CN107427791A - 用于连续制造脂质体药物制剂的系统和方法 - Google Patents

用于连续制造脂质体药物制剂的系统和方法 Download PDF

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Abstract

本公开内容提供了用于连续生产脂质体的系统和方法。实例方法包括(a)使脂质的溶液和来自一个或多个容器的有机溶剂混合以产生有机溶剂‑脂质溶液，(b)在第一流量下将有机溶剂‑脂质溶液提供至注射口的第一入口，其中第一入口与第一导管流体连通，(c)在第二流量下将水溶液提供至注射口的第二入口，其中第二入口与第二导管流体连通，其中第一导管在注射口的出口处在第二导管内同心地定位，并且其中第一导管延伸通过注射口的出口，和(d)使有机脂质溶液和水溶液混合以产生多种脂质体。

Description

用于连续制造脂质体药物制剂的系统和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年3月19日提交的美国临时专利申请序列号62/135,237的优先权，其通过引用以其全部并入本文。
政府权利
本发明由在美国食品与药品管理局授予的合同号HHSF223201310117C下的政府支持完成。政府在本发明中具有某些权利。
背景技术
脂质体作为肠胃外药物递送运载体当前被用于制药工业。在市场上存在几种FDA批准的脂质体可注射的产品，而在临床试验和在初步研究中存在更多潜在产品。分别使用批准的产品比如和脂质体已经被证明在癌症、黄斑变性、真菌感染、和疫苗中是有用的。而且，脂质体作为非病毒基因递送载体在临床试验中被调查。
迄今为止，存在适合用于不同应用比如癌症、基因递送、siRNA递送、蛋白质/肽递送和小分子递送的多种类型的脂质体。取决于应用，将在如上面讨论的脂质体制剂中存在差异比如脂质类型/组成、大小和其它性质。例如，由于其与常规脂质体比较延长的半衰期，由DSPC/Chol/PEG-DSPE组成的脂质体作为稳定的脂质体制剂广泛地用于癌症和细胞靶向应用。对于siRNA应用，不同的致融脂质比如DOPE被用于形成与siRNA的复合体进行高效的递送。
脂质体的性质比如流体动力学半径(大小)、ζ-电位、脂质包装、封装效率、和外部修饰(比如聚合物涂层)在配制有效的药物递送系统中是重要的。当考虑脂质体的体内应用时，脂质体的正确大小是至关重要的一个性质，以便将脂质体递送至身体中的不同位置。例如，由于增强的渗透性保持(EPR)效应，已知具有＜100nm的近似直径的脂质体在癌症位点处积聚，而非常小的脂质体或更大的脂质体分别被过滤或占据身体中的其它地方。
一些脂质体性质高度依赖于制剂的处理条件，并且这些处理条件中的任何改变将导致最终制剂中的差异。因此，重要的是基于用户的需求研发可以准确地和预测性地生产脂质体的制造系统。
发明内容
在一方面，本公开内容提供了用于连续生产脂质体的系统，系统包括(a)与一个或多个容器流体连通的混合器，(b)器皿，和(c)一个或多个注射口，其中每个注射口包括第一入口——其包括与混合器流体连通的第一导管，第二入口——其包括与器皿流体连通的第二导管，和出口，其中第一导管在第二导管内同心地定位，并且其中第一导管延伸通过出口。
在另一方面，本公开内容提供了用于连续生产脂质体的方法。方法可以包括(a)使脂质的溶液和来自一个或多个容器的有机溶剂混合以产生有机溶剂-脂质溶液，(b)在第一流量下将有机溶剂-脂质溶液提供至注射口的第一入口，其中第一入口与第一导管流体连通，(c)在第二流量下将水溶液提供至注射口的第二入口，其中第二入口与第二导管流体连通，其中第一导管在注射口的出口处在第二导管内同心地定位，并且其中第一导管延伸通过注射口的出口，和(d)使有机脂质溶液和水溶液混合以产生多种脂质体。
在又另一个实施方式中，本公开内容提供了在其上存储了指令的非暂时性计算机可读介质，当通过一个或多个处理器执行时，所述指令引起用于连续生产脂质体的系统执行刚才描述的方法的操作。
本文公开的系统和方法显著地减少材料的浪费和降低处理/生产时间。此外，由于脂质体将在封闭环境中以减少的人为干预配制，本文描述的连续制造方法避免由处理条件的改变和转移材料期间的人为干预造成的变化。此外，连续制造过程可扩展至更大的生产规模。在本文描述的系统中，需要增加的唯一的方面将是时间，这是由于在临床试验和末期生产期间用于制造的设备将是相同的。此方法将减少制造商的调整负担，减少与额外的验证测试相关联的制造成本/时间，和导致将药物产品快速地递送至极度需要的那些。
通过阅读下列具体实施方式，在适当时参考附图，这些以及其它方面、优点和替代方案对本领域普通技术人员将变得显而易见。
附图说明
图1根据实例实施方式是用于脂质体药物制剂的连续制造过程的系统的示意性图示。
图2根据实例实施方式是脂质混合过程的示意性图示。
图3根据实例实施方式是用于脂质体药物制剂的连续制造过程的系统的控制设计。
图4根据实例实施方式是脂质体形成阶段的示意性图示。
图5根据实例实施方式是实例注射口的示意性图示。
图6根据实例实施方式是包括注射口的脂质混合过程和脂质体形成阶段的示意性图示。
图7根据实例实施方式是脂质体形成阶段接着乙醇稀释阶段的示意性图示。
图8根据实例实施方式是脂质浓缩阶段的示意性图示。
图9根据实例实施方式是强调连续过程的主要阶段与每个主要阶段的细分部分的因果图。
图10根据实例实施方式是概括导致获得连续过程的准确粒度数据的变量的因果图。
图11根据实例实施方式是概括影响经由NIR传感器的脂质浓度检测的变量的因果图。
图12根据实例实施方式是关于材料和过程变量概括影响脂质体形成过程的变量的因果图。
图13是图解根据实例实施方式的实例方法的流程图。
图14根据实例实施方式是脂质浓度和水相流量对粒度的影响的DOE研究的设计空间。
图15根据实例实施方式是允许形成同轴湍流喷射的注射口的示意和摄影图像。
图16A根据实例实施方式是流速比(FVR)对混合物雷诺尔德数(Re混合物)的图形图示。
图16B根据实例实施方式是对应于来自图16a的位置(1、2、3和4)的多个流动图像，其展现了导致单分散的或多分散的系统的流动概况。
图16C根据实例实施方式是仅单分散的脂质体的Z-平均粒度对Re混合物的图形图示。dA1＝3.175mm，dA2＝4.572mm，dE1＝0.508mm，dE2＝1.016mm。
图17根据实例实施方式是Z-平均粒度对水相流量(AFR)和脂质浓度的表面概况图。
图18根据实例实施方式是脂质类型(即DMPC、DPPC、DSPC、DOPC)对平均粒度和PDI的作用的图形图示。
图19根据实例实施方式是水相添加剂对平均粒度的作用的图形图示。
图20根据实例实施方式是不同的颗粒分级技术(动态光散射、纳米颗粒跟踪和经由NS-TEM的颗粒计数)评估脂质体平均粒度和粒度分布的图形图示。
图21根据实例实施方式是DLS、纳米颗粒跟踪、NS-TEM和Cryo-TEM的脂质体平均粒度和标准偏差的图形图示。
图22A-22D根据实例实施方式是使用不同的流动条件生产的三种脂质体样品的脂质体的负染色TEM显微照片。
图23A-23C根据实例实施方式是使用不同的流动条件生产的三种脂质体样品的脂质体的Cryo-TEM显微照片。
图24根据实例实施方式是在同向流动中来自同轴湍流喷射混合器的脂质体形成的模型。
图25根据实例实施方式是两种脂质∶胆固醇∶DPPG(4.5∶3∶0.4摩尔比)脂质体的脂质体平均粒度和多分散指数的图形图示，其中脂质指的是DMPC或DPPC。
图26根据实例实施方式是DPPC∶胆固醇∶DPPG(4.5∶3∶0.4摩尔比)脂质体的脂质体平均粒度和多分散指数的图形图示。
图27根据实例实施方式是DMPC∶胆固醇∶DPPG(4.5∶3∶0.4摩尔比)脂质体的脂质体平均粒度和多分散指数的图形图示。
图28A-C根据实例实施方式是对脂质体粒度(z-平均数)、PDI和DLS计数率(kcps)的手动DLS测量设置的比较。
图29根据实例实施方式是DPPC∶胆固醇∶DPPG(4.5∶3∶0.4摩尔比)脂质体的脂质体平均粒度和多分散指数的图形图示。
图30根据实例实施方式是DMPC∶胆固醇∶DPPG(4.5∶3∶0.4摩尔比)脂质体在10mM磷酸盐缓冲液中的脂质体平均粒度和多分散指数(PDI)的图形图示。
图31根据实例实施方式是DPPC∶胆固醇∶DPPG(4.5∶3∶0.4摩尔比)脂质体在10mM赫佩斯缓冲液中的脂质体平均粒度和多分散指数(PDI)的图形图示。
图32根据实例实施方式是DPPC∶胆固醇∶DPPG(4.5∶3∶0.4摩尔比)脂质体在10mMNaCl中的脂质体平均粒度和多分散指数(PDI)的图形图示。
图33根据实例实施方式是DPPC∶胆固醇∶DPPG(4.5∶3∶0.4摩尔比)脂质体在75mMNaCl中的脂质体平均粒度和多分散指数(PDI)的图形图示。
图34根据实例实施方式是DPPC∶胆固醇∶DPPG(4.5∶3∶0.4摩尔比)脂质体在140mMNaCl中的脂质体平均粒度和多分散指数(PDI)的图形图示。
图35根据实例实施方式是DPPC∶胆固醇∶DPPG(4.5∶3∶0.4摩尔比)脂质体在10-140mM NaCl和10mM PB中的脂质体平均粒度(z-平均数，d.nm)的图形图示。
图36根据实例实施方式是DPPC∶胆固醇∶DPPG(4.5∶3∶0.4摩尔比)脂质体在10-140mM NaCl和10mM磷酸盐缓冲液中的脂质体ζ电位的图形图示。
图37根据实例实施方式是显示了在10mM NaCl中制备的HSPC∶胆固醇∶DPPG(4.5∶3∶0.4摩尔比)脂质体的自动化粒度控制的实例的图形图示。
图38根据实例实施方式是基于来自NIR浊度传感器的散射光的脂质浓度预测模型的实验设计的图形图示。
图39根据实例实施方式是具有包括粒度(d.nm)、多分散指数(PDI)、ppm和CU的因素的脂质浓度的实验设计的图形图示。
图40是脂质浓度[脂质]预测模型的表面概况图的图形图示。
图41根据实例实施方式是以PPM的NIR信号输出如何受脂质体形成的多分散性影响的实例的图形图示。
具体实施方式
本文描述了实例方法和系统。应当理解词语“实例”、“示例性的”和“说明性的”在本文使用意思是“充当实例、例子或说明”。作为“实例”的、为“示例性的”、或为“说明性的”本文描述的任何实施方式或特征不必然解释为相对于其它实施方式或特征是优选的或有利的。本文描述的实例实施方式不意味是限制性的。将容易理解本公开内容的方面——如本文一般描述的，和在附图中图解的——可以以各种不同的配置被布置、置换、组合、分离和设计，其所有均在本文被明确地考虑。
另外，在附图中显示的具体的布置不应当被视为是限制性的。应当理解其它实施方式可以包括更多或更少的在给定的附图中显示的每种要素。进一步，图解的要素中的一些可以被组合或省略。又进一步，实例实施方式可以包括没有在附图中图解的要素。
如本文使用的，关于测量，“大约”意思是+/-5％。
参考附图，图1图解了脂质体药物制剂的连续制造过程的实例概述。计算机/数据获取系统控制/获取来自过程的所有信号。连续制造设计可以包括过程分析技术(PAT)以在操作期间增加质量保证和一致性。PAT将出于质量控制目的实时分析参数比如粒度、ζ电位、和封装的药物。这些制剂参数将被反馈入系统，以便全过程被持续地控制和监测，其最终导致具有增加的生产率的高质量制剂。
PAT工具可以是在下列类别下适合的任何工具：(1)获取/分析数据(具有多变量的能力)；(2)过程分析仪；(3)过程控制工具；和(4)允许连续改进和了解过程的管理工具。多变量工具可以是统计学实验设计(DOE)。使这些DOE研究与一些类型的计算机软件(作为过程控制工具)组合以控制和改变过程条件将在此类别下适合。在此情况下，当遭遇过程变化时，来自DOE研究的预测方程或结果然后可以被用于调节最终制剂。过程分析工具可以以三种方式实施：(1)在线(at-line)，或其中样品从系统移除和分离；(2)线上(on-line)，或其中样品被转移，测量，并且返回至过程；或(3)线内(in-line)，或其中样品在过程中被直接测量。过程分析仪生成大量的数据，其可以被收集和储存用于质量控制目的和报告。最后，分析数据以建立对全过程的理解将帮助连续学习和改进处理流，其将促进监管接受(regulatory acceptance)和提供证据以支持对现有过程的改变。
可能的在线或线上测量的实例使用具有流动池附件的Malvern粒度仪(Zetasizer)。电磁阀可以被配置为开启和引导样品至粒度仪流动池的流动，并且一旦足够的样品被装载在池中就将其关闭。粒度仪然后进行测量并且此信息可以被发送至定制的LabVIEW程序。在LabVIEW程序中，分析测量值并且基于上述DOE研究改变过程条件(例如流量)以将粒度重新调节在质量控制界限内，如下面以额外的细节讨论的。
图2图解了连续的脂质体制造过程的脂质-混合阶段。在一个实例中，如图2中显示的，混合器是组合来自一个或多个容器中的每个的溶液的静态混合器。在如图2中显示的具体实例中，脂质-混合阶段包括三个容器，其包括溶解在乙醇中的脂质的三个不同的贮器。选择乙醇-注入方法以制备脂质体。乙醇-注入方法可以发展为连续过程，并且溶剂(乙醇)与用于其它制备方法的其它溶剂(例如氯仿)相比是低毒的。而且，许多脂质在乙醇中是可溶的或适度可溶的。然而，其它有机溶剂也是可能的。
由于每个贮器中的脂质浓度可以是不同的，图2中显示的系统描述了混合在乙醇中溶解的脂质的方式。脂质和乙醇可以被放置在三个玻璃耐压瓶中的每个中，但是其它容器也是可能的。进一步，可能存在与在图2中显示的三个玻璃耐压瓶相比额外的或较少的容器。氮气罐可以被连接至每个容器以最大值20psi流入容器中的每个。其它最大压力也是可能的。此外，脂质和乙醇可以经由泵(例如齿轮泵)而不是使用加压容器从贮器转移。在流体流动中维持恒定流动而没有许多扰动(例如在短时间尺度上突然地改变流量)是有用的。
如图2中显示的，第一组的一个或多个阀可以在一个或多个容器和一个或多个压力罐之间定位。进一步，第二组的一个或多个阀可以与一个或多个容器中的每个流体连通被定位。此外，一个或多个流量计可以在一个或多个压力罐中的每个和第二组的一个或多个阀中的每个之间定位。在一个实例中，第一组的一个或多个阀是电磁阀，并且第二组的一个或多个阀是比例阀。
在图2中显示的实例中，比例阀在容器的下游被定位。当电磁阀开启时，乙醇流动通过一个或多个流量计。在另一个实施方式中，电磁阀可以被替换为空气/压力驱动阀，或可以经由控制系统控制的任何类型的阀。一个或多个流量计中的每个检测乙醇的流量并且将反馈发送至控制器。反馈可以经由比例-积分-微分(PID)控制器被控制。图3是反馈和前馈控制都使用的控制回路的实例。
如图3中显示的，反馈控制可以由调节以维持设定流量并且可以用于增加或维持脂质浓度的泵构成。粒度分析仪和近红外(NIR)传感器可以被用作前馈控制，其在于来自这些组件的测量可以被用作预测模型中的输入，所述预测模型被用于测定脂质浓度。
图4图解了连续的脂质体制造过程的脂质体形成阶段。脂质体形成阶段将由连接脂质和乙醇液体流与水流的“注射口”构成。当两种流开始接触时，将形成脂质体。脂质从乙醇流进入水流的扩散引起脂质形成双分子层和随后形成脂质体。为了将水性介质从器皿转移至注射口，齿轮泵可以被并入设计中，如图4中显示的。由于其具有连续的工作循环，齿轮泵可以是有利的，其防止脉冲流动。例如，蠕动泵由于压缩管材以移动流体的发动机头而具有脉冲流动。此脉冲将引起流量改变并且可能导致具有不均匀粒度的脂质体形成。在一个具体的实例中，智能驱动(I-Drive)齿轮泵可以被用于控制水相或水-有机混合相输入的流量。此齿轮泵是紧凑型无刷DC电磁驱动器并且经由4-20mA模拟信号被控制。湿润部分是：316SS体(body)、聚苯硫醚(PPS)、聚四氟乙烯(PTFE)——其所有均与水和乙醇相容。此齿轮泵的流量范围是大约20-500mL/min。维持恒定流量的其它泵也是可能的。
实例注射口被显示在图5中。这样的注射口使得将乙醇和脂质快速地混合为水相。此快速混合是形成脂质体的位置。注射口可以包括不锈钢，比如304不锈钢或316不锈钢。在另一个实例中，注射口可以包括塑性材料，比如PTFE。其它材料也是可能的。如图5中显示的，注射口包括两个入口，一个用于脂质和乙醇并且一个用于水相或水-有机混合相。联合的输出被设计用于大于大约400mL/min的流量。
用于连续生产脂质体的系统的一个具体的实施方式被显示在图6中。如图6中显示的，系统可以包括与一个或多个制备容器流体连通的混合器。混合器可以是配置为组合来自一个或多个制备容器中的每个的溶液的静态混合器。系统可以进一步包括器皿。实例器皿可以包括水溶液，例如，比如水、低介质离子强度水(例如水中的0.9％ NaCl)、水-有机相混合物、水相缓冲液、或在药物产品中常用的任何类型的缓冲液(例如具有蔗糖的磷酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液)。在一个实例中，系统可以包括多于一个器皿，每个与一个或多个注射口中的至少一个流体连通。系统可以进一步包括一个或多个注射口，每个注射口包括第一入口、第二入口、和出口，如上面关于图5讨论的。第一入口可以包括与混合器流体连通的第一导管，并且第二入口可以包括与器皿流体连通的第二导管。如图6中显示的，第二导管可以延伸通过注射口的出口。第一导管可以在第二导管内同心地定位，以便第一导管延伸通过注射口的出口并且在第二导管内终止。脂质体形成的位置可以不位于注射口内，而近似是第一导管在第二导管内终止的位置。在一个具体的实例中，第一导管从注射口的出口延伸大约0.5英寸至大约24英寸之间，并且第二导管从出口延伸大约0.5英寸至大约24英寸之间，但是其它实例也是可能的。在一个实例中，在系统中形成的多种脂质体是单层脂质体。
在图6中显示的具体的实例中，系统进一步包括连接至一个或多个容器的一个或多个压力罐。系统可以进一步包括与一个或多个容器流体连通的一个或多个阀，和在一个或多个压力罐和一个或多个阀之间定位的一个或多个流量计。在又另一个实例中，系统可以包括一个或多个无脉动泵(例如，齿轮泵)和一个或多个非加压容器以维持低流量。如上面讨论的，一个或多个容器可以每个包括在乙醇中溶解的不同浓度的脂质。正因如此，通过调节包括来自一个或多个容器中的每个的流体的组合的溶液的比率，系统可以因此调节被提供至注射口的第一入口的脂质溶液的脂质浓度。
在另一个实施方式中，一个或多个注射口中的每个的第一入口包括与混合器流体连通的第三导管，其中第三导管在第二导管内同心地定位并且邻近第一导管，以便第三导管延伸通过出口。
系统可以进一步包括粒度分析仪，其配置为测定在系统内产生的脂质体的大小和/或大小分布(例如，平均值、模式、或大小等级的百分数)。可以通过各种仪器和技术分析脂质体的平均粒度直径和粒度分布。这些技术包括但不限于：动态光散射、静态光散射、颗粒跟踪、多种形式的电子显微术和声谱学。为了适应许多脂质体制剂，用于测量脂质体的颗粒分级技术可以能够测量低至25nm的颗粒直径。而且，这些技术中的许多仅适用于离线(off-line)测量并且不能被实施到过程中(即间歇的而不是连续的)。对于连续过程，测量可以具有在线/线上/线内的能力。具有此能力的两种技术是动态光散射和声谱学。
动态光散射基于与颗粒的扩散相关的光或光子波动，其然后涉及粒度信息。此技术在计算粒度数据中使用两种分析；即，基于强度的分析和强度-加权或累积量分析。强度分析基于原始数据(光子波动)。累积量分析基于指数方程并且根据颗粒的强度被加权。对于连续测量，此技术可以通过使用流动池被设置在过程流中。流动池使得样品在一端处进入池并且在另一处离开池。泵可以被用于控制流量和/或停止进入流动池的流动。如果流量足够低以支持层流(大约1-1.5mL/min)，则样品可以在测量期间恒定地流动通过流动池。对于较高的流量，发展出湍流并且较高的速率给颗粒赋予运动，其导致错误的粒度测量。如果需要较高的流量(＞1.5mL/min)，在颗粒分级测量之前，样品可以被快速地装载入流动池，接着停止流动。
声谱学基于声波在倍频下的传播同时测量超声的衰减，其然后用于计算粒度分布。在声波在倍频下的位移与平均粒度和大小分布之间存在关联。此技术的优点在于粒度测量可以在较高的流量下采用，其不受限于与动态光散射一样的层流方案。此技术的缺点在于气泡可能干扰粒度测量。
从质量的角度来看，有用的是脂质体制剂的平均粒度和大小分布在规格内。例如，这些规格可以是平均粒度直径是100nm±10nm以及25nm的粒度分布。对于分批过程和连续过程二者，可以在处理期间或之后测量粒度。然而，连续处理具有的优势在于粒度测量可以随着脂质体被形成连续地进行，并且此信息可以被用于：将不合规格的脂质体转移至废物而不损害整个单元或批次；和修正引起形成不合规格的脂质体的问题。与连续过程形成对比，一旦所有脂质体形成，就将进行分批过程的粒度测量，并且因此不满足粒度规格将导致移除整个批次。在本文描述的系统中，平均脂质体粒度直径和粒度分布可以在连续处理期间被定量监测并且此信息可以被用于反馈算法以维持这些脂质体质量属性。
系统还可以包括控制器(例如，微处理器、FPGA、微控制器等)，其配置为(i)测定脂质体的期望的大小和/或期望的大小分布与通过粒度分析仪测量的测定的大小和/或大小分布之间的差异，和(ii)响应于测定的差异调节系统的一种或多种参数。在一个实例中，调节系统的一种或多种参数包括调节从器皿供应至注射口的第二入口的水溶液的流量。具体而言，如果系统检测到在第二导管中形成的脂质体的大小小于期望的大小，控制器可以配置为降低从器皿供应至注射口的第二入口的水溶液的流量。相比之下，如果系统检测到在第二导管中形成的脂质体的大小大于期望的大小，控制器可以配置为增加从器皿供应至注射口的第二入口的水溶液的流量。
在另一个实例中，调节系统的一种或多种参数包括调节从混合器供应至注射口的第一入口的有机脂质溶液的脂质浓度。如上面讨论的，有机脂质溶液可以包括来自一个或多个容器的混合物。一个或多个容器中的每个可以具有在乙醇中溶解的不同浓度的脂质。正因如此，通过调节包括来自一个或多个容器中的每个的流体的组合的溶液的比率，系统可以因此调节被提供至注射口的第一入口的脂质溶液的脂质浓度。具体而言，如果系统检测到在第二管中形成的脂质体的大小小于期望的大小，控制器可以配置为增加水溶液从混合器供应至注射口的第一入口的有机脂质溶液的脂质浓度。相比之下，如果系统检测到在第二管中形成的脂质体的大小大于期望的大小，控制器可以配置为降低水溶液从混合器供应至注射口的第一入口的有机脂质溶液的脂质浓度。
在又另一个实例中，调节系统的一种或多种参数包括调节从器皿供应至注射口的第二入口的水溶液的粘度。具体而言，如果系统检测到在第二管中形成的脂质体的大小小于期望的大小，控制器可以配置为增加从器皿供应至注射口的第二入口的水溶液的粘度。在一个具体的实例中，这可以通过增加乙醇在水溶液中的百分数完成。相比之下，如果系统检测到在第二管中形成的脂质体的大小大于期望的大小，控制器可以配置为降低从器皿供应至注射口的第二入口的水溶液的粘度。在一个具体的实例中，这可以通过降低乙醇在水溶液中的百分数完成。也可以调节系统的其它参数。
图7根据实例实施方式图解了脂质体形成阶段接着乙醇稀释阶段的示意性图示。如图7中显示的，在注射口的第二导管中形成脂质体后，脂质体可以穿过一个或多个脱气单元。然后，脂质体可以穿过包括第一端口、第二端口和第三端口的三通端口。如图7中显示的，第一端口可以与一个或多个脱气单元流体连通，第二端口可以与器皿流体连通，并且第三端口可以是出口端口。在一个实例中，系统的乙醇稀释阶段可以进一步包括在器皿和三通端口之间定位的齿轮泵。
图8根据实例实施方式图解了连续的脂质体制造过程的浓缩阶段。总脂质浓度是脂质体药物产品的质量属性。总脂质浓度可以指的是形成脂质体双分子层的磷脂和/或其它脂质分子比如胆固醇的量。脂质浓度可以被用于估计脂质体囊泡的量，其可以进一步涉及药物封装，即药物分子在脂质体的水性区室中，涉及药物负载或涉及分子在脂质双分子层内的插入。此外，脂质浓度被用于有效地评价药物与脂质的比率。例如，0.3∶1的阿霉素与脂质的比率导致小鼠中生物学活性的增加。
取决于脂质体组合物中脂质的类型，脂质体脂质浓度可以是毒性的。例如，磷脂酰甘油和磷脂酰丝氨酸脂质体在0.13-3.0mM对一些培养的人细胞系是毒性的，而包含二棕榈酰磷脂酰胆碱的脂质体在4mM下是非毒性的。此外，某些脂质浓度可以促进细胞毒性并且可以被用作测量值以测定对IC50-值的变化的药物效应。例如，当与不具有两性霉素B的脂质体比较时，包含两性霉素B的脂质体增加巨噬细胞样细胞系(Raw 264.7)中的IC50-值。而且，巨噬细胞是脂质体积聚的主要位点并且高脂质浓度可以引起巨噬细胞展示磷脂过载和抑制吞噬功能。
使用9.15mg/mL高至103mg/mL的范围内的总脂质浓度配制FDA批准的药物产品，大多数在9.15mg/mL-34.88mg/mL的范围中。这提供了被认为安全和有效的脂质浓度的药学相关范围。
在过程中的此阶段处，在脂质体产生阶段中产生的脂质体被浓缩用于进一步的处理和纯化。如图8中显示的，浓缩阶段是连续过程，其使用与切向流过滤装置、泵和可以用于控制最终产品脂质体的浓度的定制研发的计算机程序组合的传感器比如NIR传感器。这样的NIR传感器可以是使用两个同时通道——即光吸收和光散射——的双通道浊度传感器。当脂质体转至后续阶段——其由添加将被封装在脂质体内的分子构成——时，从过程的此阶段测定的浓度信息将被反馈至控制。
在某些实施方式中，比如图1-8中显示的，可以使用增材制造过程比如立体平板印刷制作一种或多种组件(例如，注射口，三通端口、第一导管、第二导管等)。正因如此，上面描述的实例注射口可以包括各种材料，例如，包括聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)的碳酸钙。在这样的实例中，上面描述的一种或多种组件可以代表模块、区段、或程序代码的一部分，其包括使用增材制造系统产生这样的装置的处理器或计算装置可执行的一个或多个指令。程序代码可以被存储在任何类型的计算机可读介质上，例如，比如包括磁盘或硬盘驱动器的存储装置。计算机可读介质可以包括非暂时性计算机可读介质，例如，比如短时间段内存储数据的计算机可读介质如寄存器存储器、处理器缓存、或随机存取存储器(RAM)。计算机可读介质也可以包括非暂时性介质，例如，比如二次或持久性长期存储，如只读存储器(ROM)、光盘或磁盘、或光盘只读存储器(CD-ROM)。计算机可读介质也可以是任何其它易失性或非易失性存储系统。计算机可读介质可以被认为是计算机可读存储介质，例如，或有形存储装置。
图9根据实例实施方式图解了强调连续过程的主要阶段与每个主要阶段的细分部分的因果图。图9图解了具有形成“质量脂质体制剂”的单一效果的整个过程的因果图。对于质量脂质体制剂，过程将需要实现足够的控制(例如控制粒度和粒度分布)，是可再现的和准确的，并且具有涵盖制剂变化的适应能力。
图10根据实例实施方式图解了概括导致获得连续过程的准确粒度数据的变量的因果图。此图的效果/结果是准确测量连续过程的颗粒分级数据。原因被细分为流动条件、流动池和动态光散射(DLS)测量。流动条件概括了如何控制样品至仪器的流动(例如泵选择)和流动要求(例如连续流动和层流vs.停流)。流动池具有限制，比如流动池的总体积和压力评级，其将限制样品通过流动池的流量。最后，DLS测量参数将进一步影响颗粒分级数据的准确性。这些参数包括温度、测量持续时间(例如10秒)、每次测量运行的数目和衰减设置。由于DLS使用宏观拟合算法测定粒度，样品温度和光子计数率将影响粒度分析。例如，如果温度被设定在25℃，但是样品温度实际是22℃，则测量的粒度可以高于实际的，这是由于颗粒在较低温度下比较高温度下更慢地移动。在此情况下，优选地，设定温度和实际样品温度是类似的，以取得准确结果。作为第二实例，光子计数率是检测到光子的比率。对于低计数率，不存在供宏观拟合算法测定粒度的足够的信息。此外，在较高的计数率下，DLS检测器可以不再在线性范围中操作。因此，应当测定提供准确数据的计数率的范围。
图11根据实例实施方式图解了概括影响经由NIR传感器的脂质浓度检测的变量的因果图。例如，存在两种常见的NIR传感器样式，即探头设计或流动池设计。探头设计可以更倾向于检测窗口处的气泡积聚。此外，探头设计可以具有限制的光程长度(例如高至仅10mm)，而流动池设计可以具有更长的光程(例如高至160mm)。较长的光程将适应散射少量光的样品(即低浓度下较小直径的颗粒)。此外，可以在单一波长或一组波长下和在多个检测角度下设计NIR探头。对于距光源0°的检测角度，测量值被称为吸光度并且以单位比如CU测量。可以在角度比如11°或90°处检测到散射光。对于散射光，非散射光被用作解释水性介质的变化的参考。
图12根据实例实施方式图解了关于材料和过程变量概括影响脂质体形成过程的变量的因果图。原因被细分为过程变量、材料变量和脂质摩尔比。过程变量包括流动的类型(例如层流对湍流)、泵的类型(例如脉动的对非脉动的)和雷诺尔德数。雷诺尔德数是测定混合程度的手段——较高的雷诺尔德数指示较大的混合程度。雷诺尔德数依赖于粘度、温度和流速。材料变量被细分为脂质的类型和水相。脂质的类型将显著地影响脂质体粒度。例如，每个脂质具有转变温度，其指示脂质在某一温度下的流动性。可以处于流动状态的脂质可能可以形成较大的脂质体；然而，这在此时没有被清楚地理解。脂质摩尔比是可能影响脂质体粒度的另一个原因。由于许多脂质体制剂由多种脂质构成，脂质的组合优选地导致支持层状结构的包装参数；否则，脂质体将不形成。因此，例如胆固醇和其它脂质的脂质比率优选地等于大约1，以便支持层状相——其是将形成脂质体的相。
图13是用于连续生产脂质体的实例方法的框图。在图13中显示的方法呈现了可以由上面关于图1-12描述的组件中的一种或多种使用的方法的实施方式。实例方法可以包括如由图13中的框图解的一个或多个操作、功能或动作。虽然框以连续的顺序被图解，但是这些框也可以并行地，和/或以与本文描述的那些不同的顺序进行。而且，基于期望的实施，多个框可以被组合为较少的框，被划分为额外的框，和/或被移除。
此外，对于方法和本文公开的其它过程和方法，框图显示了本实施方式的一种可能的实施的功能和操作。就此而言，每个框可以代表模块、区段、或程序代码的一部分，其包括用于实施过程中具体的逻辑功能和步骤的处理器或计算装置可执行的一个或多个指令。程序代码可以被存储在任何类型的计算机可读介质上，例如，比如包括磁盘或硬盘驱动器的存储装置。计算机可读介质可以包括非暂时性计算机可读介质，例如，比如短时间段内存储数据的计算机可读介质如寄存器存储器、处理器缓存、或随机存取存储器(RAM)。计算机可读介质也可以包括非暂时性介质，例如，比如二次或持久性长期存储，如只读存储器(ROM)、光盘或磁盘、或光盘只读存储器(CD-ROM)。计算机可读介质也可以是任何其它易失性或非易失性存储系统。计算机可读介质可以被认为是计算机可读存储介质，例如，或有形存储装置。
此外，对于方法和本文公开的其它过程和方法，图13中的每个框可以代表被接线以执行过程中具体的逻辑功能的电路。
如图13中显示的，用于连续生产脂质体的一个实例方法包括(a)使脂质的溶液和来自一个或多个容器的有机溶剂混合以产生有机溶剂-脂质溶液，(b)在第一流量下将有机溶剂-脂质溶液提供至注射口的第一入口，其中第一入口与第一导管流体连通，(c)在第二流量下将水溶液提供至注射口的第二入口，其中第二入口与第二导管流体连通，其中第一导管在注射口的出口处在第二导管内同心地定位，并且其中第一导管延伸通过注射口的出口，和(d)使有机脂质溶液和水溶液混合以产生多种脂质体。
在一个实例中，第一流量在大约5mL/min和大约40mL/min之间，并且第二流量在大约70mL/min和大约300mL/min之间。在一个实例中，有机溶液通过第一管的第一流动和水溶液通过第二管的第二流动在层流或过渡流动条件下。当两个流相互作用时，由于每个流的流量是不同的，形成湍流混合模式(patter)。在另一个实例中，有机溶液通过第一管的第一流动和水溶液通过第二管的第二流动是湍流。进一步，在一个实例中，水溶液包括水-有机溶剂混合物，并且多种脂质体是单层脂质体。
在另一个实施方式中，方法可以进一步包括测定在第二管内产生的多种脂质体中的一种或多种的大小，测定一个或多种脂质体的期望的大小与一个或多种脂质体的测定的大小之间的差异，和响应于测定的差异，调节第二流量和有机脂质溶液的脂质浓度中的至少一种。在一个实例中，在多种脂质体在恒定的流量下移动的同时完成测定多种脂质体中的一种或多种的大小。在另一个实例中，测定多种脂质体中的一种或多种的大小包括使泵短暂地停止以阻止多种脂质体中的一种或多种的流体流动，在多种脂质体静止的同时测定多种脂质体中的一种或多种的大小，和启动泵以恢复流体流动。
在另一个实施方式中，方法可以进一步包括测定在第二管内产生的多种脂质体中的一种或多种的大小分布，测定一个或多种脂质体的期望的大小分布与一个或多种脂质体的测定的分布大小之间的差异，和响应于测定的差异，调节第二流量和有机脂质溶液的脂质浓度中的至少一种。
在另一个实施方式中，方法可以进一步包括使多种脂质体转至脱气单元，使多种脂质体从脱气单元转至三通端口的第一端口，在第三流量下将水性缓冲液提供至三通端口的第二端口，和使多种脂质体和水性缓冲液混合。在这样的实例中，多种脂质体和水性缓冲液的混合物具有大约5％体积乙醇。进一步，在这样的实例中，第三流量可以在大约300mL/min和大约10000mL/min之间。
在另一个实施方式中，方法可以进一步包括测定多种脂质体的总脂质浓度，测定脂质体的期望的总脂质浓度和脂质体的测定的总脂质浓度之间的差异，和响应于测定的差异，调节第二流量和有机脂质溶液的脂质浓度。
在又另一个实施方式中，方法可以进一步包括使多种脂质体转至切向流过滤单元，测定多种脂质体的总脂质浓度，测定脂质体的期望的总脂质浓度和脂质体的测定的总脂质浓度之间的差异，和响应于测定的差异，调节切向流过滤单元的流量和/或调节切向流过滤单元的压力。在这样的实例中，可以经由NIR传感器测定多种脂质体的总脂质浓度。
实施例1
缩写：
雷诺尔德数-Re
流速比-FVR
动态光散射-DLS
多分散指数-PDI
实验设计-DOE
31磷核磁共振-P-NMR
1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱-DMPC
1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱-DPPC
1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱-DSPC
1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-(1′-rac-甘油)(钠盐)-DPPG
1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱-DOPC
胆固醇-Chol
负染色透射电子显微术-NS-TEM
低温透射电子显微术-Cryo-TEM
美国国家仪器(National Instruments)-NI
国际协调会议(International Conference on Harmonisation)-ICH
过程分析技术-PAT
组合输出流量-Q
运动粘度-v
直径-D
外直径-OD
内直径-ID
横截面面积-A
材料和方法：
使用湍流混合器的过程的概述
通过改进的乙醇注入方法制备脂质体。此系统的示意图被展现在图1中。装配三个单独的316不锈钢罐以容纳脂质+乙醇溶液。这些罐被加压(通常在20psi下)并且来自这些罐的流量由模拟流量计(McMillian)和比例电磁阀(Aalborg)控制。流量计针对水进行工厂校准，其具有小于1％误差。对于脂质+乙醇流动流，这些流动传感器针对乙醇进行重新校准并且具有0.9989的R平方(R-squared)值，其具有5-50mL/min的工作范围。三个罐然后使用4-通连接器(Swagelok)在单点处被连接。实施静态混合器以确保来自三个罐的脂质+乙醇溶液在到达注射口——乙醇和水流在其中汇聚——之前被充分地混合。水相体积流量由齿轮泵控制。混合的脂质+乙醇溶液然后在多种流量下注入水相。乙醇相的管材ID是0.508或1.016mm(1.588mm OD)。水相管材ID被固定在3.175或4.572mm。脂质+乙醇相的典型流量是5-40mL/min并且水相的典型流量是60-400mL/min。
整个过程由使用美国国家仪器(NI)软件编写的定制程序控制。数据采集系统(NI PXIe-1078)与多种NI模块组合以适应多种输入/输出信号(例如模拟和数字输入/输出、计数器、电路交换等)。整个系统是自动化的并且仅需要用户限定脂质的最终脂质浓度和摩尔比。监测过程变量比如流量、压力和温度，并且对于一些变量，使用定制的计算机算法自动地进行调节。例如，在计算机程序中实施比例-积分-微分控制以精确地控制乙醇相和水相二者的流量。
脂质体制备
1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-(1′-rac-甘油)(钠盐)(DPPG)和1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)购自LipoidTM。胆固醇(Chol)购自Sigma。脂质(5-30mM总脂质)被溶解在乙醇(USP级)中并且添加至三个罐中的一个。为了在乙醇中溶解脂质，脂质混合物通常被加热至60℃持续10分钟并且超声5分钟或直到所有脂质被完全地溶解。然后使乙醇溶液在运行任何实验之前达到室温(23℃)。在一些情况下，整个脂质被组合入单个罐并且纯乙醇被添加至其它罐进行稀释。
用于粒度和ζ-电位的动态光散射
使用用于ζ电位的Malvern粒度仪Nano ZS90和用于大小的Malvern粒度仪Nano S进行测量。样品在测量之前被放置在塑料的一次性比色杯(或对于ζ-电位，毛细管池(capillary cell))中并且平衡至25℃。由于乙醇在样品中存在，所有样品被稀释至1.64％v/v(乙醇/总溶液)并且在Malvern粒度仪软件中调节粘度和折射率。粒度测量包括z-平均数、PDI、体积百分数、强度平均值和强度宽度。ζ电位测量包括ζ-电位和ζ偏差。所有测量均以一式三份运行。
流动可视化
尼罗红(Sigma-)被用作染料并且溶解于乙醇。此溶液被添加至三个压力罐中的一个。在乙醇中溶解的脂质被添加至第二罐。脂质和尼罗红溶液在不同的流动条件下以1∶1体积比运行。由于尼罗红基于溶液极性改变颜色，溶液在乙醇中显出粉色，在乙醇中溶解的脂质显出粉色/橙色并且当与水而非脂质溶解或混合时显出紫色/黛青色(bluish)。
纳米颗粒跟踪分析
使用Malvern NanosightTM仪器进行测量。样品被稀释至0.05％ v/v乙醇。在一些情况下，需要额外的稀释以达到用于粒度分析的可接受的条件(例如随着囊泡直径降低，囊泡的数目指数地增加)。对于测量，记录平均值和标准偏差。所有测量均以一式三份运行。
负染色透射电子显微术(NS-TEM)
在pH 5.00下的10mM乙酸铵-乙酸缓冲液中制备脂质体。对于每个样品，大约3μl的脂质体被放置在等离子体清洁的碳涂覆的载网(Ted Pella Inc，#01840)上。在1分钟培育后，样品被几滴0.25％的乙酸铀酰染色剂湮没没过。吸掉过量的溶液并且空气干燥样品大约30分钟。载网在装备有LaB6发射器和先进的显微技术2k XR40CCD照相机的FEITecnai12Biotwin TEM中在80.0kV下成像。对于每个样品，收集7-10张图像并且使用ImageJ手动测量多于500个颗粒/样品的直径。然后收集数据并且通过使用高斯分布拟合功能拟合非线性分析，测定平均粒度和标准偏差。
Cryo-透射电子显微术(cryo-TEM)
使用在120kV下操作和在最小剂量系统下查看的cryo-透射电子显微术(Jeol1400TEM/STEM)进行Cryo-TEM。简略地，2μL的脂质体样品被放置在辉光放电的有孔的碳铜载网(Quantifoil R 2/1)上。在25℃和82％湿度下使用载网投入冷冻箱(plunge freezer)(Leica EM GP)，样品被自动地吸取2s以移除过量的液体并且被投入-175℃下的液态乙烷浴。样品被储存在液氮中直到它们被转移至cryo-TEM固定器(Gatan 914)并且在120kV下在最小剂量系统下在预冷的cryo-TEM中观察。使用数字CCD照相机(GatanORIUSTMSC1000)在10000×-20,000×的放大倍数下记录图像。
实验设计研究
在脂质体粒度上进行实验设计以分析脂质浓度和水相流量。水相流量范围被设计以覆盖导致低和高雷诺尔德数的大范围的流动条件。此外，这些流量覆盖系统处理能力的全范围(即泵流量工作范围)。基于将可能导致形成脂质体的报道的脂质wt％研究脂质浓度。定制的具有5个中心点和3次重复的2×4全因子设计被选择为初始设计(图2)。选择此设计以支持相互作用和高次项以及保留在对最终乙醇百分数的限制内。原始设计被扩大以增加设计空间和增加模型的统计显著性(图2)。关于模型分析，R平方项(term)、方差分析(p＜0.05)和失拟(lack of fit)p-值(p＞＞0.05)被用于确定充分的拟合和包括模型相互作用项。对于此研究，仅Malvern粒度仪Nano S被用于测定粒度和PDI。通过SAS使用JMP实施模型设计和分析。
雷诺尔德数和流速比计算
雷诺尔德数(Re)被定义为Re＝QD/vA，其中Q是组合输出流量，v是混合物的运动粘度，D是输出管的直径和A是输出管的横截面面积。基于报道的动态粘度和密度值，针对最终的乙醇-水混合物计算运动粘度。通过SAS使用JMP产生等式以预测运动粘度，其依赖于乙醇摩尔分数和输出温度。由于混合水和乙醇混合物的焓是放热的，最终的输出温度从两个相的初始温度(即23℃)改变高至～32℃。这些温度针对多种流动条件被记录并且被用于Re计算。流速比(FVR)是FVR＝vi/vo，其中vi是内管速度和vo是外管速度。从管的体积流量和几何结构直接计算两种速度。对于外管速度计算，从外管内直径减去内管外直径。
结果：
乙醇和水相的混合
装配注射口以适应同向流动中同轴湍流喷射的形成。设计以运送乙醇相的柱形管(第一导管)在第二或外柱形管内同心地定位(图15)。第二柱形管(第二导管)在喷射形成之前运送水相。存在对实现用于稳定的湍流喷射的合适条件有用的三个标准。第一个是所有流量可以是无脉动的以将流量波动减小至可忽略的水平。另外的两个标准来自流体动力学的无量纲的值：(1)雷诺尔德数(Re)和(2)流速比(FVR)。Re是就在“喷射位置”的下游的混合的乙醇/水流动流的Re并且将随后被称为Re混合物。
流体流动性质和脂质体多分散指数之间的关系
注射口的流体流动性质涉及脂质体多分散指数。使用动态光散射(DLS)分析脂质体并且0.10的多分散指数(PDI)被认为是单分散性的上限。乙醇流量在5-40mL/min的范围内并且水相流量在70-400mL/min的范围内。有机相由在乙醇中溶解的DPPC∶DPPG∶胆固醇(4.5∶0.4∶3摩尔比)构成并且水相是10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4。内管直径是0.508mm或1.016mm。外管直径是3.175mm或4.572mm。此外，最大的最终乙醇百分数被选择小于40％ v/v乙醇以减小形成任何非脂质体结构的可能性。对于此脂质制剂，平均ζ-电位是-39.4±6.34mV(对所有样品进行平均)。
如方法部分中概括的，流量被转换为Re混合物和FVR。为了取得多种Re混合物和FVR组合，调查不同的内和外管直径。从图16A清楚的是，为了实现单分散的系统，某些Re混合物和FVR组合对形成稳定的喷射是有用的。图16B描绘了来自图16A的FVR对Re混合物图上的四个位置的流体概况。在Re混合物＜500和FVR＜7下，观察到分层流，其中脂质+乙醇保持分离并且移动至管材的顶部(图16A-1)。在此情况下发生有限的混合并且将在下游发生实际的脂质混合/脂质体形成(即可能在收集器皿中)——其导致多分散的脂质体。在FVR≤2和Re混合物＞～500下，形成弱的喷射并且这还导致多分散的脂质体(图16B-2)。描绘的其它两种流动条件导致在注射位点下游的快速混合和稳定的喷射形成，其产生单分散的脂质体(图16B-3和图16B-4)。在单分散的脂质体的情况下，明显的是脂质体形成依赖于混合并且可以通过Re混合物预测(图16C)。在高的FVR(即≥7)下，脂质体粒度是单分散的并且独立于FVR并且仅根据Re混合物改变。后一种情况概括了单分散的脂质体可以在导致相同的FVR和Re混合物条件的各种注射口尺寸下形成。
实验设计：脂质浓度对粒度
对于单分散的脂质体群体，完成实验设计(DOE)研究以展现注入的脂质浓度对脂质体粒度的作用。乙醇流量被固定在40mL/min，这是由于此流量对应于产生单分散的颗粒的流动区域(图16A)。注射口的尺寸被固定在3.175mm的水相管材ID和0.508mm的乙醇相管材ID。对于DOE研究，因素包括：(1)水相流量(70-400mL/min)和(2)注入的脂质浓度(5-30mM)。水相是10mM磷酸盐缓冲液。脂质组成被固定在DPPC∶DPPG∶胆固醇(4.5∶0.4∶3摩尔比)。DOE模型具有0.985的实际对预测值的R2-值、＜0.0001的方差分析p-值和＝0.331的失拟p-值(表1)。此研究的表面概括展现了平均粒度对水相流量的依赖性(图17)。对于此制剂，最小的脂质体在58nm周围出现并且最大的在240nm周围出现。对于所有实验，PDI值平均为0.05±0.04，并且仅在较低的水相流量(例如70mL/min)下开始达到0.10。因而，脂质体可以在研究的整个流量范围内被认为是单分散的。脂质浓度对粒度具有适度的积极影响。显然水相流量相互作用项在控制z-平均脂质体粒度中是突出的。
脂质类型对脂质体粒度的作用
从上面的结果明显的是，Re混合物和脂质浓度可以在控制脂质体粒度中发挥作用。为了确定脂质特性是否影响脂质体粒度，调查了四种不同的脂质分子，即DOPC、DMPC、DPPC、DSPC和DPPC∶DSPC(1∶1摩尔比)的混合物。每种制剂还包含胆固醇和DPPG。脂质∶DPPG∶胆固醇的摩尔比保持恒定(4.5∶0.4∶3.0)并且5mM总脂质被溶解在乙醇相中。标绘z-平均粒度和PDI值(图18)。明确的是，脂质分子显著地改变脂质体粒度。具有平均粒度的脂质体可控制地由大约25nm高至465nm形成并且最大PDI值等于0.18；然而，大多数样品的PDI≤0.05(图18)。
水相添加剂对脂质体粒度的作用
对水相的添加剂被用于测定对脂质体形成的任何影响。对于此研究，脂质制剂在DPPC∶DPPG∶胆固醇(4.5∶0.4∶3摩尔比，注入5mM脂质)下保持恒定并且所有样品包含10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4。NaCl；甘油；和乙醇作为添加剂被调查(图19)。在不具有添加剂的10mM磷酸盐缓冲液中制备的脂质体被用作对照。对于所有流动条件，包含26wt％甘油的制剂最类似于对照。添加10-30％ v/v乙醇至水相在最大的流动条件下增加粒度。30％ v/v乙醇添加引起脂质体线性地依赖于水相流量。与对照比较，添加0.9wt％ NaCl在所有条件下显著地增加平均粒度。
使用多种测量技术比较粒度和大小分布
为了准确地评估平均粒度和粒度分布，使用了多种技术(即动态光散射、纳米颗粒跟踪和负染色TEM)。三种技术中的每种可以被用于测定平均粒度和粒度分布；然而，每种技术根本地不同。动态光散射是基于强度的测量，而纳米颗粒跟踪和负染色TEM是基于数目的。因此，不期望比较来自每种技术的绝对值，而是比较趋势和推断是否存在单峰的颗粒群体。在pH＝5.0下的10mM乙酸铵-乙酸缓冲液中制备样品以减少负染色程序中的人为产物。此研究的脂质组成是DMPC∶胆固醇∶DPPG(4.5∶3.0∶0.4摩尔比)并且15mM脂质被注入水相。在恒定的乙醇流量(40mL/min)但是不同的水相流量(即100、150和375mL/min)下制备三种样品。三种样品被选择是因为它们被估计分别产生具有大约350、140和70nm的平均粒度的脂质体(图18)。图20展示了来自三种单独的技术的平均粒度数据。明确的是，纳米颗粒跟踪和动态光散射展示了单分散的群体。负染色产生了总体较宽的颗粒分布和可能在较大-大小的脂质体样品中存在的较小的颗粒。然而，由于可能在样品制备期间发生的低数目计数和多种人为产物，负染色TEM结果可能不充分地代表脂质体群体。图21是每种样品和技术的平均粒度和标准偏差的的图。使用所有三种颗粒分级技术展现了平均粒度趋势是相同的，即对于水性流量的增加(较高的Re混合物)，粒度降低。对于所有三种样品和每种粒度分析技术，标准偏差是平均值的15.8±4.70％。
脂质体的负染色TEM显微照片
图22A-C是来自粒度技术分析的上面概括的三种不同样品(图20)的显微照片。显微照片展现了样品之间的粒度差异。每种样品集显示是单分散的。图22D展现了脂质体如何受染色过程影响。似乎脂质体处于三种可能的状态中的一种：(1)“部分水化的”脂质体(这些脂质体显示是脱水的，但是部分地保留如处于水化状态的结构)；(2)扁平堆叠的双分子层；或(3)扁平堆叠的双分子层和/或单一双分子层的混合物。“部分水化的”脂质体具有脱水的脂质体的外观并且具有更均匀的大小，而“扁平的”状态在大小的方面变化。此明显的大小变化(其由此技术需要的处理造成)可以解释为什么来自NS-TEM显微照片的平均粒度和大小分布与其它粒度分析技术比较总体上更大。
脂质体的Cryo-TEM显微照片
来自图23A-C的显微照片是在图20和图22中概括的三种不同样品的显微照片。这些显微照片确认了先前陈述的粒度趋势和这些脂质体是单层的。比较每种脂质体的可视的黑带，对于小的至大的脂质体，带的厚度是非常类似的。
过论：
经由同轴湍流喷射的脂质体单分散性
由FVR和Re混合物表征的流动条件导致多分散的或单分散的脂质体(图16A)。多分散的脂质体在两种不同的流动条件下——即明显的分层流(图16B-1)和弱的喷射(图16B-2)——形成。分层流导致流分离和不受控制的混合。弱的喷射显示发展出导致沿着喷射的回流的涡流——其也导致不受控制的混合。
为了取得单分散的脂质体，采用喷射的形成(图15)。取决于流动条件，似乎在导致湍流的喷射之前存在层流/过渡流的共存(图16B-3和图16B-4)。水相似乎不是显著地稀释此层流/过渡流区域中的乙醇相；否则，由于流体极性的改变将观察到荧光标志(尼罗红)的颜色变化。因此，可以陈述的是，有限的混合遍及层流区/过渡区发生。对于喷射的形成，已经显示中心速度降低和喷射边界径向地扩展，其导致注入相(在此情况下，脂质+乙醇)的浓度梯度。因此，大多数混合在中心速度降低和喷射边界径向地扩展的地方发生。由于脂质+乙醇相的扩展建立了径向的浓度梯度，在此提出这促进单分散的脂质体的受控制的形成。而且，当Re＞＞1时对流惯性力与粘性力比较是突出的，其支持增加Re将对应混合程度的增加的推论，因而形成不同大小的脂质体。
对于单分散的脂质体的形成，显然Re混合物与脂质体粒度直接相关。此外，在大约7的FVR以上，脂质体形成独立于FVR并且进依赖于Re混合物。此观察通过使图16A与图16C比较完成，其中在相同的Re混合物下形成的脂质体具有类似的粒度，而不论FVR。这指示了来自湍流喷射的脂质体形成可以主要是对流过程并且在喷射的湍流区中的径向扩展处发生。
考虑磷脂制剂以及Re混合物和FVR，包含DSPC、DPPC和DMPC的制剂主要形成单分散的脂质体(对于FVR≥7)。一些多分散性在较低的水性流量下是明显的并且可能由于较高的乙醇百分数使脂质体不稳定。然而，包含DOPC的制剂在较低的水性流量下仅形成单分散的脂质体。对于DOPC，较高的Re混合物显示使制剂不稳定，其可能由于小颗粒(～25nm)的高曲率和/或DOPC的低相变温度——其使得流体双分子层更易于在环境温度条件下融合。
使用同轴湍流喷射的脂质体制剂模型
将在乙醇中溶解的脂质注入水相通过性质比如粘度、密度、摩尔体积、混合的热(在此情况下是放热的)、脂质溶解度、和脂质结构(例如脂质分子体积)的变化被进一步复杂化。上面的任何性质似乎不是单独地与观察到的脂质体的粒度变化相关。通过使用Re混合物，考虑下列项：粘度、密度和显热增量。
脂质体如何形成的准确机制仍是难以捉摸的；然而，脂质体形成过程的详细模型开始通过实验发现浮现。此领域中的初始工作已经概括了双分子层的磷脂片段(BPF)随着乙醇的体积百分数降低形成和融合在一起。对于湍流喷射，基于产生单分散的脂质体的BPF的形成和后续融合的模型导致一些疑问。在喷射的中心线速度耗散期间，多个涡流形成并且随后切断(shear off)。由于此过程是湍流的，将发展出不同大小的涡流并且这些微环境中的混合将显示是不均匀的。因此，在此过程期间融合的BPF将仅形成多分散的颗粒。
在图24中提出脂质体形成的新模型。此模型基于高度流体脂质/乙醇聚集体(在此表示为前体脂质体(pro-liposome))的生长。最初，脂质被溶解在乙醇中形成溶液。如上面概括的，乙醇在喷射位置处径向地扩展，其导致浓度梯度。在此刻，水与乙醇+脂质相混合并且前体脂质体开始在大小方面直到达到临界的溶解度(～50-60％ v/v乙醇)。最终脂质体大小然后依赖于下列因素：(1)乙醇扩散出前体脂质体、(2)前体脂质体流动性、(3)脂质包装、(4)前体脂质体表面电荷和(5)脂质浓度。
通过添加过量的乙醇至水相示例乙醇扩散出前体脂质体。乙醇已知能够穿过脂质双分子层，即从水相移动入一个双分子层小叶并且一个小叶穿过至另一个。此外，P-NMR研究已经确认了乙醇引起脂质体双分子层成为较少包装的。使水相中10-30％ v/v过量的乙醇与0％ v/v过量的乙醇比较，乙醇扩散出前体脂质体在混合过程期间将是较慢的并且因此双分子层由于较大量的乙醇将具有较高的渗透性。因此，将存在更多时间和空间供脂质分子进入前体脂质体——因而在大小方面生长。而且，添加26wt％甘油至水相不引起粒度的任何主要变化，其指示与乙醇扩散出前体脂质体和对流力比较，增加的体积粘度是较不必需的。
脂质相变在评估前体脂质体的流动性中是有用的。以下列顺序排列此研究中磷脂的相变温度：DSPC＞DPPC＞DMPC＞DOPC(最高至最低)。通过仅仅比较饱和的磷脂，在由这些实验中的放热混合引起的温度范围(即23-32℃)内，DSPC是最有序的而DMPC是最流动的。似乎当脂质分子处于流体/无序状态而不是凝胶/有序状态时形成脂质体。例如，DPPC∶DPPG(7.5∶0.4摩尔比)形成粘性的凝胶样结构，而非5mM脂质注入下的脂质体(数据未显示)。应当注意添加胆固醇增加脂膜的流动性/无序；因而，使得在低于对应的纯脂质的脂质相变温度下可能形成脂质体。更有序的结构将阻止脂质分子进入前体脂质体——其导致较小的脂质体。此推论解释了为什么以下列最小至最大的顺序形成脂质体(DSPC＜DPPC＜DMPC)。包括温度、胆固醇百分数和带电脂质百分数的影响的更详细的分析可以对彻底地解释上面的观察是有用的。
通过DOPC示例脂质包装的变化，其增加了额外的复杂性，其在于此脂质是不饱和的(即它在每个烃尾部中具有双键)。DOPC的几何包装参数是＝1.08并且当与其它脂质混合时可以支持几何学上较小大小的颗粒(即直径低至25nm)。相比之下，DSPC、DPPC和DMPC脂质分子具有～1的包装参数并且形状是更圆柱形的。因而，即使DOPC的相变温度相对于实验条件低得多，这些DOPC脂质体也可以支持与DSPC相比更高曲率/更小大小的脂质体。而且，DSPC、DPPC和DMPC的更圆柱形的形状可以解释为什么这些脂质体在高的Re混合物下显示～60-70nm的平均粒度下的平台。这指示脂质混合物的总脂质包装是对脂质体粒度的几何限制。
在表面电荷的情况下，将盐添加至水相(例如0.9wt％ NaCl)将降低前体脂质体的表面电荷并且减小前体脂质体和个体脂质分子之间的静电排斥。此减小的排斥将允许更多脂质分子进入前体脂质体，因而增加最终脂质体大小。
最后，脂质浓度导致脂质体粒度的适度增加。此大小的增加进一步支持前体脂质体模型，这是由于更多脂质分子将被募集入前体脂质体。应当注意仅仅注入5-30mM脂质，其是与系统中的其它组分比较相对小量的脂质。因此，增加脂质浓度将被期望增加脂质体的数目，而不是成比例地增加脂质体的大小。而且，太高的注入脂质浓度可能引起形成其它类型的结构(例如堆叠的双分子层)和增加多分散性。
总之，前体脂质体模型显示对使用湍流喷射的脂质体形成过程提供更清楚的解释。由上面的讨论，对于固定的因素组(即脂质类型、脂质浓度、水相添加剂等)，Re混合物可以被用于预测脂质体粒度，但是当改变这些因素时将不预测粒度。
使用多种测量技术的粒度分析
动态光散射是通过分析多种参数测定单分散性的合适的技术。这些参数包括z-平均数、强度平均值、体积百分数和PDI。z-平均数由累积量分析(强度加权拟合算法)计算并且强度平均值通过强度拟合算法直接测定。当z-平均数和强度平均值二者非常类似时，它指示存在单一群体。此外，由于将数据从强度转换至体积使重点远离平均粒度，100％的体积百分数进一步指向单分散的系统。不同于100％的体积百分数可以指示存在额外的颗粒群体。然而，由于任何较大的颗粒的光强度将遮蔽较小的颗粒的光强度，在不与其它技术比较的情况下，在仅依赖于动态光散射中存在最初的不确定性。此遮蔽可能阻止较小的颗粒被检测到，甚至当将原始强度数据转换至体积测量值时。
比较纳米颗粒跟踪和动态光散射，两种技术似乎关于平均粒度和大小分布显示类似的结果。由于这些技术均使用完全不同的方法测定粒度(即分别地跟踪颗粒对拟合函数)，平均大小和大小分布的一致极大地支持此脂质体处理技术具有可控制地产生大的大小范围的单分散的脂质体的能力。
NS-TEM显微照片作为表征脂质体的方式被原始地获取并且可能使得较小的颗粒群体——其可能不能被动态光散射检测到——可视。在分析TEM图像后，不可能测定准确的平均直径或粒度分布。一个原因是由于处理条件明显地引起多种状态的脂质体存在(即部分水化至扁平堆叠的双分子层)。第二个原因是显示为小颗粒的东西可能实际是较大的颗粒的片段。这些可能的片段可以解释为什么经由Nanosight的纳米颗粒跟踪分析——其分析30,000-90,000个颗粒/样品——不显示较宽的颗粒分布和40e∶100a样品中可能的第二颗粒群体(图20)。
最后，cryo-TEM显微照片进一步确认了使用上面概括的三种粒度分析技术观察到的平均粒度趋势。cryo-TEM相对于NS-TEM的优势在于样品被可控制地冷冻以防止冰晶损害和脂质体以更自然的状态被成像。此外，这些显微照片确认了脂质体是单层的。
结论：
湍流喷射混合器可以被用于形成具有已知粒度的、单层的、单分散的脂质体。单层的、单分散的颗粒具有～25nm至＞465nm内的平均大小。脂质体平均粒度高度依赖于Re混合物并且独立于流速比。使用三种根本上不同的粒度分析技术分析脂质体的单分散性和平均粒度趋势。动态光散射和纳米颗粒跟踪展现了脂质体是单分散的并且大小随着Re混合物降低而增加。最后，经由前体脂质体生长模型——其考虑水相添加剂、脂质分子的类型、和脂质浓度——说明了概括脂质体形成过程的新模型。
表格：
表1：对脂质浓度vs.粒度的DOE——通过统计显著性分类的模型参数估算值
实施例2
材料和方法：
材料
1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)；1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)；1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-(1′-rac-甘油，钠盐)(DPPG-Na)；并且类脂S PC-3(HSPC)购自LipoidTM。胆固醇(Chol)购自Sigma。乙醇(200酒精度(proof)，ACS/USP级)购自Pharmco-AAPER。
实验方法
脂质体形成和稀释
通过改进的乙醇注入方法制备脂质体。此系统的示意图被展现在图7中。三个单独的316不锈钢罐包含脂质+乙醇溶液。这些罐被加压(在20psi下)并且来自这些罐的流量由模拟流量计(McMillian)和比例电磁阀(Aalborg)控制。流量计针对水进行工厂校准，其具有小于1％全尺寸误差。对于脂质+乙醇流动流，这些流动传感器针对乙醇进行重新校准并且具有0.9989的R平方，其具有5-50mL/min的工作范围。三个罐然后使用4-通连接器(Swagelok)在单点处被连接。实施静态混合器以确保来自三个罐的脂质+乙醇溶液在到达注射口——乙醇和水相I流在其中汇聚——之前被充分地混合。水相I体积流量由齿轮泵控制。为了形成脂质体，混合的脂质+乙醇溶液然后在多种流量下注入水相(水相I)。乙醇相的管材ID是0.508(1.588mm OD)。水相I管材ID被固定在4.572mm。脂质+乙醇相的流量在5-40mL/min的范围内并且水相I的流量在70-300mL/min的范围内。
在形成脂质体后，脂质体穿过脱气单元(Liqui-Cel)接着是第二个三通T-端口。此三通T-端口具有用于脂质体的一个入口、用于水性缓冲液的第二入口和一个出口。第二齿轮泵被用于控制水相进入此端口的流动(水相II)。水相II流量被调节，以便混合的水相将具有5％ vol.乙醇。水相II流量在690-460mL/min的范围内。
数据采集系统和计算机软件
整个过程由使用美国国家仪器(NI)软件编写的定制程序控制。数据采集系统(NI PXIe-1078)与多种NI模块组合以适应多种输入/输出信号(例如模拟和数字输入/输出、计数器、电路交换等)。整个系统是自动化的并且仅需要用户限定脂质的最终脂质浓度和摩尔比。监测过程变量比如流量、压力和温度，并且使用定制的计算机算法自动地调节一些变量。例如，在计算机程序中实施比例-积分-微分控制以精确地控制乙醇相和水相二者的流量。
使用Malvern Link II软件完成至和来自Malvern粒度仪的通信。Malvern LinkII软件被设置为OPC服务器并且NI LabVIEW被设置为OPC客户端。z-平均粒度和PDI被记录在定制的计算机程序中。定制的计算机程序能够发送测量信息至Malvern粒度仪。
脂质体稀释的实验纲要
针对由4.5∶0.4∶3的摩尔比下的脂质∶DPPG∶胆固醇构成的脂质体制剂——其中脂质是DPPC或DMPC——测试稀释脂质体的影响。选择这些脂质是由于每种脂质先前被调查并且它们产生不同大小的脂质体，即DMPC高至～500nm对DPPC高至150nm。针对线内稀释的脂质体调查两种处理设置。第一种处理设置(设置I)将形成的脂质体直接注入水相II(没有图7中的脱气单元)。第二种处理设置(设置II)由在乙醇稀释阶段之前的脂质体形成阶段的末端处并入接触器(脱气单元)(图7)构成。对于每种处理设置，测试70mL/min至300mL/min的范围内的水相I流量。在此实验中使用的水相是pH＝7.4下的10mM磷酸盐缓冲液。每种样品进行平均粒度和多分散指数的分析。
对脂质体形成和稀释的温度影响
对于上面概括的样品脂质体制剂，在温度范围内使用第二种处理设置测试这些制剂。冷却器被连接至定制设计的散热器并且水相I被线内冷却至设定温度(例如8℃)。水相I的流量被固定在100mL/min。除水相II的温度之外，还记录脂质体形成阶段处的温度。每种样品进行平均粒度和多分散指数的分析。
粒度测量
使用Malvern粒度仪Nano S进行所有粒度测量。完成离线和在线测量二者。在测量之前，脂质体被线内稀释至5％ vol.乙醇并且粘度和折射率在Malvern粒度仪软件中被预先设定。粒度测量包括z-平均粒度和多分散指数(PDI)。对于离线测量，使用一次性塑料比色杯。在每次测量之前，样品在25℃下被平衡。每次离线测量持续时间被设定为10次，每次10秒，并且n＝3。
对于在线测量，使用在25℃下平衡的流动池。在运行在线测量之前，具有低PDI的脂质体群体进行多种测量条件(即衰减、运行持续时间、和计数率)的分析。基于这些结果，运行持续时间被固定(6-8秒之间)并且衰减(和计数率)被调节至用于DLS分析的符合要求的信号。采取两种方法将样品转移至Malvern粒度仪。第一种方法(连续流动模式)是当脂质体以恒定的流量1-1.5mL/min流动通过流动池的同时采取粒度测量。此方法的设置由将样品从过程流泵送至Malvern粒度仪的微型电磁泵(BiochemTM)构成。通过每次驱动泵送70μL和通过控制驱动频率操作此泵，可以维持精确的流量。
第二种方法(装载/停止模式)基于装载流动池接着在测量之前停止流动。泵被用于控制通过流动池的流动(20-25mL/min)。在粒度测量之前立即在设定流量下操作泵，定制的计算机算法然后在此时使泵停止以在测量期间阻止流动。
自动化粒度控制
由HSPC∶胆固醇∶DPPG(4.5∶3∶0.4摩尔比)构成的脂质体制剂被用于形成脂质体。粒度经由定制的LabVIEW程序被自动地控制。最初，模式使用信息比如盐浓度和脂质的类型被确立为前馈控制以达到用户限定的粒度。此前馈控制提供了形成用户限定的粒度的脂质体需要的对水相I流量(ml/min)的估计。为了维持粒度，使用比例-积分-微分(PID)控制实施反馈算法，其中经由Malvern粒度仪的在线粒度分析作为过程控制输入。
结果：
脱气单元在乙醇稀释之前的作用
在形成脂质体后，脂质体分散体被稀释以达到5％ vol.乙醇。使用在方法中概括的下列两种处理设置稀释脂质体，即：(1)设置I：不具有脱气单元和(2)设置II：具有脱气单元。对于DPPC脂质体，脱气单元的添加在整个流量范围内不引起平均粒度和PDI值的任何重大变化。对于DMPC脂质体，脱气单元仅显示在较低的水相I流量(即70mL/min)下引起变化。在70mL/min下，与不具有脱气单元的情况下的DMPC脂质体比较，平均粒度更大并且PDI更低。这些结果指示仅仅当脱气单元位于脂质体形成阶段的末端时获得更单分散的颗粒的较大的动态范围。
对脂质体形成和稀释的温度影响
对于这些实验，水相I和水相II的温度是相同的。当乙醇+脂质相被注入水相I时，放热混合引起温度的增加。DPPC脂质体的平均粒度和PDI展示出与脂质体形成阶段处的温度增加相反的关系(图26)。此观察暗示在较高的温度下形成较大的脂质体；然而，在较高的温度下PDI也趋向增加。对于DPPC脂质体，PDI值甚至在最高温度下不超过0.1，其指示所有脂质体——不论脂质体形成处的温度——是单分散的。
DMPC脂质体的分级数据也展现了与脂质体形成阶段处的温度增加的相反的关系(图27)；然而，在大约25℃发生PDI和平均粒度二者的显著变化。随着温度从24℃增加，PDI从小于0.09±0.02增加高至0.24±0.02。此PDI的变化指示随着温度增加粒度分布更宽和/或存在多种脂质体的群体。此外，脂质体的平均粒度从26℃高至29℃显著地增加，即从171.1±1.7nm至333.5±4.03nm。
DLS测量分析
脂质体的先前制备的样品被放置在DLS流动池中并且DLS衰减和池位置设置被设定为自动的。这些设置导致9的最佳衰减设置和4.2的池位置——其中运行持续时间被固定在3次运行，每次10秒。粒度信息导致56.50±0.03nm的z-平均数，0.05±0.02的PDI和401.4±2.77的计数率。在不同的衰减(6、7、9和11)和运行持续时间(3、9或15秒)下采取手动测量持续仅一次运行。来自图28A-C的图指示如何改变DLS测量设置影响粒度分析。由图28A，此样品的z-平均数在7-9的衰减下是最准确的。在较高的值下(即11)，粒度降低。PDI在高衰减下类似于对照样品(图28B)。在低衰减(即6)下，粒度由于非常低的计数率是不正确的(图28C)。此外，对于此测量，PDI显著地增加。由这些结果，对于准确的粒度分析，计数率显然应当是大约或大于40kcps并且小于500-1000kcps。最后，运行持续时间不显示引起粒度分析的显著变化。然而，较高的值将增加收集的光子的数目并且将提供更准确的粒度分析。
在线粒度分析-方法1：连续流动模式
使用微电磁泵——其在粒度测量期间在恒定的流量(被称为DLS流量)下泵送脂质体样品通过DLS流动池——完成经由连续流动模式的在线粒度分析。实施初步研究以测定导致与使用离线测量获得的粒度数据类似的粒度数据的DLS流量。由DPPC∶胆固醇∶DPPG(4.5∶3∶0.4摩尔比)组成的脂质体在三种水相流量(即80、100和150mL/min)下形成。在线粒度测量与离线粒度测量进行比较。由图29，在三种不同的水相I流量下并且对于～1和2mL/min的DLS流量，连续流动模式和离线测量二者的平均粒度是类似的。相反，PDI仅当DLS流量是大约1mL/min时是类似的。在连续流动模式中的2mL/min下，当与离线测量比较时，标准偏差和平均PDI是更大的。因此，在大约1mL/min的DLS流量的情况下操作连续流动模式的后续实验。
然后在一段时间内分析脂质体以调查过程变化(即流量变化)如何关于准确性和测量时滞二者影响平均粒度和PDI。测量时滞是在定制的软件中记录的对应的粒度数据的过程变化之间的时间差。此时滞来自DLS测量(例如运行持续时间和温度平衡)、软件/仪器通信的延迟和移除DLS流动池中先前的样品需要的时间。来自图30的脂质体样品在1mL/min下运行并且在连续粒度数据和离线数据中的一些之间显示一致性。连续测量和离线测量二者的平均粒度和PDI值是类似的，除在流量改变后以外。这些异常可以通过气泡进入流动池解释。此外，在对应的粒度数据被记录在定制的LabVIEW程序中时的过程变化之间存在58秒延迟。
在10mM赫佩斯缓冲液中使用DPPC∶胆固醇∶DPPG(4.5∶3∶0.4摩尔比)脂质体实施第二种分析(图31)。对于此实验，脂质体在进入DLS流动池之前流动通过脱气单元。100mL/min水1相下的离线粒度测量数据与连续测量数据重叠。在150mL/min下，颗粒变得较小(即大约45nm)并且离线和连续测量的颗粒测量数据不一致。平均粒度相差15nm并且连续模式PDI在0.20-0.33的范围内，但是对于离线测量是0.05。此外，测量时滞是109-137秒。
方法2：装载/停止模式
对于此方法，脂质体在DLS测量之前被装载入20-25mL/min下的流动池。在DLS测量前1-2秒处，流动被停止。在DLS测量完成后，流动再次开始并且此过程对于实验的持续时间进行重复。此处的实验被设计以适应使用相同的脂质制剂——即DPPC∶胆固醇∶DPPG(4.5∶3∶0.4摩尔比)——的小的和大的脂质体。
为了取得不同的大小，调查三种不同的水相，即10mM NaCl、75mM NaCl和140mMNaCl。在10mM NaCl中制备的脂质体形成直径大约70nm低至45nm的范围内的脂质体(图32)。观察到连续粒度和离线粒度的轻微偏差。PDI在所有情况下是类似的并且小于0.2。测量时滞显示在40-47秒附近是一致的。记录脂质体形成和乙醇稀释阶段二者处的过程温度，这是由于这些温度均对平均粒和PDI具有影响。
在75mM NaCl中制备的脂质体形成直径大约145nm低至70nm的范围内的脂质体(图33)。对于大多数的每种流动条件，连续和离线测量的平均粒度是重叠的。相同的观察符合于PDI值。测量时滞显示从4-39秒改变；然而，4秒可能是异常。更准确地，时滞显示在29-39秒附近是恒定的。
在140mM NaCl中制备的脂质体形成直径大约160nm低至70nm的范围内的脂质体(图34)。对于大多数的每种流动条件，连续和离线测量的平均粒度也是重叠的。相同的观察符合于PDI值。测量时滞是28-42秒，其与先前的两种盐条件一致。
离子强度对脂质体物理性质的影响
来自图32-34的离线粒度数据针对流量被重新标绘(图35)。清楚的是平均粒度对在水相中存在的NaCl的量具有依赖性。在低的盐浓度下，即10mM NaCl和10mM PB，pH 7.4，颗粒与较高的盐浓度比较是更小的。在75mM NaCl和140mM NaCl中制备的脂质体之间不存在大差异。因而，NaCl浓度显示在10至75mM NaCl之间对粒度具有更大影响。10mM磷酸盐缓冲液具有0.025M的离子强度，并且在此条件下形成的脂质体具有在10mM NaCl和75mM NaCl之间的平均粒度。
测量在10-140mM NaCl和10mM磷酸盐缓冲液中制备的脂质体的ζ-电位(图36)。随着NaCl浓度增加，颗粒上的ζ-电位降低。此ζ-电位的降低对应于在NaCl中制备的脂质体的粒度降低。在10mM磷酸盐缓冲液中制备的脂质体与在10mM NaCl中制备的那些具有类似的ζ-电位；然而，10mM磷酸盐缓冲液脂质体的粒度更类似于在75mM NaCl中制备的脂质体。
自动化粒度控制
使用的前馈模型使流量与粒度、脂质的类型和盐浓度相关。反馈控制使用具有下列设置的PID控制器：P＝1.5、I＝0.3和D＝0.001。在此实验期间设定两个粒度设定点，即60nm和80nm。一旦达到设定点粒度，用户将粒度设定点调节至其它设定点(图37)。最初，前馈算法能够准确地预测粒度。在初始预测后，反馈算法接管以将粒度维持在设定点处。由图37，展现符合要求的反馈控制维持平均粒度并且能够自动地调节流量以取得设定点粒度(即60nm至80nm或反之亦然)。PDI在整个实验期间保持大约0.1或更小。DLS计数率基于流量条件波动，但是在先前确定提供符合要求的粒度分析的范围内。
讨论：
线内脂质体稀释
此工作的第一部分概括了在乙醇稀释阶段之前的脂质体形成阶段的末端处使脂质体脱气的重要性。如提及的，乙醇与水相的混合是放热的并且导致显热变化。这些热变化引起溶解的气体离开溶液，形成气泡/空气-水界面。对于DPPC脂质体，气泡的存在显示不影响脂质体粒度分布。对于DMPC脂质体，粒度分布在较低的水相I流量下受影响，但是在较高的流量下不受影响。而且，观察到在较低的水相I流量(即70mL/min)下，对于DMPC脂质体泡沫是可视的，但是对于DPPC脂质体是不可视的。此泡沫形成可能由于表面张力随着温度增加减小——其随后引起脂质分子的移动性的增加。此分析被图26和图27进一步证实。在这些图中，温度的变化引起脂质体平均粒度的变化；但是，DMPC脂质体比DPPC脂质体变化程度更大。此外，DMPC脂质体展示了当温度超过24℃时增加的粒度分布(较高的PDI)和当温度超过26℃时平均粒度的显著变化。这些事项可以被解释，由于DMPC磷脂转变温度是大约24℃，其将引起此脂质在此温度附近和/或以上经历更流体样的性状。此增加的脂质移动性导致较大的脂质体的形成，以及增加的泡沫形成。对于DPPC磷脂，相变温度接近41℃，其解释了为什么在调查的温度内DPPC脂质体与DMPC脂质体比较不展示出更大的粒度变化。
当泡沫在脂质体形成阶段处形成并且被传入乙醇稀释阶段(水相II)时，此稀释阶段称为混合的第二阶段，其引起泡沫混和回水相并且形成第二种脂质体的群体。在稀释阶段形成的脂质体然后将取决于稀释阶段处的混合，即雷诺尔德数和温度。由于流量在460-660mL/min的范围内，此阶段处的雷诺尔德数将是＞1000并且支持形成较小的脂质体。因此，在添加泡沫的情况下，存在较大的粒度分布，这是因为实质上形成了两种颗粒的群体，一种在脂质体形成阶段处并且一种在乙醇稀释阶段处。通过在脂质体形成后移除泡沫，减少形成第二种颗粒的群体的倾向。
如先前说明的，雷诺尔德数可以被用作粒度的预测性测量；然而，其仅在固定条件比如脂质浓度、盐的类型、盐浓度等的情况下适合。较低的雷诺尔德数支持较大的脂质体而较高的雷诺尔德数支持较小的脂质体。通过降低脂质体形成阶段处的温度，这将引起雷诺尔德数降低，并且引起脂质体粒度降低。因此，单独的雷诺尔德数不是用于脂质体形成过程的符合要求的测量。相反，考虑因素比如雷诺尔德数、温度、脂质-相变温度、脂质烃饱和度和缓冲液/盐组成的更彻底的模型可以是有利的。
影响粒度测量的变量
存在影响用于在线测量的脂质体的准确的粒度测量的大量变量。这些变量可以被分为处理变量和DLS测量变量(表2)。对于处理变量，第一种是总死体积，即从过程流至流动池的管材的体积加流动池的体积。此体积是重要的，这是由于这是在每次测量后可以被替换的体积；否则，在较早时间点处形成的脂质体可能与杂较晚时间点处形成的脂质体混合。大的总死体积将关于处理条件招致大的时间迁移。
第二种处理变量是过程流与流动池速度比。此比率是过程流中的流体的速度除以流动至流动池的流体的速度。为了取得小的时间迁移，此值可以是＞＞1。此变量与总死体积有关，这是由于不能在大的死体积——尤其是在大约1-1.5mL/min的流量下——的情况下取得较高的比率。例如，在这些实验中使用的DLS流动池体积是100μL并且包括泵和管材的总体积是大约220μL。而且，如果每15秒采取DLS测量，则250μL的样品将在这时期间穿过。理想地，由于流动池具有比管材更大的体积，可能需要更大的体积以移除整个先前的样品(即2-3×总死体积)并且在测量之间将需要更长的延迟时间。
第三种处理变量是是否出现层流。此变量仅对于恒流模式是重要的。对于此变量，小的内直径管材(例如0.01”)可能引起湍流并且影响颗粒的布朗运动，因而导致不正确的粒度测量。为了减小这些效应，应当使用较大的内直径管材；然而，较大的内直径管材将增加总死体积。
DLS测量变量包括设置比如测量持续时间、运行数和衰减因数。每次DLS运行的测量持续时间可以在粒度仪软件中被设定。对于离线DLS测量，每次测量由大约10-15次运行构成并且每次运行持续10秒。来自每次运行的DLS数据然后被组合以提供单一的DLS结果。良好的质量DLS数据是当总光子计数——即在所有测量后获取的光子的总数目——大于10,000时。此外，以千次计数/秒(kilo counts per second)(kcps)测量的平均计数率应当大于20kcps并且小于1000kcps。对于较低的光子计数，数据可能不产生准确的粒度分析。对于在线测量，仅六秒持续时间的单次运行被用于DLS测量，其将导致低的光子计数。然而，由图30-34，6秒持续时间适合用于测定z-平均粒度，并且在大部分情况下，离线和在线测量二者的PDI是类似的。较短的测量持续时间(例如3秒)也可以提供符合要求的结果，但是将导致较低的光子计数。因此，在线测量实验使用较长的测量持续时间(即6秒)以取得更一致和更高的质量数据。
衰减因数是另一个重要的变量。低的衰减因数指的是当较少量的光穿过样品时并且高的衰减因数是当较大量的光穿过样品时(对于Malvern粒度仪，衰减范围分别是0-11)。改变衰减因数将引起光子计数率增加或降低；然而，非常高的计数率将不再提供准确的数据，这是由于DLS检测器具有其中应答保持线性的最大计数率。对于离线测量，计数率在粒度仪软件中被设定为“自动的”。对于在线测量，取决于被测试的脂质体的粒度，通过程序地调节衰减因数将计数率保持在150-400kcps之间。用户限定的衰减的优点是每次测量减少的总时间。缺点在于用户限定的衰减因数可能不允许测量期间足够高的光子计数——其导致较低的质量数据。
第四种测量变量是样品中气泡的存在。由于气泡还散射光，气泡将影响结果的总质量。规避此问题的一个方法是在采取样品的地方和DLS流动池之间使用脱气单元。使用脱气单元的缺点在于脱气单元的体积添加至总死体积，其导致更长的测量延迟(图30)。
在线粒度测量比较
通过比较连续流动模式对装载/停止模式，装载/停止模式显示是更准确的并且具有更一致的测量时滞。当使用装载/停止模式时，由于流量是大约20-25mL/min对连续流动模式的1-1.5mL/min，从DLS流动池移除整个样品。此外，较大的内直径管材被用于装载/停止模式并且这可以具有减少的气泡形成，其导致与DLS数据一起存在的较少的矫作物。装载/停止方法的一个缺点是流动池的快速装载，其不允许温度平衡。在此情况下，样品温度可以不同于DLS软件中的温度设定，其可以解释为什么当与离线DLS测量比较时平均粒度——尤其是对于较小的脂质体——较低(图31)。仅对于小的脂质体(即＜50nm)观察到此偏差。
离子强度对脂质体形成的影响
水相的离子强度显著地影响脂质体平均粒度。由图35，在相同的流量(即70mL/min)下，10mM NaCl形成70nm脂质体并且140mM NaCl形成大约160nm脂质体。与水相接触的磷脂分子的部分是磷酸酯头部基团。因此，头部基团可以在大小(例如平均分子面积)方面变化并且将影响脂质包装。而且，通过比较在10mM NaCl与10mM磷酸盐缓冲液(在pH 7.4下)中制备的脂质体，在10mM NaCl中制备的脂质体的直径更小。当考虑离子强度时，10mM磷酸盐缓冲液具有大于10mM NaCl但是小于75mM NaCl的离子强度。因此，离子强度的增加引起脂质体平均粒度的增加。
离子强度影响邻近的磷脂分子的静电或电荷排斥(图35)。在低的离子强度(例如10mM NaCl)下，排斥将比在140mM NaCl下更大，这是由于高的盐浓度将降低颗粒的总ζ-电位(图36)。这由Gouy-Chapman-Stern理论说明，其描述了增加盐浓度降低从带电表面至剪切面的距离。当增加量的带电种类(例如Na+)与带负电的磷脂膜缔合时，ζ-电位的量级被减小。根据先前描述的脂质体制剂模型，较低的ζ-电位可以允许较多的磷脂进入前体脂质体并且因此导致形成较大的脂质体。
大小随着NaCl浓度的增加而增加的第二种解释与脂质体最初形成时的局部热效应相关。混合用于乙醇、水和NaCl的三元混合物的混合的过量的焓随着盐浓度增加变得更正的。减小的混合的焓指示与低的盐条件比较正在发生更多间断裂事项，即更少的水-乙醇氢键形成。此事项可以表明较多的乙醇在初始混合阶段期间正在与脂质分子相互作用，因而促进较大的脂质聚集体在脂质体形成之前形成。然而，任一种解释，即静电或混合的焓的变化将难以被直接测量，这是由于脂质体形成在分子水平或在湍流条件下发生。对改变带电磷脂的磷脂摩尔比的未来研究可以是探究电荷排斥对脂质体形成过程的作用的合适的替代方案。
自动化粒度控制
在脂质体的连续制造中，过程变化比如压力或温度波动将在脂质体形成过程期间引起脂质体粒度的变化。使用前馈控制以初始地预测过程条件(即水相I流量)并且展现了维持粒度的反馈控制。通过实施这些控制策略，脂质体质量属性(即平均粒度和粒度分布)可以被维持，其支持总体较高质量制剂。
结论：
减小乙醇浓度的脂质体的线内稀释在此连续过程中实施以形成脂质体。在脂质体形成过程之后并入线内稀释阶段可以引起脂质体粒度分布的变化——其取决于脂质体制剂。因此，确定在脂质体形成之后和在线内稀释阶段之前包括脱气单元是有用的。在线粒度分析被实施入脂质体的连续处理。为了减小过程变化(即流量)和粒度测量数据之间的时滞，确定当与连续流动模式比较时，装载/停止模式提供了更一致的结果。此外，水相的离子强度显著地影响脂质体的平均粒度，即离子强度的增加有利于形成较大的脂质体。最后，使用前馈和反馈控制二者实施自动化粒度分析，其导致对脂质体粒度和多分散指数的精确控制和维持。
表格：
处理变量 DLS测量变量
总死体积 测量持续时间
处理流与流动池速度比 衰减因数
层流流量a 样品温度
气泡存在
a＝仅可适用于恒流方法
表2：影响连续粒度测量的变量
实施例3
材料和方法：
材料
1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-(1′-rac-甘油)(钠盐)(DPPG-Na)和类脂S PC-3(HSPC)购自LipoidTM。胆固醇(Chol)购自Sigma。乙醇(200酒精度，ACS/USP级)购自Pharmco-AAPER。
实验方法
脂质体形成和稀释
通过改进的乙醇注入方法制备脂质体。此系统的示意图被描绘在图7中。三个单独的316不锈钢罐包含脂质+乙醇溶液。这些罐被加压(在20psi下)并且使用模拟流量计(McMillian)和比例电磁阀(Aalborg)控制来自这些罐的流量。流量计针对水进行工厂校准，其具有小于1％全尺寸误差。对于脂质+乙醇流动流，这些流动传感器针对乙醇进行重新校准并且具有0.9989的R平方值，其具有5-50mL/min的工作范围。三个罐然后使用4-通连接器(Swagelok)在单点处被连接。实施静态混合器以确保来自三个罐的脂质+乙醇溶液在到达注射口——乙醇和水相1流在其中汇聚——之前被充分地混合。水相I体积流量由齿轮泵控制。为了形成脂质体，混合的脂质+乙醇溶液然后在多种流量下注入水相(水相I)。乙醇相的管材ID是0.508(1.588mm OD)。水相I管材ID被固定在4.572mm。脂质+乙醇相的流量是5-40mL/min并且水相I的流量是70-300mL/min。
在形成脂质体后，脂质体穿过脱气单元接着是第二个三通T-端口。此三通T-端口具有用于脂质体的一个入口、用于水性缓冲液的第二入口和一个出口。第二齿轮泵被用于控制水相进入此端口的流动(水相II)。水相II流量被调节，以便混合的水相将具有5％ vol.乙醇。水相II流量在690-460mL/min的范围内。
数据采集系统和计算机软件
整个过程由使用美国国家仪器(NI)软件编写的定制程序控制。数据采集系统(NI PXIe-1078)与多种NI模块组合以适应多种输入/输出信号(例如模拟和数字输入/输出、计数器、电路交换等)。整个系统是自动化的并且仅需要用户限定脂质的最终脂质浓度和摩尔比。监测过程变量比如流量、压力和温度，并且使用定制的计算机算法自动地调节一些变量。例如，在计算机程序中实施比例-积分-微分控制以精确地控制乙醇相和水相二者的流量。
使用Malvern Link II软件完成至和来自Malvern粒度仪的通信。Malvern LinkII软件被设置为OPC服务器并且NI LabVIEW被设置为OPC客户端。z-平均粒度和PDI被记录在定制的计算机程序中。定制的计算机程序能够发送测量指令至Malvern粒度仪。
粒度测量
使用Malvern粒度仪Nano S进行所有粒度测量。在测量之前，脂质体被线内稀释至5％ vol.乙醇并且粘度和折射率在Malvern粒度仪软件中被预先设定。粒度测量包括z-平均粒度和多分散指数(PDI)。对于离线测量，使用一次性塑料比色杯。在每次测量之前，样品在25℃下被平衡。每次离线测量持续时间被设定为10次，每次10秒，并且n＝3。
对于在线测量，使用在25℃下平衡的流动池。测量持续时间被设定为1次运行持续6秒。在所有情况下使用装载/停止模式，其基于装载流动池接着在测量之前停止流动(参见第5章)。泵被用于控制通过流动池的流动(20-25mL/min)。在粒度测量之前在规定流量下操作泵。在进行任何测量前，定制的计算机算法使泵停止以在测量期间阻止流体流动。
NIR(浊度)测量
TF16-N散射光双通道浊度传感器被用于测量。此装置具有两个同时通道，第一个测量光吸收，即此原理基于通过单个密封的光电二极管在距光源0°处检测光。此测量以浓度单位(CU)为单位。第二个测量原理基于光散射并且通过八个密封的硅光电二极管在11°处检测散射光。此测量以百万分之一(parts per million)(PPM)被报告。测量波长是730nm至970nm的范围内的带。传感器的光程长度被固定在40mm并且处于流动池配置，即具有用于线内应用的入口和出口。传感器的线性度对于每次是全尺寸的＜±1％并且具有＜±0.5％的重复性。
切向流过滤系统
具有Pellicon 2 Mini Ultrafiltration Biomax-100模块的EMD MilliporePellicon Mini Holder被用作切向流过滤(TFF)装置。此装置被连接至蠕动泵(Blue-WhiteIndustries，LTD)以控制流量。压力换能器和电磁阀被连接至TFF装置的输出。泵、压力换能器和电磁阀被连接至定制的LabVIEW计算机程序(图8)。
经由Stewart试验的脂质浓度分析
Stewart试验是测定存在的磷脂的量的UV-光谱测定技术。简略地，通过在0.5升的去离子水中溶解13.52g的六水三氯化铁和15.2g的硫氰酸铵制备硫氰酸铁铵(AF)。采用添加至大约3mg的氯仿的10-70mg的磷脂原液(最初溶解在乙醇中)的生成校准曲线。2mL的AF溶液被添加至此混合物，其然后被涡旋30秒接着在1,500rpm下离心2分钟。移除AF并且使用Cary 50UV-分光光度计在470nm下分析包含脂质的氯仿。校准曲线由9个值构成，其具有0.023μg/mL的定量限(QL)和0.997的R平方。
经由高压液相色谱-质谱的脂质浓度分析
使用高压液相色谱仪(HPLC)与质谱仪(MS)测定脂质浓度。在30℃下加热的WatersXbridge C8，3.5um，4.6×75mm柱被用于脂质分离。流动相是MS-级甲醇中2mM甲酸铵。流量被设定在0.3mL/min并且每次测量注入3μL的样品。使用ESI探头并且在TSQ软件中优化操作条件(表3)。
取决于脂质制剂，即对于DPPC，分析样品的主要的磷脂。使用幂函数值(PFV)转换原始色谱分析数据并且计算曲线下的面积。每个峰的拖尾因子小于1.20。校准曲线具有大约1.22μg/mL的QL并且R平方值是＞0.996。用于DPPC的PFV是1.23。
脂质浓度预测模型
通过SAS的JMP被用于生成预测模型和等式。生成两种模型(定义为模型1和模型2)，其随着以mM为单位的总脂质浓度([脂质])具有应答。模型的可能的因子是NIR测量(CU和ppm二者)、z-平均粒度(d.nm)和多分散指数(PDI)。模型1仅包括粒度和ppm作为因子。仅单分散的脂质体(即具有PDI≤0.1)被用于生成此模型。模型1的实验设计被概括在图38中。由于ppm信号高度依赖于粒度，典型的实验设计(例如全因子的)难以实现。此外，针对此模型报告的最大浓度是大约7mM总脂质。对于较小的粒度(例如50nm对150nm)，将需要较高的总脂质浓度以取得较高的ppm信号。模型2是模型1的延伸并且包括粒度、PDI、ppm和CU作为因子。模型2的实验设计被概括在图39中。
结果：
预测模型
脂质体粒度直径在55nm至188nm的范围内。对于模型1，测试的所有大小和浓度的PDI小于0.10。总脂质浓度在0.38mM高至7.96mM的范围内。有效项(significant term)(P＜0.05)是粒度、粒度*ppm和ppm(表4)。粒度和粒度*ppm二者消极地影响脂质浓度，而ppm的增加与脂质浓度的增加相关。NIR CU测量不与模型关联并且被省略。真实对预测脂质浓度的R平方是0.931，其指示了线性关系。模型具有15个观察值(具有模型的3个自由度)、0.587的RMSE和的＜0.001的方差分析。
模型1的表面概况被展现在图40中。概况具有ppm对粒度对总脂质浓度。随着粒度增加，ppm对[脂质]斜率增加并且较低的脂质浓度达到较高的ppm值。对于相同的最大值[脂质]，较小大小的脂质体仅达到大约30ppm，而大的脂质体达到高至70ppm。模型1的经验预测等式是：
此等式被实施入定制的计算机程序以基于粒度和浊度测量预测脂质浓度。
对于模型2，如上面的模型1中概括的使用相同的粒度直径范围。总脂质浓度在0.38高至20mM的范围内。模型2的有效项被列在表6.3中，其中粒度*ppm和ppm作为最有效的。CU和PDI二者也在模型中具有统计学有效项。真实对预测脂质浓度的R平方是0.987，其指示了线性关系。模型具有35个观察值(具有模型的11个自由度)、0.527的RMSE和的＜0.001的方差分析。模型2的经验预测等式是：
包括模型1和模型2二者的验证。脂质体具有167±4.40nm的平均粒度和0.05±0.02的PDI(表6.4)。测量的总脂质浓度范围是1.80-7.07mM。由于PDI小于0.1，两种模型可以被用于预测平均粒度，其中平均误差小于等于7.5％。当比较测量的[脂质]与预测的[脂质]的百分比误差时，双尾的、配对的t检验产生0.23的p-值，其指示数据集之间的差异是不显著的。
多分散性对于NIR信号
对于粒度相似但是在PDI中具有差异的脂质体，在两个数据集之间进行比较。较低的PDI(≤0.1)指示单个颗粒的群体，而较高的PDI指示存在多个颗粒的群体。由图41，PDI显然是优选地可以被控制的因子。具有149nm的平均粒度和0.18±0.02的PDI的脂质体产生比具有170nm的平均直径和0.06±0.02的PDI的那些大的PPM信号。
讨论：
脂质浓度模型
通过米氏散射理论说明散射光和粒度之间的关系。米氏理论通过来自入射电磁波的感应偶极矩说明光散射。感应偶极充当电磁辐射的来源并且在相同的频率下发射或散射光作为来源，即弹性散射。此理论基于入射波长和粒度提供了散射光的角关系。先前已经针对脂质体分析了脂质体粒度和光散射和浊度之间的关系。理论基于米氏散射理论近似法(approximation)，称为Rayleigh-Gans-Debye近似法。由此近似法，如果另外的性质比如水性介质的折射率和脂质双分子层的折射率是已知的，可以在固定的入射波长下估算脂质浓度。然而，此近似法可能不适于当前的情况，这是由于入射辐射是覆盖的730-970nm的波长的带。此外，此研究中的脂质体是单分散的和多分散的二者，其将在使用理论近似法预测总脂质浓度中进一步引起困难。出于此原因，发展出经验模型以使脂质体粒度、PDI和NIR信号(ppm和CU)与总脂质浓度相关。
如预期的，较小的颗粒与较大的颗粒比较散射更少的光。出于此原因，ppm/CU随着粒度增加而增加。生成两种预测模型，第一种用于仅单分散的脂质体(即具有PDI≤0.10的脂质体)并且第二种包括具有更高的PDI(PDI＞0.10)的脂质体制剂。对于单分散的脂质体模型，0°处的检测(以CU测量的)不显示在测量的浓度下具有与粒度和浓度的任何关联。CU不随着脂质浓度的增加而线性增加，但是当比较不同的粒度脂质体时不形成关联。相比之下，11°处的散射光(即ppm)展现了与脂质体粒度和总脂质浓度的关联。出于此原因，仅散射光被用于单分散的脂质体的预测模型。而且，由于ppm信号参考介质，NIR传感器能够测量低的脂质浓度并且检测不受对水相(例如乙醇)的添加影响。
对于第二种模型(模型2)，CU信号和粒度PDI被添加至模型1。此对模型的添加使得单分散的和多分散的脂质体制剂二者的总脂质浓度能够被预测。将多分散性项添加入模型增强单分散的和多分散的系统二者的总脂质浓度的总体可预测性。验证样品集展现了两种模型的稳健性。通过比较每种模型的平均误差，误差是不显著的，其指示每种模型可以被用于低PDI制剂。然而，模型1不可以被用于较高的PDI制剂。这些结果展现了仅具有3个自由度的经验模型可以预测单分散的脂质体的粒度；而多分散的样品需要具有11个自由度的经验模型。因此，当脂质体以低的多分散性形成时，相对简单和低自由度模型可以被用于预测脂质体的总脂质浓度。
多分散性对于NIR检测
为了强调样品的多分散性如何消极地影响预测模型，标绘了两个数据集。高PDI样品增加散射光的结果是预期的，这是由于相同样品中多种脂质体的群体将引起散射光的大的变化。由米氏理论，大颗粒将在正向中散射比较小的颗粒更多的光。此外，较大直径颗粒散射更多的光。角散射和散射强度的变化的组合阻止此模型预测脂质浓度。因此，模型1的限制在于它仅适用于单分散的脂质体。对于多分散的脂质体，模型2应当被用于预测总脂质浓度。
结论：
切向流过滤系统与连续的脂质体形成过程一起实施以连续地线内浓缩脂质体。研发单分散的和多分散的脂质体二者的经验模型，其具有作为模型应答的总脂质浓度。对于大约50nm高至200nm的粒度直径，这些模型可以预测0.38高至20mM总脂质的脂质浓度。模型1的一个限制在于它仅适用于单分散的脂质体。模型2对单分散的和多分散的具有预测能力，但是需要具有11个自由度的模型。将浓缩系统和预测模型实施入脂质体的连续过程增强过程控制。而且，此系统导致有效地控制脂质体药物产品的一种质量属性(即脂质浓度)。
表格：
喷雾电压 4000
鞘(sheath)气压 20
离子吹扫气压力 8
辅助气(aux.gas)压力 5
毛细管温度 350
镜筒透镜偏移(tube lense offset) 131
锥孔体偏移(skimmer offset) 0
表3：在脂质浓度定量的分析中使用的TSQHPLC-MS ESI操作条件。
表4：模型1的分类参数估算值和模型项。
表5：模型2的分类参数估算值和模型项。
表6：两种脂质浓度([脂质])模型的验证数据点。模型1基于粒度和ppm，而模型2包括粒度、多分散指数(PDI)、ppm和CU。
应当理解本文描述的布置仅仅出于实例的目的。正因如此，本领域技术人员将领会其它布置和其它要素(例如机器、接口、功能、顺序、和功能的分组等)可以被替代使用，并且一些要素可以根据期望的结果被整体省略。进一步，描述的许多要素是功能实体，其可以在任意合适的组合和位置中被实施为离散的或分散的组件或连同其它组件，或可以组合被描述为独立结构的其它结构元件。
虽然本文已经描述了多个方面和实施方式，但是其它方面和实施方式对本领域技术人员将是显而易见的。本文公开的多个方面和实施方式出于说明的目的并且不意欲是限制性的，而且真实的范围由所附权利要求，连同这样的权利要求有权利的等价物的完整范围指示。还理解本文使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，并且不意欲是限制性的。
由于可以对描述的实例做出许多详细的修改、变更、和改变，在前面的描述中的所有事项和在附图中显示的所有事项意欲被解释为是说明性的而不以限制性含义进行解释。进一步，意欲理解下列条款(和条款的任意组合)进一步描述了本说明书的方面。

Claims (38)

1.用于连续生产脂质体的系统，所述系统包括：
混合器，其与一个或多个容器流体连通；
器皿；和
一个或多个注射口，其中每个注射口包括：
第一入口，其包括与所述混合器流体连通的第一导管，
第二入口，其包括与所述器皿流体连通的第二导管，和
出口，其中所述第一导管在所述第二导管内同心地定位，并且其中所述第一导管延伸通过所述出口。
2.权利要求1所述的系统，其中所述第二导管延伸通过所述出口，并且其中所述第一导管在所述第二导管内终止。
3.权利要求1-2中任一项所述的系统，进一步包括：
一个或多个压力罐，其连接至所述一个或多个容器中的每个；
第一组的一个或多个阀，其在所述一个或多个容器和所述一个或多个压力罐之间定位；
第二组的一个或多个阀，其与所述一个或多个容器中的每个流体连通；和
一个或多个流量计，其在所述一个或多个压力罐中的每个和所述第二组的一个或多个阀中的每个之间定位。
4.权利要求1-3中任一项所述的系统，进一步包括：
一个或多个齿轮泵，其在所述器皿和所述一个或多个注射口中的每个之间定位。
5.权利要求4所述的系统，进一步包括：
一个或多个流量计，其在所述器皿和所述一个或多个齿轮泵之间定位。
6.权利要求1-5中任一项所述的系统，其中所述混合器是组合来自所述一个或多个容器中的每个的溶液的静态混合器。
7.权利要求1-6中任一项所述的系统，其中所述第一组的一个或多个阀是电磁阀。
8.权利要求1-7中任一项所述的系统，其中所述第二组的一个或多个阀是比例阀。
9.权利要求1-8中任一项所述的系统，其中在所述一个或多个注射口中的每个中，所述注射口、所述第一导管、和所述第二导管包括不锈钢。
10.权利要求1-9中任一项所述的系统，其中在所述一个或多个注射口中的每个中，所述第一导管从所述出口延伸大约0.5英寸至大约24英寸之间，并且其中所述第二导管从所述出口延伸大约0.5英寸至大约24英寸之间。
11.权利要求1-10中任一项所述的系统，进一步包括：
粒度分析仪，其配置为测定位于所述出口邻近的脂质体的大小；和
控制器，其配置为：
测定所述脂质体的期望的大小和所述脂质体的测定的大小之间的差异；和
响应于测定的差异，调节所述系统的一种或多种参数。
12.权利要求1-11中任一项所述的系统，其中所述一个或多个注射口中的每个的所述第一入口包括与所述混合器流体连通的第三导管，其中所述第三导管在所述第二导管内同心地定位并且邻近所述第一导管，以便所述第三导管延伸通过所述出口。
13.权利要求1-12中任一项所述的系统，进一步包括：
一个或多个脱气单元，其与所述一个或多个注射口中的每个的所述第二导管流体连通；和
三通端口，其包括第一端口、第二端口和第三端口，其中所述第一端口与一个或多个脱气单元流体连通，其中所述第二端口与所述器皿流体连通，并且其中所述第三端口是出口端口。
14.权利要求13所述的系统，进一步包括：
齿轮泵，其在所述器皿和所述三通端口之间定位。
15.用于连续生产脂质体的方法，所述方法包括：
使脂质的溶液和来自一个或多个容器的有机溶剂混合以产生有机溶剂-脂质溶液；
在第一流量下将所述有机溶剂-脂质溶液提供至注射口的第一入口，其中所述第一入口与第一导管流体连通；
在第二流量下将水溶液提供至所述注射口的第二入口，其中所述第二入口与第二导管流体连通，其中所述第一导管在所述注射口的出口处在所述第二导管内同心地定位，并且其中所述第一导管延伸通过所述注射口的所述出口；和
使所述有机脂质溶液和所述水溶液混合以产生多种脂质体。
16.权利要求15所述的方法，所述方法进一步包括：
测定所述多种脂质体中的一种或多种的大小。
17.权利要求16所述的方法，其中在所述多种脂质体在恒定的流量下移动的同时完成所述测定。
18.权利要求16所述的方法，其中所述测定包括：
使泵短暂地停止以阻止所述多种脂质体中的一种或多种的流体流动；
在所述多种脂质体静止的同时测定所述多种脂质体中的一种或多种的大小；和
启动所述泵以恢复流体流动。
19.权利要求15-18中任一项所述的方法，进一步包括：
测定所述一种或多种脂质体的期望的大小和所述一种或多种脂质体的测定的大小之间的差异；和
响应于测定的差异，调节所述第二流量和/或调节所述有机脂质溶液的脂质浓度。
20.权利要求15-19中任一项所述的方法，进一步包括：
测定所述多种脂质体中的一种或多种的大小分布。
21.权利要求20所述的方法，进一步包括：
测定所述一种或多种脂质体的期望的大小分布和所述一种或多种脂质体的测定的大小分布之间的差异；和
响应于测定的差异，调节所述第二流量和/或调节所述有机脂质溶液的脂质浓度。
22.权利要求15-21中任一项所述的方法，其中所述水溶液包括水相缓冲液。
23.权利要求15-22中任一项所述的方法，其中所述一个或多个容器包括至少两个容器，并且其中所述至少两个容器中的每个中脂质和有机溶剂的溶液包括不同的脂质浓度。
24.权利要求15-23中任一项所述的方法，其中所述第二流量在大约70mL/min和大约300mL/min之间。
25.权利要求15-24中任一项所述的方法，其中所述第一流量在大约5mL/min和大约40mL/min之间。
26.权利要求15-25中任一项所述的方法，其中所述多种脂质体在所述第二导管内的所述第一导管终止的位置处产生。
27.权利要求15-26中任一项所述的方法，其中所述有机溶液通过所述第一导管的第一流动和所述水溶液通过所述第二导管的第二流动是湍流。
28.权利要求15-27中任一项所述的方法，其中所述水溶液包括水-有机溶剂混合物。
29.权利要求15-28中任一项所述的方法，进一步包括：
使所述多种脂质体传至脱气单元；
使所述多种脂质体从所述脱气单元传至三通端口的第一端口；
在第三流量下将水性缓冲液提供至所述三通端口的第二端口；和
使所述多种脂质体和所述水性缓冲液混合。
30.权利要求29所述的方法，其中所述多种脂质体和所述水性缓冲液的混合物具有大约5％体积的乙醇。
31.权利要求29-30中任一项所述的方法，其中所述第三流量在大约300mL/min和大约10000mL/min之间。
32.权利要求15-31中任一项所述的方法，进一步包括：
测定所述多种脂质体的总脂质浓度；
测定所述脂质体的期望的总脂质浓度和所述脂质体的测定的总脂质浓度之间的差异；和
响应于测定的差异，调节所述第二流量和/或调节所述有机脂质溶液的脂质浓度。
33.权利要求15-32中任一项所述的方法，进一步包括：
使所述多种脂质体传至切向流过滤单元；
测定所述多种脂质体的总脂质浓度；
测定所述脂质体的期望的总脂质浓度和所述脂质体的测定的总脂质浓度之间的差异；和
响应于测定的差异，调节所述切向流过滤单元的渗透流量和/或调节所述切向流过滤单元的压力。
34.权利要求32-33中任一项所述的方法，其中所述多种脂质体的总脂质浓度经由近红外(NIR)传感器测定。
35.权利要求15-34中任一项所述的方法，其中所述多种脂质体是单层脂质体。
36.权利要求15-35中任一项所述的方法，其中使用包括反馈和前馈控制机制的一个或多个处理器实施所述方法以控制权利要求1-14中任一项所述的系统。
37.非暂时性计算机可读介质，其具有储存在其上的指令，所述指令当由一个或多个处理器执行时，引起用于连续生产脂质体的系统执行包括权利要求15-37中任一项所述的步骤的操作。
38.权利要求37所述的非暂时性计算机可读介质，其中所述系统包括权利要求1-14中任一项所述的系统。
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