CN107422101A - 利用固相萃取‑波谱联用技术识别火干扰对土壤dom影响的方法 - Google Patents

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CN107422101A CN201710813485.XA CN201710813485A CN107422101A CN 107422101 A CN107422101 A CN 107422101A CN 201710813485 A CN201710813485 A CN 201710813485A CN 107422101 A CN107422101 A CN 107422101A
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Abstract

本发明公开了一种利用固相萃取‑波谱联用技术识别火干扰对土壤DOM影响的方法：采用土钻法采集火干扰前后的旱成土之壤土样品若干，将获取的原状土柱进行振荡和超声分散，促进土壤颗粒均质化；将颗粒均质化土壤置于振荡器中提取DOM；采用固相萃取‑抽提装置纯化DOM水样，对所得样品进行元素分析、红外光谱分析和质谱分析。本发明综合考虑了DOM纯化过程的各种干扰因素，比如溶液中无机离子的干扰、滤膜自身性质等内在因素和操作技巧等外部因素对DOM纯化效率的影响。同时，本发明引入多种波谱技术识别土壤DOM，协同验证火干扰对土壤DOM的深层影响，保证分析过程的科学性。

Description

利用固相萃取-波谱联用技术识别火干扰对土壤DOM影响的 方法
技术领域
本发明涉及火干扰的土壤环境行为领域，尤其涉及利用固相萃取-波谱联用技术识别火干扰对土壤溶解性有机质影响的方法。
背景技术
溶解性有机质(Dissolved Organic Matter,DOM)是一类结构复杂、组成相似、分子量分布较宽的有机组分混合体，是天然环境的重要动态功能组分，广泛存在于海洋、湖泊、河流、草原、森林、农田等生态系统中。通常来看，水体DOM包括内源DOM和外源DOM两部分，其中外源DOM主要通过非水体生物的腐烂分解、土壤组分的淋溶汇入、大气沉降后的二次迁移扩散等途径得以累积。水体DOM对各类环境反应过程行为都具有较高的响应灵敏度。比如，人类的饮用水源分为地表水和地下水，其中都含有一定浓度的DOM；在自来水厂对原水消毒(氯消毒、臭氧消毒等)过程中，原水中的DOM(溶解性有机氮DON、溶解性有机碳DOC等)将扮演重要角色，或充当前驱体，或充当物理媒介，或充当电子给体或受体，直接或间接导致水体消毒过程产生大量有毒、有害的次生污染物小分子碎片。这些有机小分子碎片很难从水中彻底清除，能够降低原水消毒效果，并可能产生潜在的人体健康风险。从这个角度上看，深度剖析不同时空条件下DOM的理化属性相当重要。
火干扰是生态系统的主要干扰类型之一。近些年，大规模的陆地生态系统火灾事故频发，比如中国大兴安岭(2017年)、美国俄克拉荷马(2017年)、加拿大麦克默里堡(2016年)、西班牙帕尔玛(2013年)等。据不完全统计，全球每年的森林过火面积已达5.3×108～5.5×108km2。这些火灾严重破坏了生态系统的原生结构和正常功能，干扰了生态系统内部的物质循环和能量流动。当土壤表层生态系统遭受火干扰后，土壤圈将变得相对脆弱，火干扰的热作用又使得土壤孔径结构更加丰富，同时大部分植被遭到破坏形成植物残体；这些植物残体和表层土壤富含DOM组分，当发生降雨或降雪融化的情况时，其组分将释放进入土壤圈，并通过地表径流、土壤下渗、地下径流等方式完成迁移转化。当其汇入水体中后，将对原水水质产生潜在威胁和影响。
目前，关于生态系统(含土壤、水体、大气等)中DOM的提取和分离纯化方法还很不成熟。虽然不同来源DOM的提取流程略有差异，但其基本操作手段非常类似。以土壤DOM为例：即将土壤样品与水混合，通过控制操作因子(土水比、提取时间等)来获得DOM溶液，之后调控溶液离心速率、滤膜孔径(0.45μm或0.25μm)等参数，来获取符合要求的、纯化后的DOM溶液。这种方法可以称之为滤膜法，相对比较传统，技术上比较成熟，但也存在不足；尤其是在使用滤膜过滤过程中，溶液中的无机离子难以被去除，同时因为操作技巧、滤膜自身性质等方面的限制而降低了DOM纯化效率和提取效率，甚至无法真实反映土壤原始DOM的真实本质。
固相萃取技术(Solid Phase Extraction,SPE)利用目标组分在不同介质中被吸附的能力差将目标组分提纯，大大增强了目标组分特别是痕量组分的检出能力，提高了目标组分回收率。目前国内主要将SPE技术用于食品抗生素残留、农产品兽药检测、药物药代动力学分析，环境污染物监测(PAHs、PCBs)等方面，鲜见将其用于火干扰前后土壤DOM的分析比对研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用固相萃取-波谱联用技术识别火干扰对土壤DOM影响的方法。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
第一步，将火干扰前后采集的土壤样品进行预处理，使对应土壤样品颗粒均质化；利用超纯水由颗粒均质化土壤样品中振荡提取DOM，得到对应土壤样品的DOM水样粗产品；
第二步，将DOM水样粗产品分别离心后滤膜过滤，取6～12mL滤液，用体积分数为0.05％～0.2％的HCl超纯水溶液调节pH值为1.9～2.1，得到对应土壤样品的DOM分离样A；将每个DOM分离样A分2～4次通过固相萃取(SPE)柱后，用6～12mL体积分数为0.05％～0.2％的HCl超纯水溶液淋洗固相萃取(SPE)柱，然后用6～12mL乙醇淋洗固相萃取(SPE)柱并收集淋出液，用N2吹脱装置(25℃，高纯氮气)将淋出液体积浓缩至1～3mL，得到对应土壤样品的DOM分离样B；
第三步，将DOM分离样B分别进行元素分析(元素分析仪)、质谱和红外光谱分析，根据分析结果对比火干扰前后土壤DOM的性质差异。
所述土壤样品类型为旱成土之壤土，土壤样品的采集方式为土钻法。
所述火干扰为(中低程度)天然火干扰。
所述土壤样品的预处理具体包括以下步骤：将土壤样品过筛后结合振荡和超声进行分散。
所述分散的操作条件为：土水比为1:20～50(即1g土壤样品需要与20～50mL超纯水混合)，超声功率为100～400W，温度(即振荡箱温度，超声振荡于密闭体系中进行，将烧杯放入振荡箱，然后将超声探头插到烧杯中水界面以下)为15～30℃，振荡速率为20～50rpm，时间为2～8h。
所述振荡提取DOM具体包括以下步骤：于温度为15～30℃下搅拌4～16h，搅拌转速为20～80rpm。
所述固相萃取(SPE)柱的填料选自阳离子交换树脂，具体为磺酸型聚合物树脂，例如Amberlyst 15树脂(阳性固体酸催化剂)。
所述固相萃取(SPE)柱的活化溶液为乙醇。
所述质谱分析的条件为：采用电子电离源(EI)，离子化能量为70～100eV，离子源温度为150～250℃，四级管温度为140～160℃，扫描范围为1.6～500amu。
所述红外光谱分析以及元素分析的条件为：分析对象为干燥后的DOM分离样B；
红外光谱分析：波数为4000～400cm-1，KBr与样品质量比为200～100:1；
元素分析：燃烧管温度为900～1000℃，还原管温度为500～600℃，氦气流量为100～300mL/min，氧气流量为20～40mL/min，湿度为40～60％。
所述干燥优选冷冻干燥，冷冻干燥的操作条件为：-10℃预冻3～6h，-40℃冷冻3～6h，-20℃抽真空冷冻3～6h，-10℃抽真空冷冻1～4h，0℃冷冻1～4h，25℃干燥3～6h。
本发明的有益效果体现在：
本发明对比现有的最主要的土壤DOM分离纯化技术，综合考虑了DOM纯化过程的各种干扰因素，比如溶液中无机离子的干扰、滤膜自身性质等内在因素和操作技巧等外部因素对DOM纯化效率的影响，充分发挥固相萃取本身分离效果的优势，利用HCl溶液淋洗固相萃取柱，即能去除无机离子的干扰，以及用乙醇淋洗SPE柱并收集淋出液，实现了DOM的高效分离；而且整个过程在固相萃取柱中的狭小空间进行，有效避免了外部干扰，保证了提取过程的精准性和提取产物的有效性。同时，本发明引入多种波谱技术识别火干扰土壤DOM，保证了分析过程的科学性，解决了天然火干扰土壤DOM识别难度较大、精准度较差的问题。
进一步的，本发明中DOM来源于天然火干扰土壤，有助于丰富相关研究体系，填补了天然火干扰土壤DOM识别技术领域的空白。
进一步的，因为DOM中的一部分会与土壤胶体较紧密的结合，常规的提取过程无法使其大部分脱附于土壤胶体并进入溶液体系中，本发明采用的均质化(通过超声振荡实现)有助于DOM的解脱；此外，因为土壤颗粒组成包括有机质、无机组分、定型组分、非定型组分等等，较为复杂，均质化有助于样品的性质均一、孔隙均一、结构均一、组分均一，避免所取样品的偶然性，尽可能保证数据能够代表样品的整体性质；同时考虑到波谱技术对样品要求较高，进行均质化也是为了保证样品符合检测要求，保证得到更有效的波谱检测结果。
进一步的，土壤看似非活体，实际上里边的微生物、DOM(属于有机质，有机质里边就含有蛋白质、脂肪等等)，都是活体(具有活性的)的，因此，整个土壤样品可以看做活体的。本发明的冷冻干燥，第一步(-10℃)脱掉表面水，第二步(-40℃)将细胞内水逼出到细胞外，第三步(-20℃)强化第二步，第四步(-10℃)细胞外水逼到表面，第五步(0℃)尽量恢复脱水后细胞形态结构，第六步(25℃)脱水，液变气，由于样品中过多的水分会影响波谱检测结果，冷冻干燥是为了更好地强化检测结果，有助于提高波谱检测结果的精准性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
土壤样品分别采自2016年8月15日(火干扰前)和2017年3月10日(火干扰后)，采样地点为海拔1750±50m的中西部地区某森林公园内，该地区于2017年1月份发生过中小规模森林火灾。土壤类型为旱成土之壤土，采用蛇形布点法选取5个采样点(干扰前后采样点相同，手持GPS定位)，采样点间距5±0.1m，每个采样点覆盖直径为0.5m的圆周面积，每个采样点采集5个土壤样品。采集工具为土钻(配备具塞套管、接管、手柄、重力锤等配件)，土钻内壁具塞套管直径5cm，长度15cm；采集后立即将土样放入填充冰块的恒温箱内，带回实验室后放入4℃冰箱中保存备用并进行相关分析(5d内)。土壤样品基本理化性质见表1。
表1.实验用土壤样品基本理化性质
实施例1：
第一步，将火干扰前后采集的原状土柱分别分成两部分，即0-5cm表层土和5-15cm中层土；将表层土和中层土单独自然风干后过1～4mm筛，去除植物残体和颗粒过大的石粒等杂质。过筛后的土壤样品首先进行超声振荡分散，促进土壤颗粒均质化，操作过程为：烧杯中装土壤样品和超纯水，然后设定振荡箱的条件，将烧杯放入振荡箱，然后将超声探头插到烧杯中水界面以下，但不触底，设定和探头相连的控制仪的参数，就可以进行超声辅助下的振荡(即超声振荡)；操作条件为：土水比1:20(g:mL)，超声探头的超声功率100W，振荡箱温度25℃，振荡频率(速率)20rpm，时间2h。之后将土壤样品与超纯水的混合物置于振荡器(磁力搅拌器)中提取DOM，操作条件为：振荡器温度25℃，振荡频率(转速)20rpm，时间16h。此步骤结束将得到DOM水样粗产品。
第二步，采用固相萃取-抽提装置纯化DOM水样，操作步骤为：
1)注射器式SPE柱(型号：SupeliteTM DAX-8,Amberlyst 15树脂)货号：6288261-02，柱子的规格：6mL，首先用6mL色谱纯乙醇活化，分两次加入；
2)使用6mL浓度为0.1％的HCl超纯水溶液淋洗注射器式SPE柱，溶液分两次加入；
3)将第一步得到的DOM水样粗产品离心(5000rpm,10min)后过0.45μm滤膜得到滤液(6mL)，用浓度为0.1％的HCl超纯水溶液将滤液调定pH值为2，备用；
4)将调定pH值为2的滤液分2～4次缓慢过SPE柱，控制抽提装置压力为负压15±5KPa；
5)使用6mL浓度为0.1％的HCl超纯水溶液淋洗SPE柱，溶液分两次加入；
6)使用6mL色谱纯乙醇淋洗SPE柱，收集淋出液；
7)使用N2吹脱装置将淋出液体积浓缩至3±0.1mL左右，得DOM样品，可以直接供质谱(MS)分析用。质谱采用Agilent6890N-5975i，电子电离源(EI)，分析条件：离子化能量100eV，离子源温度200℃，四级管温度150℃，扫描范围1.6-500amu。
第三步，将按照步骤1)～7)得到的样品冷冻干燥后可以进行元素分析和红外光谱(FT-IR)分析，对比火干扰前后土壤DOM的性质差异。
元素分析条件：燃烧管温度950℃，还原管温度550℃，氦气流量200mL/min，氧气流量30mL/min，实验室湿度50％。
红外光谱分析条件：波数4000-400cm-1，KBr与样品质量比100:1。
元素分析结果如表3，包括碳、氢、氧、氮等元素种类和含量及原子比；红外光谱分析结果如表4，包括相应的官能团。
从质谱分析结果可知(表2)：火干扰前后分离自土壤的DOM样品TOC含量为10.12mg/L(0-5cm，火干扰前)、11.33mg/L(0-5cm，火干扰后)、8.71mg/L(5-15cm，火干扰前)和8.85mg/L(5-15cm，火干扰后)；相比于滤膜法，SPE法对于DOM的回收率更高。与相关文献相比，本发明中采用的SPE法(滤膜过滤在本专利仅是初步分离，关键在于SPE的使用，故本发明中获取DOM样品的方法可以简称SPE法)对DOM的回收率已经相当高。由表3可知：火干扰前DOM样品的O/C比值较火干扰后高，说明火干扰后DOM含氧官能团(羧基、羰基、酚羟基等)数量降低。表4表明：火干扰后土壤DOM官能团性质变化很小。由表5可知：火干扰土壤DOM的H/Cw比值有所下降，DBEw有所升高，表明DOM分子饱和度逐步下降，新鲜度逐渐升高。
综上可知：SPE法对火干扰土壤DOM的提取效率更高；火干扰土壤TOC含量有所增加；火干扰土壤DOM含氧官能团(羧基、羰基、酚羟基等)数量减少，但官能团性质变化很小；火干扰土壤DOM分子饱和度降低，新鲜度升高。
表2.滤膜法和SPE法对TOC回收率的影响
表3.SPE法纯化DOM的元素组成和原子比
表4.SPE法纯化DOM的红外光谱波峰与官能团
表5.SPE法纯化DOM的CHO数量、O/Cw、H/Cw和DBE的加权平均值
实施例2：
第一步，将火干扰前后采集的将原状土柱分别分成两部分，即0-5cm表层土和5-15cm中层土；将表层土和中层土单独自然风干后过1～4mm筛，去除植物残体和颗粒过大的石粒等杂质。过筛后的土壤样品首先进行超声振荡分散，促进土壤颗粒均质化，操作过程为：烧杯中装土壤样品和超纯水，然后设定振荡箱的条件，将烧杯放入振荡箱，然后将超声探头插到烧杯中水界面以下，但不触底，设定和探头相连的控制仪的参数，就可以进行超声辅助下的振荡；操作条件为：土水比1:30(g:mL)，超声探头的超声功率200W，振荡箱温度20℃，振荡频率(速率)50rpm，时间4h。之后将土壤样品与超纯水的混合物置于振荡器(磁力搅拌器)中提取DOM，操作条件为：振荡器温度20℃，振荡频率(转速)40rpm，时间12h。此步骤结束将得到DOM水样粗产品。
第二步，采用固相萃取-抽提装置纯化DOM水样，操作步骤为：
1)注射器式SPE柱(型号：SupeliteTM DAX-8,Amberlyst 15树脂)货号：6288261-02，柱子的规格：6mL，首先用8mL色谱纯乙醇活化，分两次加入；
2)使用8mL浓度为0.1％的HCl超纯水溶液淋洗注射器式SPE柱，溶液分两次加入；
3)将第一步得到的DOM水样粗产品离心(5000rpm,10min)后过0.45μm滤膜得到滤液(8mL)，用浓度为0.1％的HCl溶液将滤液调定pH值为2，备用；
4)将调定pH值为2的滤液分2～4次缓慢过SPE柱，控制抽提装置压力为负压15±5KPa；
5)使用8mL浓度为0.1％的HCl超纯水溶液淋洗SPE柱，溶液分两次加入；
6)使用8mL色谱纯乙醇淋洗SPE柱，收集淋出液；
7)使用N2吹脱装置将淋出液体积浓缩至3±0.1mL左右，所得DOM样品，可以直接供质谱(MS)分析用。质谱采用Agilent6890N-5975i，电子电离源(EI)，分析条件：离子化能量100eV，离子源温度200℃，四级管温度150℃，扫描范围1.6-500amu。
第三步，按照步骤1)～7)得到的样品冷冻干燥后进行元素分析和红外光谱(FT-IR)分析，对比火干扰前后土壤DOM的性质差异。
元素分析条件：燃烧管温度950℃，还原管温度550℃，氦气流量200mL/min，氧气流量30mL/min，实验室湿度50％。
红外光谱分析条件：红外光谱：波数4000-400cm-1，KBr与样品质量比100:1。
从质谱分析结果可知(表6)：火干扰前后分离自土壤的DOM样品TOC含量为10.68mg/L(0-5cm，火干扰前)、10.97mg/L(0-5cm，火干扰后)、8.14mg/L(5-15cm，火干扰前)和8.23mg/L(5-15cm，火干扰后)；相比于滤膜法，SPE法对于DOM的回收率更高。与相关文献相比，本发明中采用的SPE法对DOM的回收率已经相当高。由表7可知：火干扰前DOM样品的O/C比值较火干扰后高(中层土5-15cm)，说明火干扰后DOM含氧官能团(羧基、羰基、酚羟基等)数量减少。表8表明：火干扰后土壤DOM官能团性质变化很小。由表9可知：火干扰土壤DOM的H/Cw比值有所下降，DBEw有所升高，表明DOM分子饱和度逐步下降，新鲜度逐渐升高。
综上可知：SPE法对火干扰土壤DOM的提取效率更高；火干扰土壤TOC含量有所增加；火干扰土壤DOM含氧官能团(羧基、羰基、酚羟基等)数量有所降低，但官能团性质变化很小；火干扰土壤DOM分子饱和度降低，新鲜度升高。
表6.滤膜法和SPE法对TOC回收率的影响
表7.SPE法纯化DOM的元素组成和原子比
表8.SPE法纯化DOM的红外光谱波峰与官能团
表9.SPE法纯化DOM的CHO数量、O/Cw、H/Cw和DBE的加权平均值
实施例3：
第一步，将火干扰前后采集的原状土柱分别分成两部分，即0-5cm表层土和5-15cm中层土；将表层土和中层土单独自然风干后过1～4mm筛，去除植物残体和颗粒过大的石粒等杂质。过筛后的土壤样品首先进行超声振荡分散，促进土壤颗粒均质化，操作过程为：烧杯中装土壤样品和超纯水，然后设定振荡箱的条件，将烧杯放入振荡箱，然后将超声探头插到烧杯中水界面以下，但不触底，设定和探头相连的控制仪的参数，就可以进行超声辅助下的振荡；操作条件为：土水比1:40(g:mL)，超声探头的超声功率300W，振荡箱温度30℃，振荡频率(速率)40rpm，时间6h。之后将土壤样品与超纯水的混合物置于振荡器(磁力搅拌器)中提取DOM，操作条件为：振荡器温度30℃，振荡频率(转速)60rpm，时间8h。此步骤结束将得到DOM水样粗产品。
第二步，采用固相萃取-抽提装置纯化DOM水样，操作步骤为：
1)注射器式SPE柱(型号：SupeliteTM DAX-8,Amberlyst 15树脂)货号：6288261-02，柱子的规格：6mL，首先用10mL色谱纯乙醇活化，分两次加入；
2)使用10mL浓度为0.1％的HCl超纯水溶液淋洗注射器式SPE柱，溶液分两次加入；
3)将第一步得到的DOM水样粗产品离心(5000rpm,10min)后过0.45μm滤膜得到滤液(10mL)，用浓度为0.1％的HCl超纯水溶液将滤液调定pH值为2，备用；
4)将调定pH值为2的滤液分2～4次缓慢过SPE柱，控制抽提装置压力为负压15±5KPa；
5)使用10mL浓度为0.1％的HCl超纯水溶液淋洗SPE柱，溶液分两次加入；
6)使用10mL色谱纯乙醇淋洗SPE柱，收集淋出液；
7)使用N2吹脱装置将淋出液体积浓缩至3±0.1mL左右，得DOM样品，可以直接供质谱(MS)分析用。质谱采用Agilent6890N-5975i，电子电离源(EI)，分析条件：离子化能量100eV，离子源温度200℃，四级管温度150℃，扫描范围1.6-500amu。
第三步，将按照步骤1)～7)得到的样品冷冻干燥后进行元素分析和红外光谱(FT-IR)分析，对比火干扰前后土壤DOM的性质差异。
元素分析条件：燃烧管温度950℃，还原管温度550℃，氦气流量200mL/min，氧气流量30mL/min，实验室湿度50％。
红外光谱分析条件：波数4000-400cm-1，KBr与样品质量比100:1。
从质谱分析结果可知(表10)：火干扰前后分离自土壤的DOM样品TOC含量为10.17mg/L(0-5cm，火干扰前)、10.64mg/L(0-5cm，火干扰后)、8.58mg/L(5-15cm，火干扰前)和8.43mg/L(5-15cm，火干扰后)；相比于滤膜法，SPE法对于DOM的回收率更高。与相关文献相比，本发明中采用的SPE法对DOM的回收率已经相当高。由表11可知：火干扰前DOM样品的O/C比值较火干扰后高，说明火干扰后DOM含氧官能团(羧基、羰基、酚羟基等)数量减少。表12表明：火干扰后土壤DOM官能团性质变化很小。由表13可知：火干扰土壤DOM的H/Cw比值有所下降，DBEw有所升高，表明DOM分子饱和度逐步下降，新鲜度逐渐升高。
综上可知：SPE法对火干扰土壤DOM的提取效率更高；火干扰土壤TOC含量有所增加；火干扰土壤DOM含氧官能团(羧基、羰基、酚羟基等)数量减少，但官能团性质变化很小；火干扰土壤DOM分子饱和度降低，新鲜度升高。
表10.滤膜法和SPE法对TOC回收率的影响
表11.SPE法纯化DOM的元素组成和原子比
表12.SPE法纯化DOM的红外光谱波峰与官能团
表13.SPE法纯化DOM的CHO数量、O/Cw、H/Cw和DBE的加权平均值
实施例4：
第一步，将火干扰前后采集的原状土柱分别分成两部分，即0-5cm表层土和5-15cm中层土；将表层土和中层土单独自然风干后过1～4mm筛，去除植物残体和颗粒过大的石粒等杂质。过筛后的土壤样品首先进行超声振荡分散，促进土壤颗粒均质化，操作过程为：烧杯中装土壤样品和超纯水，然后设定振荡箱的条件，将烧杯放入振荡箱，然后将超声探头插到烧杯中水界面以下，但不触底，设定和探头相连的控制仪的参数，就可以进行超声辅助下的振荡；操作条件为：土水比1:50(g:mL)，超声探头的超声功率400W，振荡箱温度15℃，振荡频率(速率)30rpm，时间8h。之后将土壤样品与超纯水的混合物置于振荡器(磁力搅拌器)中提取DOM，操作条件为：振荡器温度15℃，振荡频率(转速)80rpm，时间4h。此步骤结束将得到DOM水样粗产品。
第二步，采用固相萃取-抽提装置纯化DOM水样，操作步骤为：
1)注射器式SPE(型号：SupeliteTM DAX-8,Amberlyst 15树脂)货号：6288261-02，柱子的规格：6mL，首先用12mL色谱纯乙醇活化，分两次加入；
2)使用12mL浓度为0.1％的HCl超纯水溶液淋洗注射器式SPE柱，溶液分两次加入；
3)将第一步得到的DOM水样粗产品离心(5000rpm,10min)后过0.45μm滤膜得到滤液(12mL)，用浓度为0.1％的HCl超纯水溶液将滤液调定pH值为2，备用；
4)将调定pH值为2的滤液分2～4次缓慢过SPE柱，控制抽提装置压力为负压15±5KPa；
5)使用12mL浓度为0.1％的HCl超纯水溶液淋洗SPE柱，溶液分两次加入；
6)使用12mL色谱纯乙醇淋洗SPE柱，收集淋出液；
7)使用N2吹脱装置将淋出液体积浓缩至3±0.1mL左右，得DOM样品，可以直接供质谱(MS)分析用。质谱采用Agilent6890N-5975i，电子电离源(EI)，分析条件：离子化能量100eV，离子源温度200℃，四级管温度150℃，扫描范围1.6-500amu。
第三步，将按照步骤1)～7)得到的样品冷冻干燥后进行元素分析和红外光谱(FT-IR)分析，对比火干扰前后土壤DOM的性质差异。
元素分析条件：燃烧管温度950℃，还原管温度550℃，氦气流量200mL/min，氧气流量30mL/min，实验室湿度50％。
红外光谱分析条件：红外光谱：波数4000-400cm-1，KBr与样品质量比100:1。
从质谱分析结果可知(表14)：火干扰前后分离自土壤的DOM样品TOC含量为9.88mg/L(0-5cm，火干扰前)、9.64mg/L(0-5cm，火干扰后)、7.79mg/L(5-15cm，火干扰前)和7.54mg/L(5-15cm，火干扰后)；相比于滤膜法，SPE法对于DOM的回收率更高。与相关文献相比，本发明中采用的SPE法对DOM的回收率已经相当高。由表15可知：火干扰前DOM样品的O/C比值较火干扰后略低，说明火干扰后DOM含氧官能团(羧基、羰基、酚羟基等)数量略有增加。表16表明：火干扰后土壤DOM官能团性质变化很小。由表17可知：火干扰土壤DOM的H/Cw比值有所下降，DBEw有所升高，表明DOM分子饱和度逐步下降，新鲜度逐渐升高。
综上可知：SPE法对火干扰土壤DOM的提取效率更高；火干扰土壤TOC含量有所增加；火干扰土壤DOM含氧官能团(羧基、羰基、酚羟基等)数量略有增加，但官能团性质变化很小；火干扰土壤DOM分子饱和度降低，新鲜度升高。
表14.滤膜法和SPE法对TOC回收率的影响
表15.SPE法纯化DOM的元素组成和原子比
表16.SPE法纯化DOM的红外光谱波峰与官能团
表17.SPE法纯化DOM的CHO数量、O/Cw、H/Cw和DBE的加权平均值
以上实施例证明，SPE-波谱联用技术识别火干扰对土壤DOM的影响是有效的。

Claims (10)

1.一种利用固相萃取-波谱联用技术识别火干扰对土壤DOM影响的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将火干扰前后采集的土壤样品进行预处理，使对应土壤样品颗粒均质化；利用水由颗粒均质化土壤样品中振荡提取DOM，得到对应土壤样品的DOM水样粗产品；
2)将DOM水样粗产品分别离心后滤膜过滤，取6～12mL滤液，用体积分数为0.05％～0.2％的HCl水溶液调节pH值为1.9～2.1，得到对应土壤样品的DOM分离样A；将每个DOM分离样A通过固相萃取柱后，用6～12mL体积分数为0.05％～0.2％的HCl水溶液淋洗固相萃取柱，然后用6～12mL乙醇淋洗固相萃取柱并收集淋出液，用N2吹脱装置将淋出液体积浓缩至1～3mL，得到对应土壤样品的DOM分离样B；
3)将DOM分离样B分别进行元素分析、质谱分析和红外光谱分析，根据分析结果对比火干扰前后土壤DOM的性质差异。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述土壤样品类型为旱成土之壤土，土壤样品的采集方式为土钻法。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述火干扰为天然火干扰。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述预处理具体包括以下步骤：将土壤样品过筛后结合振荡和超声进行分散。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述分散的操作条件为：1g土壤样品与20～50mL水混合，超声功率为100～400W，温度为15～30℃，振荡速率为20～50rpm，时间为2～8h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述振荡提取DOM具体包括以下步骤：于温度为15～30℃下搅拌4～16h，搅拌转速为20～80rpm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述固相萃取柱的填料选自阳离子交换树脂。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述固相萃取柱的活化液为乙醇。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述质谱分析的条件为：采用电子电离源，离子化能量为70～100eV，离子源温度为150～250℃，四级管温度为140～160℃，扫描范围为1.6～500amu；所述红外光谱分析的条件为：波数为4000～400cm-1，KBr与样品质量比为200～100:1；所述元素分析的条件为：燃烧管温度为900～1000℃，还原管温度为500～600℃，氦气流量为100～300mL/min，氧气流量为20～40mL/min，湿度为40～60％。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述红外光谱分析和元素分析的对象为干燥后的DOM分离样B，干燥采用冷冻干燥，冷冻干燥的操作条件为：依次于-10℃预冻3～6h，-40℃冷冻3～6h，-20℃抽真空冷冻3～6h，-10℃抽真空冷冻1～4h，0℃冷冻1～4h，25℃干燥3～6h。
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