CN107422066B - 基于非均相体系测定不同酰基结冷胶中酰基含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了基于非均相体系测定不同酰基结冷胶中酰基含量的方法，包括制备反应液和盐酸标准液、非均相脱酰基处理、酸碱滴定、根据公式计算结冷胶的酰基含量的步骤。利用结冷胶在非均相体系中的高分散性能，基于水相酸碱滴定的基础上进行了反应体系，反应剂种类，反应时间和反应温度的优化，确定了乙醇非均相体系测定不同酰基结冷胶酰基含量的具体方法。该检测方法解决了高酰基结冷胶在水相体系中溶解性能不佳导致的数据偏移问题，为酰基含量的准确测定提供了简单可靠的测量结果。因此本发明可适用于不同酰基结冷胶的酰基含量的定量检测，有利于对结冷胶尤其是高酰基结冷胶的质量控制、品质提升、应用推广及产品的改性研究。

Description

基于非均相体系测定不同酰基结冷胶中酰基含量的方法

技术领域

本发明涉及一种结冷胶多糖中酰基含量测定的方法。更具体地说，本发明涉及一种基于乙醇非均相体系对不同酰基含量结冷胶的酰基含量进行定量测定的方法。

背景技术

近年来，微生物胞外多糖由于在产品结构、性能及生产方面所具有的特别优势而得到大力研究和开发。结冷胶作为其中一种新型微生物多糖，相较于其它传统高分子食品胶，具有低添加量、低粘度值和高稳定性的特点，在食品及生物医药领域具有广阔应用前景。

结冷胶是一种阴离子型线性大分子多糖，其主链是由β-1,4-D葡萄糖醛酸和α-1,4-L鼠李糖，β-1,3-D葡萄糖以l:l:2比例组成的四糖重复单元。结冷胶根据酰基含量高低可分为高酰基和低酰基结冷胶(附图1所示)。不同酰基含量的结冷胶其凝胶特性及应用性能差异较大，酰基含量的准确测定有助于系统地研究酰基组成对于结冷胶凝胶特性的影响，也是监测结冷胶产品品质的重要指标之一。因此有必要建立一种快速有效的方法适用于不同酰基结冷胶的测量，从而有利于结冷胶的品质提升、应用推广及产品的改性研究。

然而，结冷胶作为一种微生物胞外多糖，其分子结构和组成较为复杂，化学屏蔽严重，酰基含量的准确测定已成为结冷胶尤其是高酰基结冷胶深入研究的瓶颈。国内外对于酰基含量测定的相关研究较少。已知的测定结冷胶酰基含量的方法包括(例如)各种色谱技术和酸碱滴定技术。

Murillo等(2014)描述了一种检测方法，通过阳离子交换树脂法制备得到钠型高酰基结冷胶(NaHAG)并采用核磁手段进行结构表征。但高酰基结冷胶作为一种高分子多糖，支链中的甘油酰基化学屏蔽严重，普通核磁很难对其进行准确表征。此外，核磁法对仪器的精密度和操作者的技术要求较高，需要昂贵的仪器和高水平的技术人员，并不特别适用于需要快速结果的工厂实验室。

詹晓北等(2015)描述了一种检测方法，采用离子色谱柱对高酰基结冷胶的酰基含量进行定量分析，且目的峰的分离度较好。但该方法主要适用于溶解性能较好的自制高酰基结冷胶。而事实上，鉴于发酵提纯工艺的不完善，国产高酰基结冷胶普遍存在溶解性能不足的问题，对酰基含量的准确测定带来一定影响。此外，离子色谱柱比较昂贵，样品预处理过程中不可避免带来较多钠离子与氯离子，常规方法很难将其分离，盐离子的存在将对离子柱造成不可逆损害。

秦方等(1997)描述了一种检测方法，针对均相酸碱滴定体系确定了低酰基结冷胶酰基含量测定的最佳反应条件。该方法简单快速，是目前结冷胶生产厂家最常用的测定方法之一。但相对于低酰基结冷胶，高酰基结冷胶尤其是国产高酰基结冷胶在水溶液中的溶解性能不佳，这将直接影响测量结果的准确性和重复性，这是已知的均相酸碱滴定法的显著缺点。

因此需要提供一种简单有效的结冷胶酰基含量的测定方法，无论是针对溶解性能较好的低酰基结冷胶或是溶解性能欠佳的高酰基结冷胶或是部分脱酰基结冷胶产品，该检测方法均是准确和可靠的，并且与已知的检测方法相比，该方法更简单快速，也更不易受到操作者水平及结冷胶溶解性能的干扰，更适用于工厂流水线的产品指标检测。

到目前为止，关于结冷胶酰基含量的测定方法均是基于均相体系即水溶液体系为反应体系，对于非均相体系中结冷胶的酰基含量测定未见任何报道。本方法引进非均相滴定的概念，利用高酰基结冷胶在乙醇非均相体系中分散性能较好这一特点，进行反应体系，反应剂种类，反应时间和反应温度的优化，建立非均相体系酸碱滴定的最优条件。该方法能很好地解决高酰基结冷胶亲水性能不足导致的测量误差问题，测定方法简单经济，测定结果准确可靠，有助于工厂快速准确测定结冷胶的酰基含量，从而利于结冷胶的质量控制、品质提升、应用推广及产品的改性研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于乙醇非均相体系针对不同酰基结冷胶进行酰基含量准确测定的方法，充分利用高酰基结冷胶在乙醇非均相体系中的高分散性能，解决了其在均相体系中由于亲水性能不足导致的测量误差问题，具有可拓宽方法适用范围、降低溶解度干扰、提高数据准确性的优点。

本发明采用如下技术方案实现上述目的：

一种基于非均相体系测定不同酰基结冷胶中酰基含量的方法，其特征是主要包括以下步骤：

(1)反应液1的制备：配置1000mL质量百分比为70％的乙醇溶液，封口

膜密封，超声混合，备用；

(2)反应液2的制备：称取110g氢氧化钠溶于100mL水，摇匀后注入聚乙烯容器，密闭放置至溶液清亮，作为氢氧化钠储备液；移液枪移取37g氢氧化钠储备液，加水稀释至1000g，备用；

(3)盐酸标准液的制备：移液枪移取45mL浓盐酸，加入适量蒸馏水配置1000mL盐酸溶液，作为滴定标准液；标定浓度，记为C_HCl；

(4)非均相脱酰基处理：称取一定质量的结冷胶于锥形瓶，沿壁倒入反应液1，充分混匀后加入反应液2；放入恒温摇床振荡，进行脱酰基处理；

(5)酸碱滴定：待步骤4中脱酰基反应结束后向锥形瓶中滴加2-3滴酚酞指示剂，用已标定的盐酸标准液进行滴定，待体系的粉红色刚好消失且30s不褪色，记录此时消耗的盐酸体积为V₁；同时做空白试样，记下盐酸的消耗体积为V₀；根据公式计算结冷胶的酰基含量；

碱基％＝(V₀-V₁)*C_HCl*0.043*100/M

其中，M为结冷胶的质量，单位为g，C_HCl为HCl标定浓度，单位为mol/L，V₁为样品消耗的盐酸体积，单位为mL，V₀为空白组消耗的盐酸体积，单位为mL。

进一步地，基于非均相体系测定不同酰基结冷胶中酰基含量的方法还包括步骤：(6)终点判定：为确定脱酰基反应完全，滴定结束后对样品进行离心处理，重新取得干燥固体；重复上述步骤，进行酰基含量的2次滴定。

进一步地，步骤(4)中结冷胶的称取质量宜在0.7-1.2g之间，反应液1的加入量为100mL，反应液2的加入量为10.00mL。摇床温度控制为60±1℃，反应时间为48h，转速为150r/min。在此条件下结冷胶得到充分的脱酰基处理。采用乙醇非均相体系能很好地解决结冷胶在均相体系中亲水性能不足导致的测量误差问题。

步骤(6)的作用是进一步确认步骤(5)的脱酰基反应完全，第二次酰基含量的测定值应≤0.5％，否则需要适当延长非均相脱酰基反应的时间。对于工厂实际检测而言，同一批次或是同一发酵条件下生产的结冷胶只需进行一次终点的判定及可能存在的反应时间的调整。

本发明提供的基于非均相体系测定不同酰基结冷胶中酰基含量的方法，利用高酰基结冷胶在非均相体系中分散性能较好这一特点，基于水相酸碱滴定的基础上进行了反应体系，反应剂种类，反应时间和反应温度的优化，建立了非均相体系测定不同酰基结冷胶酰基含量的具体方法，相关优化数据详见附图2-附图5。与传统均相酸碱滴定相比，选择乙醇非均相体系作为反应的溶剂体系，具有拓宽方法适用范围、降低溶解度干扰、提高数据准确性的优点。

相较于现有技术，无论是针对溶解性能较好的低酰基结冷胶或是溶解性能欠佳的高酰基结冷胶或是部分脱酰基结冷胶产品，该检测方法均可提供准确可靠，重复性良好的测试结果，且对实验条件要求较宽，对操作人员的技术水平及仪器的精密程度要求较低。与已知的检测方法相比，在某些实施方案中，该检测方法还具有简化后续提纯步骤的附加优点。

本方法具有优点如下：与传统均相酸碱滴定相比，选择乙醇非均相体系作为反应体系，充分利用高酰基结冷胶在乙醇非均相体系中的高分散性能，解决了其在均相体系中由于亲水性能不足导致的测量误差问题，具有拓宽方法适用范围、降低溶解度干扰、提高数据准确性的优点。其测定方法简单经济，测定结果准确可靠，便于工厂快速准确测定结冷胶的酰基含量，制定相关生产技术指标。本方法有利于对结冷胶尤其是高酰基结冷胶的质量控制、品质提升、应用推广及产品的改性研究。

附图说明

图1是结冷胶的分子模式图(a)高酰基结冷胶(b)低酰基结冷胶。

图2示出高酰基结冷胶在均相、非均相两种体系中的分散溶解情况。

图3是乙醇浓度对结冷胶酰基含量测量值的影响(碱浓度0.5mol/L，温度60℃，时间48h)。

图4是碱种类及浓度对结冷胶酰基含量测量值的影响(乙醇浓度70％，温度60℃，时间48h)。

图5是反应时间对结冷胶酰基含量测量值的影响(碱浓度0.5mol/L，醇浓度70％，反应温度60℃)。

图6是反应温度对结冷胶酰基含量测量值的影响(碱浓度0.5mol/L，乙醇浓度70％，时间48h)。

具体实施方式

下面采用具体实施例的方式具体地解释本发明，但本发明不局限于实施例。

实施例1：

反应体系，反应剂种类，反应时间和反应温度的优化。图3是乙醇浓度对结冷胶酰基含量测量值的影响(碱浓度0.5mol/L，温度60℃，时间48h)。

图4是碱种类及浓度对结冷胶酰基含量测量值的影响(乙醇浓度70％，温度60℃，时间48h)。图5是反应时间对结冷胶酰基含量测量值的影响(碱浓度0.5mol/L，醇浓度70％，反应温度60℃)。图6是反应温度对结冷胶酰基含量测量值的影响(碱浓度0.5mol/L，乙醇浓度70％，时间48h)。根据优化结果，选择反应条件为碱浓度0.5mol/L，乙醇浓度70％，时间48h，反应温度60℃。

实施例2

分别称取相同质量(0.1g/100mL)的市售高酰基结冷胶LT100-P于250mL锥形瓶进行现有技术及本实验方法的比较。图1示出高酰基结冷胶在均相、非均相两种体系中的分散溶解情况。表1示出高酰基结冷胶在均相、非均相两种体系中酰基含量的测定结果。对于高酰基结冷胶，氢键的大量存在使其在均相体系中溶解性能欠佳，操作过程中极易沾壁导致测量数据的偏移，通常使用的均相体系酸碱滴定法有其局限性。相较于均相体系，乙醇非均相体系能较好地分散高酰基结冷胶样品，酰基含量的测定结果平行性较好，所得数值与文献参考值一致。本方法解决了高酰基结冷胶在均相体系中溶解性能不足导致的数据偏移问题。

表1高酰基结冷胶在均相、非均相体系中酰基测定结果的比较

实施例3

称取一定质量的结冷胶样品，在50％(w/w)乙醇非均相体系中缓和脱酰基一定时间，后经乙醇洗脱、减压干燥制备得到部分脱酰基结冷胶(分别命名为G0，G1，G2，G3)。由于不需要酒精沉淀和冷冻干燥技术，仅利用减压干燥技术即可实现部分脱酰基结冷胶的分离纯化，这种非均相体系脱酰基的方法非常适用于实验室小型的部分脱酰基结冷胶产品的制备，并能最大程度保留结冷胶的凝胶特性，简化后续提纯步骤。部分脱酰基结冷胶的酰基含量测定结果列于表2，结果表明基于非均相体系的酰基含量测定方法同样适用于部分脱酰基结冷胶产品。

表2部分脱酰基结冷胶产品的酰基含量测定

实施例4

本方法同样适用于低酰基结冷胶产品。分别称取0.8030g，0.8051g，0.8035g低酰基结冷胶3于250mL锥形瓶，加入100mL 70％(w/w)乙醇溶液，混合均匀后加入10.00mL0.5mol/L的氢氧化钠溶液(0.5mol/L)。60℃恒温摇床振荡36h。滴加2滴酚酞指示剂，用0.5404mol/L的HCl溶液滴定体系中过量的碱直到粉红色刚好消失且30s不变色，记录此时消耗HCl的体积V₁＝8.70mL，8.58mL，8.27mL。同时用HCl标定不加胶的空白样，记下消耗HCl体积V₀＝9.51mL。测得低酰基结冷胶3的酰基含量为2.86±0.64％。结果表明基于非均相体系的酰基含量测定方法同样适用于低酰基结冷胶产品。

实施例5：

分别称取0.5020g，0.5063g高酰基结冷胶样品4于250mL锥形瓶，加入100mL 70％(w/w)乙醇溶液，混合后加入10.00mL氢氧化钠溶液(0.5mol/L)。60℃恒温摇床振荡36h。加2滴酚酞指示剂后用0.5404mol/L的HCl溶液滴定体系中过量的碱直到粉红色刚好消失且30s不变色，记录此时消耗HCl的体积V₁＝7.76mL，7.79mL。同时用HCl标定不加胶的空白样，记下消耗HCl体积V₀＝9.51mL。测得高酰基结冷胶4的酰基含量为7.95±0.15％。

本发明的上述实施案例均仅为示例用途。在不脱离本发明的范围的情况下，本领域的技术人员可对特定实施方案进行改变、改进和变化，本发明的范围仅用所附权利要求所限定。

Claims (4)

1.一种基于非均相体系测定不同酰基结冷胶中酰基含量的方法，其特征是主要包括以下步骤：

(1)反应液一的制备：配置1000mL质量百分比为70％的乙醇溶液，封口膜密封，超声混合，备用；

(2)反应液二的制备：称取110g氢氧化钠溶于100mL水，摇匀后注入聚乙烯容器，密闭放置至溶液清亮，作为氢氧化钠储备液；移液枪移取37g氢氧化钠储备液，加水稀释至1000g，备用；

(3)盐酸标准液的制备：移液枪移取45mL浓盐酸，加入适量蒸馏水配置1000mL盐酸溶液，作为滴定标准液；标定浓度，记为C_HCl；

(4)非均相脱酰基处理：称取一定质量的结冷胶于锥形瓶，沿壁倒入反应液一，充分混匀后加入反应液二；放入恒温摇床振荡，进行脱酰基处理；

(5)酸碱滴定：待步骤(4)中脱酰基反应结束后向锥形瓶中滴加2-3滴酚酞指示剂，用已标定的盐酸标准液进行滴定，待体系的粉红色刚好消失且30s不褪色，记录此时消耗的盐酸体积为V₁；同时做空白试样，记下盐酸的消耗体积为V₀；根据公式计算结冷胶的酰基含量；

碱基％＝(V₀-V₁)*C_HCl*0.043*100/M

其中，M为结冷胶的质量，单位为g，C_HCl为HCl标定浓度，单位为mol/L，V₁为样品消耗的盐酸体积，单位为mL，V₀为空白组消耗的盐酸体积，单位为mL。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：

(6)终点判定：为确定脱酰基反应完全，滴定结束后对样品进行离心处理，重新取得干燥固体；重复上述步骤，进行酰基含量的2次滴定。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中结冷胶的质量为0.7-1.2g，反应液一的加入量为100mL，反应液二的加入量为10mL，摇床温度控制为60±1℃，反应时间为48h，转速为150r/min。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(6)中第二次酰基含量的测定值应≤0.5％，否则需要延长非均相脱酰基反应的时间。