2620)、Notch 1(Cell Signaling,Catalog#3608)、c-Myc(CellSignaling,Catalog#5605)。采用Ras活化试剂盒(Abcam,Catalog#ab128504)根据生产商的方法进行RBD pulldown。印迹沉淀检测K-Ras(Santa Cruz,Catalog#sc30)。印迹肌动蛋白(Sigma,Catalog#A5316)作为上样对照。图4显示aiK-Ras敏感性与K-Ras扩增相关,但与Ras通路分子的活化状态无关。
图5(A)显示在K-Ras突变体大孔板(large cell panel)中,aiK-Ras敏感性与K-Ras扩增相关。板中所有细胞从ATCC中获得。用qPCR分析K-Ras的拷贝数。采用双边Mann-Whitney U检验确定统计学差异。p<0.05认为具有统计学显著差异。
图5(B)显示在K-Ras突变体大孔板(large cell panel)中,aiK-Ras敏感性与K-Ras扩增相关。采用免疫印迹检测K-Ras蛋白的表达水平。用Image Lab(Biorad)定量免疫印迹的条带。采用双边Mann-Whitney U检验确定统计学差异。p<0.05认为具有统计学显著性差异。
图3(A)-(C)和5(A)-(B)显示在K-Ras突变体细胞中aiK-Ras敏感性不同,其与K-Ras拷贝数相关。
实施例6:在敏感细胞系中aiK-Ras对CSC样表型的影响
图6(A)显示CSC培养中干性基因的表达。AGS细胞在CSC培养基[含有B-27补充物(Life Technologies,Catalog#17504-044)、20ng/mL EGF(R&D Systems,Catalog#236-EG)、10ng/mL FGF(R&D Systems,Catalog#233-FB)和1%青霉素/链霉素的DMEM营养混合物F-12(DMEM/F-12,Life Technologies,Catalog#11320-033)]中培养2周。用qPCR定量CSC球的Nanog、Oct4和Sox2基因的表达。
图6(B)显示在多种细胞系中成球试验的结果。对于成球实验,准备琼脂糖覆盖的平板以分配高压灭菌的0.5%的琼脂,且立即吸气。胰蛋白酶消化转染的细胞并计数,然后用1x CSC培养基稀释至2000个细胞/100μL。将包含0.33%琼脂糖(Sigma VII型,Catalog#A-4018)的1.9mL的温CSC培养基加入到含有细胞的CSC培养基中,使琼脂糖终浓度为0.3%。将平板放置于4℃,10分钟以冷却。平板在室温下放置10分钟,将1mL CSC培养基加入到上层。平板在37℃/5%CO2培养箱中培养18-25天。为了计数球,吸出CSC培养基,加入PBS中的结晶紫(EMD,Catalog#192-12)溶液,室温下培养1小时以染色球。
胰蛋白酶消化细胞,在CSC培养基/3%软琼脂中以2000个细胞/孔重新铺板于琼脂覆盖的6孔板上,以检测细胞的成球能力。18-25天后,结晶紫染色球,计数球的数量。
图6(C)显示具有aiK-Ras#1和aiK-Ras#2的AGS和DLD1细胞CD44-高的细胞群缺失。用流式细胞仪检测CD44的表达,其中AGS和DLD1细胞在染色缓冲液(BD Pharmingen,Catalog#554657)中,用缀合至PE的抗-CD44(BD Pharmingen,Catalog#555479)于冰上染色45分钟,用染色缓冲液洗涤一次。用流式细胞仪(Attune Acoustic Focusing Cytometer,Life Technologies)检测CD44阳性的群体。
图6(A)-(C)显示根据本发明,aiK-Ras调节敏感细胞系的CSC样表型。
实施例7:K-Ras敲低对CSC相关基因表达型的影响
图7(A)显示转染了aiK-Ras的癌细胞中CSC相关基因的热图。用1nM对照aiRNa或aiK-Ras#1转染细胞48小时。对总RNA使用针对84个CSC相关基因的特异性验证的引物,用RT2Profiler PCR芯片进行实时PCR。基因表达的倍数改变计算为aiK-Ras#1和对照aiRNA样本之间的比。图7(B)显示通过蛋白质印迹证实Notch信号的下调。下表3概括了与如图7(A)中所示的热图相一致的具有aiK-Ras#1的下调>3倍的基因。
表3.
AGS | MKN28 | |
基因符号 | 改变倍数 | 改变倍数 |
NOTCH1 | -7.87 | -4.07 |
SOX2 | -5.49 | -3.97 |
PTCH1 | -4.94 | -7.04 |
FOXA2 | -4.85 | -7.35 |
FGFR2 | -4.29 | -3.67 |
JAGl | -4.16 | -3.51 |
ALCAM | -3.64 | -3.11 |
MYC | -3.51 | -3.15 |
ITGA2 | -3.36 | -7.98 |
本说明书中列举和讨论的实施方案仅意图教导本领域技术人员本发明人已知的制备和使用本发明的最佳方法。说明书中没有应该被认为限制本发明范围的内容。显示的所有实施例都是代表性的和非限制性的。在不违背本发明的情况下,根据上述的教导本领域技术人员可以领会,上述本发明的实施方案可以被修饰或改变。因此,应当理解,在权利要求以及它们的等效物范围内,本发明可以以不同于说明书所述的方式实践。
Claims (35)
1.一种在有此需要的受试者中治疗癌症的方法,所述方法包括给有此需要的受试者施用双链体RNA分子,所述双链体RNA分子包括(i)第一链,其包括具有18-23个核苷酸长度的核苷酸序列,其中所述第一链的核苷酸序列与靶K-Ras mRNA序列基本上互补,和(ii)第二链,其包括具有12-17个核苷酸长度的核苷酸序列,其中所述第二链与第一链基本上互补,且与第一链形成双链区,其中所述第一链具有1-9个核苷酸的3’-突出端和0-8个核苷酸的5’-突出端,其中所述双链体RNA分子能够实现选择性K-Ras基因沉默。
2.一种在选定患者人群中治疗癌症的方法,所述方法包括步骤:
(a)检测从诊断患有癌症的患者候选者中获取的生物样本中突变K-Ras基因扩增的水平;
(b)确定该患者候选者的突变K-Ras基因扩增的水平高于基准水平;和
(c)给该患者候选者施用双链体RNA分子,所述双链体RNA分子包括(i)第一链,其包括具有18-23个核苷酸长度的核苷酸序列,其中所述第一链的核苷酸序列与靶K-Ras mRNA序列基本上互补,和(ii)第二链,其包括具有12-17个核苷酸长度的核苷酸序列,其中所述第二链与第一链基本上互补,且与第一链形成双链区,其中所述第一链具有1-9个核苷酸的3’-突出端和0-8个核苷酸的5’-突出端,其中所述双链体RNA分子能够实现选择性K-Ras基因沉默。
3.一种在选定患者人群中治疗癌症的方法,所述方法包括步骤:
(a)检测从诊断患有癌症的患者候选者中获取的生物样本中突变K-Ras蛋白的表达水平;
(b)确定该患者候选者的突变K-Ras蛋白的表达水平高于基准水平;和
(c)给该患者候选者施用双链体RNA分子,所述双链体RNA分子包括(i)第一链,其包括具有18-23个核苷酸长度的核苷酸序列,其中所述第一链的核苷酸序列与靶K-Ras mRNA序列基本上互补,和(ii)第二链,其包括具有12-17个核苷酸长度的核苷酸序列,其中所述第二链与第一链基本上互补,且与第一链形成双链区,其中所述第一链具有1-9个核苷酸的3’-突出端和0-8个核苷酸的5’-突出端,其中所述双链体RNA分子能够实现选择性K-Ras基因沉默。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述癌症是胃癌,或所述受试者患有或倾向于有胃癌。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述第一链的核苷酸序列包括与靶K-RasmRNA序列至少70%互补的序列。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述第一链具有19-23个核苷酸长度。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述第一链具有21个核苷酸长度。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述第二链具有14-16个核苷酸长度。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述第二链具有15个核苷酸长度。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述第一链具有2-4个核苷酸的3’-突出端。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述第一链具有3个核苷酸的3’-突出端。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述双链体RNA分子包含至少一个经修饰的核苷酸或其类似物。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述至少一个经修饰的核苷酸或其类似物是糖、主链、和/或碱基经修饰的核糖核苷酸。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述主链经修饰的核糖核苷酸在与另一个核糖核苷酸的磷酸二酯键连接中具有修饰。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述第一链包括选自SEQ ID NOs:638-955的反义链序列。
16.根据权利要求1-14中任一项所述的方法,其中所述第二链包括选自SEQ ID NOs:320-637的有义链序列。
17.根据权利要求1-14中任一项所述的方法,其中所述第一链包括选自SEQ ID NOs:638-955的反义链序列,所述第二链包括选自SEQ ID NOs:320-637的有义链序列。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述受试者是人。
19.一种双链体RNA分子,所述双链体RNA分子包括(i)第一链,其包括具有18-23个核苷酸长度的核苷酸序列,其中所述第一链的核苷酸序列与靶K-Ras mRNA序列基本上互补,和(ii)第二链,其包括具有12-17个核苷酸长度的核苷酸序列,其中所述第二链与第一链基本上互补,且与第一链形成双链区,其中所述第一链具有1-9个核苷酸的3’-突出端,和0-8个核苷酸的5’-突出端,其中所述双链体RNA分子能够实现选择性K-Ras基因沉默。
20.根据权利要求19所述的双链体RNA分子,其中所述第一链的核苷酸序列包括与靶K-Ras mRNA序列至少70%互补的序列。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的双链体RNA分子,其中所述第一链具有19-23个核苷酸长度。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的双链体RNA分子,其中所述第一链具有21个核苷酸长度。
23.根据权利要求22所述的双链体RNA分子,其中所述第二链具有14-16个核苷酸长度。
24.根据权利要求23所述的双链体RNA分子,其中所述第二链具有15个核苷酸长度。
25.根据权利要求24所述的双链体RNA分子,其中所述第一链具有2-4个核苷酸的3’-突出端。
26.根据权利要求25所述的双链体RNA分子,其中所述第一链具有3个核苷酸的3’-突出端。
27.根据权利要求19-26中任一项所述的双链体RNA分子,其中所述双链体RNA分子包含至少一个经修饰的核苷酸或其类似物。
28.根据权利要求27所述的双链体RNA分子,其中所述至少一个经修饰的核苷酸或其类似物是糖、主链、和/或碱基经修饰的核糖核苷酸。
29.根据权利要求28所述的双链体RNA分子,其中所述主链经修饰的核糖核苷酸在与另一个核糖核苷酸的磷酸二酯键连接中具有修饰。
30.根据权利要求19-29中任一项所述的双链体RNA分子,其中所述第一链包括选自SEQID NOs:638-955的反义链序列。
31.根据权利要求19-29中任一项所述的双链体RNA分子,其中所述第二链包括选自SEQID NOs:320-637的有义链序列。
32.根据权利要求19-29中任一项所述的双链体RNA分子,其中所述第一链包括选自SEQID NOs:638-955的反义链序列,所述第二链包括选自SEQ ID NOs:320-637的有义链序列。
33.一种在有此需要的受试者中治疗癌症的方法,所述方法包括在所述受试者中抑制K-Ras基因的表达或K-Ras的活性。
34.一种在有此需要的受试者中抑制癌症干细胞(CSCs)存活和/或增殖的方法,所述方法包括在所述受试者中抑制K-Ras基因的表达或K-Ras的活性。
35.根据权利要求34所述的方法,其中抑制K-Ras基因表达或K-Ras活性包括给有此需要的受试者施用双链体RNA分子,所述双链体RNA分子包括(i)第一链,其包括具有18-23个核苷酸长度的核苷酸序列,其中所述第一链的核苷酸序列与靶K-Ras mRNA序列基本上互补,和(ii)第二链,其包括具有12-17个核苷酸长度的核苷酸序列,其中所述第二链与第一链基本上互补,且与第一链形成双链区,其中所述第一链具有1-9个核苷酸的3’-突出端和0-8个核苷酸的5’-突出端,其中所述双链体RNA分子能够实现选择性K-Ras基因沉默。
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---|---|---|---|---|
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US10802213B2 (en) * | 2018-12-27 | 2020-10-13 | Juniper Networks, Inc. | Photodetector with sequential asymmetric-width waveguides |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002097114A2 (en) * | 2001-05-29 | 2002-12-05 | Sirna Therapeutics, Inc. | Nucleic acid treatment of diseases or conditions related to levels of ras, her2 and hiv |
US20040121348A1 (en) * | 2001-10-26 | 2004-06-24 | Ribopharma Ag | Compositions and methods for treating pancreatic cancer |
WO2008109516A2 (en) * | 2007-03-02 | 2008-09-12 | Mdrna, Inc. | Nucleic acid compounds for inhibiting ras gene expression and uses thereof |
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002097114A2 (en) * | 2001-05-29 | 2002-12-05 | Sirna Therapeutics, Inc. | Nucleic acid treatment of diseases or conditions related to levels of ras, her2 and hiv |
US20040121348A1 (en) * | 2001-10-26 | 2004-06-24 | Ribopharma Ag | Compositions and methods for treating pancreatic cancer |
WO2008109516A2 (en) * | 2007-03-02 | 2008-09-12 | Mdrna, Inc. | Nucleic acid compounds for inhibiting ras gene expression and uses thereof |
CN101835789A (zh) * | 2007-08-27 | 2010-09-15 | 波士顿生物医药公司 | 不对称干扰rna的组合物及其用途 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111534520A (zh) * | 2020-05-27 | 2020-08-14 | 深圳市疾病预防控制中心(深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所) | 特异抑制K-ras基因表达的慢病毒和重组载体构建及其应用 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WW01 | Invention patent application withdrawn after publication | ||
WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20171201 |