CN107406871A - 用于鉴别免疫组库中的疾病相关cdr3模式的方法 - Google Patents

用于鉴别免疫组库中的疾病相关cdr3模式的方法 Download PDF

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Abstract

本公开内容一般地涉及开发基于免疫应答和得到的免疫组库的诊断试验的方法。本文公开的方法增加信号和减小背景以允许可以用于产生疾病标签的共享CDR3的鉴别。本文公开的方法可以用于开发针对不同疾病的诊断试验，所述疾病包括、但不限于，癌症、自身免疫病、炎性疾病和传染性疾病。

Description

用于鉴别免疫组库中的疾病相关CDR3模式的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求标题为“用于鉴别免疫组库中的疾病相关CDR3模式的方法(Methodfor Identifying Disease-Associated CDR3 Patterns in an Immunorepertoire)”并在2015年3月9日提交的美国临时专利申请号62/130,512的优先权，其通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及用于识别人和/或动物受试者中的疾病相关的免疫组库的方法和这样的方法用于疾病诊断和用于研究疾病过程的用途。
背景技术
通过有限、但是大数目的基因区段的体细胞重组产生T和B淋巴细胞的不同抗原受体。这些基因区段-V(可变)、D(多样性)、J(连接)和C(恒定)-决定了免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。受体的重排的V(D)J部分(被称作V-区域)是非常重要的，因为它负责表位识别。当V(D)J被翻译成氨基酸序列时，V-区域可以被细分成由前导序列、框架(FR)1、互补性决定区1(CDR1)、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4和C-结构域组成的几个部分。
CDR3是特别重要的，因为研究已经指示，该区域与抗原特异性有关。与正常受试者相比，具有各种疾病的患者可能经历他们的免疫组库的定量和/或定性变化。定量变化可以表现为免疫组库多样性的增加和减少。定性变化可以表现为T或B细胞中增加的疾病特异性的CDR3的共享。
免疫系统引起针对各种病症(诸如癌症、细菌感染、病毒感染和真菌感染)的应答。此外，在某些受试者中，它可能实际上产生对身体组织的有害应答，从而导致例如自身免疫病或移植物排斥。如果准确地得到的话，这些免疫应答的类型和程度可能潜在地是特定疾病或不希望的免疫应答的存在或不存在的最重要的和准确的指示剂之一。
但是，估计人类具有多达1015-1025个不同的T细胞，这归因于可能VDJ重排、n-添加和α-β链组合的数目。对于特定疾病，假设仅存在103种可能定量地(通过上调或下调)或定性地(通过增加或减少)变化的疾病特异性的CDR3，在这些情况下的信噪比是非常弱的。因此，常规方法对于为了诊断目的评估该信息而言是不实用的。
需要改进的用于免疫应答评估和用于基于这样的免疫应答和得到的免疫组库来开发诊断试验的方法。
发明内容
在一个实施方案中，本公开内容涉及使用免疫组库开发诊断试验的方法，所述方法包括下述步骤：(a)从患者组和对照组中的多个受试者中的每一个收集样品，其中所述患者组包含患有相同疾病的受试者，且所述对照组包含被归类为健康的受试者；(b)将所述两组中的每个组的每位受试者的免疫组库扩增并测序以鉴别存在于样品中的每个独特CDR3序列和确定每个独特CDR3序列的存在频率；(c)鉴别在所述对照组和所述患者组中的每个组的至少两位受试者之间共享的CDR3序列；(d)将鉴别的CDR3序列按存在频率的次序排序；(e)鉴别来自每个组的Linklets；和(f)鉴别在统计上显著的程度与患者组有关的Linklets以提供疾病标签。
在某些实施方案中，所述样品是外周血。在其它实施方案中，所述样品是组织。在某些实施方案中，鉴别出少于1,000个CDR3序列在至少两位受试者之间共享。在其它实施方案中，鉴别出至少1,000CDR3序列在至少两位受试者之间共享。在某些实施方案中，从每个组鉴别出至少约106个Linklets。在其它实施方案中，从每个组鉴别出少于约106个Linklets。
附图说明
参考以下附图可以更好地理解本公开内容。
图1的插图解释了公开的方法的基本概念，其中使用软件处理来自免疫系统细胞的多核苷酸序列数据，所述软件被设计成将序列分选和计数，将它们按照频率数目排序，产生p值和其它标准，以产生来自被命名为“显著Linklets”的Linklets的诊断标签。
图2的表解释了按照存在于样品中的克隆的数目对CDR3的排序。通常，来自一个样品的测序结果将产生多达400,000个CDR3。每个CDR3与读出计数有关；由于扩增方法(arm-PCR)的半定量性质，所述读出计数也反映了所述克隆的相对丰度。软件分析除去误差，并将CDR3排序以产生如在表中所示的输出文件。
图3的表解释了如何在得自血液样品的序列中检测Linklets。定制CDR3序列以提供在血液样品中以最高数目存在的CDR3序列的列表。在那些CDR3序列中，Linklets代表在相同样品内存在的CDR3的对-在高于指定的截止水平的水平。
图4是在乳腺癌研究过程中鉴别出的一些Linklets的代表性列表(在两个研究组中检测到的Linklets之间的对比-第一组受试者已经被诊断出乳腺癌，第二组受试者被命名为健康对照)。
图5列出了在乳腺癌研究中基于它们的p值检测到的公共Linklets。排在前面的Linklet是例如CDR3对‘ASSYSRGEEF’和‘ASSLGRTHQPQH’，且该Linklet被98个乳腺癌患者样品中的32个共享，而106个对照样品中仅1个具有它。p值为0。仅具有＜0.05的p值的那些Linklets被包括在代表乳腺癌诊断标签的最终列表中。鉴别出共101，902个显著Linklets。
图6的散点图解释了3个组中的受试者的结果：对照、乳腺癌和CMV(巨细胞病毒)。受试者操作特征(ROC)曲线分析提示600个DSL的截止值。在103个乳腺癌患者中，98个具有超过600个显著Linklets；在110个对照中，仅7个具有超过600个显著Linklets。因此，诊断灵敏度和特异性分别是95％和93％。当针对乳腺癌疾病标签研究188个非乳腺癌样品(来自在CMV研究中招募的患者)时，仅3个样品是具有超过600个显著Linklets的假阳性，从而产生98.4％的特异性。
详细描述
本公开内容一般地涉及用于开发基于免疫应答和得到的免疫组库的诊断试验的方法。本文公开的方法会增加信号和减小背景以允许可以用于产生疾病标签的共享CDR3的鉴别。本文公开的方法可以用于开发针对不同疾病的诊断试验，所述疾病包括、但不限于，癌症、自身免疫病、炎性疾病和传染性疾病。
本文中使用的“疾病”包括诊断出的疾病以及诊断出的和未诊断出的对受试者的正常健康的其它破坏。
本文中使用的“健康的”是指当前没有表现出疾病的征状，且当前没有诊断出疾病。
本文中使用的“免疫组库”包含受试者的在功能上不同的T和B细胞。
本文中使用的“Linklet”是存在于相同样品中的一对独特CDR3。当两个或更多个人共享特定Linklet时，那么它是“公共Linklet。”如果某个Linklet仅在一个受试者中检测到，那么它是“私有Linklet”。公共Linklets来自公共CDR3(即，在超过一个受试者中检测到的CDR3)。一般而言，每位受试者的组库在较大程度上是“私有的”，且该受试者的免疫组库的仅小百分比代表共享CDR3。因此公共Linklets以比私有Linklets低得多的水平存在，该事实使得疾病标签的鉴别更困难。因此，重要的是利用这样的方案：其减少背景以允许鉴别构成一个或多个疾病标签的显著CDR3组库。
本文中使用的“样品”包含血液和组织。在某些实施方案中，血液是从受试者收集的外周血。在某些实施方案中，组织是从受试者得到的活组织检查。
本文中使用的“受试者”是指人或动物。
在某些实施方案中，本文公开的方法通过使用“阳性Linklets”来减少背景。当对两个CDR3序列A和B测序时，也得到由读出计数代表的定量信息。如果使用的免疫组库扩增方法是半定量(arm-PCR)，且如果CDR3-A在样品中以比CDR3-B更高的水平表达，那么将得到比关于B更多的关于A的序列读出计数。在这样的情况下，A-B对被命名为阳性Linklet，而B-A对则被命名为阴性Linklet。在本文公开的方法的某些实施方案中，仅阳性Linklets用于进一步分析。阳性Linklets的应用会富集诊断信号，因为它帮助滤出实验噪音。
在生物学上，超过一种抗原或表位通常与特定疾病有关。因此，有关的T和B细胞受体通常作为簇出现在患者的样品中。由阳性Linklets(和阴性Linklets)提供的定量信息可能反映疾病特异性的抗原表达谱。
实验操作可能在产生的数据中引入另外的“噪音”。例如，通常实践是将来自不同受试者的许多样品合并在一个测序运行中以降低成本(使用带条形码的引物分别扩增免疫组库)。但是，如果CDR3在一个样品中是非常优势的，它将在测序芯片上出现多次。该优势克隆将具有1/8,000个机会被分配至错误的条形码，且被相同运行中的所有其它样品“共享”。如果将CDR3用作基本分析单元，这些“受污染的”序列将被视作生物学上共享，且用作诊断信号。使用Linklets允许这些噪音被滤出，因为那些错误地分配的CDR3经常具有非常低的频率，并且它们将成为一个或多个阳性Linklets的组成部分的可能性下降(具有它们将形成阴性Linklets的更高可能性)。通过仅考虑阳性Linklets，可以滤出噪音。并且，如果仅使用来自样品的排序在前面的CDR3(例如，例如5,000个、或1,000至50,000个排序在前面的CDR3)，那些错误地分配的CDR3由于它们的低频率通常不被考虑。
当发现一组公共Linklets与一组共同具有特定疾病的受试者在较高程度上有关时，可以将那些公共Linklets处理为疾病特异性的Linklets或“显著Linklets”。因此，与特定疾病有关的一组显著Linklets可以构成“疾病标签”。因此，如果发现受试者的样品具有与疾病标签的统计上显著的重叠，可以为该受试者做出这样的疾病的诊断。
本文公开的方法包括下述步骤：(1)从被分配至患者组和对照组的受试者收集样品；(2)将每个样品的免疫组库扩增和测序；(3)鉴别来自每个样品的免疫组库的独特CDR3序列；(4)计算各个(独特)CDR3序列在免疫组库中检测到的次数，由此鉴别占优势的那些克隆(通过将它们按从最高存在频率至最低存在频率的次序排序来确定)；(5)对比受试者的免疫组库以鉴别在至少两位受试者之间共享的CDR3(“公共CDR3”)；(6)将公共CDR3基于它们的存在频率进行排序；(7)从排序在前面的CDR3产生阳性Linklets的列表；(8)滤出私有Linklets并保留公共Linklets；和(9)鉴别与在靶疾病组中的患者有关、但是与对照组无关的公共Linklets。
在某些实施方案中，将至少约100个受试者分配至每个组。在某些实施方案中，使用arm-PCR方法(描述在WO2009/124293中)扩增免疫组库。在某些实施方案中，将前5,000个克隆鉴别为占优势的。在某些实施方案中，阳性Linklets的列表包括排序在前面的1,000-20,000个CDR3。在某些实施方案中，与在靶疾病组中的患者有关、但是与对照组无关的公共Linklets的置信值是p＜0.05。
与患者有关、但是与对照组无关的公共Linklets的列表(疾病相关的Linklets或DSLs)构成被命名为“标签Linklets”的组。在某些实施方案中，通过分析约100位患者和相等数目的对照可以得到标签。然后确定截止疾病标签Linklet(DSL)值。通过测序、随后计数DSL，可以试验未知样品。如果DSL数目满足或超过截止值，做出关于特定疾病的诊断。
例如，在某些实施方案中为了得到用于分析的序列数据，将来自受试者(例如，人或动物，疾病组或对照(健康))的全血用处理以提取外周血单核细胞或PBMC，从而获得最高浓度的淋巴细胞。每类淋巴细胞具有特定标识符(被称作CD标志物或分化标志物簇)，将其编号。例如，细胞毒性的T-细胞具有CD8标志物，辅助性T-细胞具有CD4标志物。可以将已经用特定抗-CD标志物标签的磁珠加入细胞悬浮液中。将所述柱应用于磁场以后，珠子结合的细胞将被捕获或正选择，同时允许其它细胞类型流动穿过。可以使用流动穿过的或负选择的细胞悬浮液在下游应用中进一步分离其它细胞群体。在其它实施方案中，所述样品可以是组织，其可以使用本领域已知的方法处理以分离淋巴细胞。
由于在某些T细胞群体内存在亚群(例如，调节性T细胞是辅助性T-细胞的亚群)，如果需要分离亚群，那么可以将释放试剂加给CD4-珠子结合的细胞以释放所述珠子，使得另一种磁珠可以结合所述细胞。例如，在调节性T-细胞的情况下，可以将CD25+选择微米珠加入细胞悬浮液中以从辅助性T-细胞群体提取调节性T-细胞群体。
通过本领域技术人员已知的方式(参见，例如，Murray，BMC Res Notes.2013年11月1日；6：440)，可以执行多核苷酸分离(RNA或DNA)。使用在WO2009/124293中描述的方法(arm-PCR)可以执行序列的扩增，所述方法提供了在本文公开的方法中取得优良结果所必需的灵敏度和特异性。
还可以使用本领域已知的方法执行测序。鉴于必须确定的序列的数目，通常采用高通量测序方法，例如，Illumina的下一代测序，其使用Illumina测序引物。
产生了大量数据，且必须如下进行分析和处理：测序，计算特定序列(代表各个克隆)存在的次数，按照基于存在频率的次序将克隆排序，和本文描述的其它分析。这最方便地和有效地使用序列数据分析程序执行。一个这样的程序是CDR3 Algebra，其为研究人员完成分选、排序和配对。还可以使用这样的程序执行统计分析，诸如p值的计算。
本文公开的方法本身导致用于多种疾病的诊断试验的开发，所述疾病包括、但不限于，癌症、自身免疫病、细菌感染、病毒感染和真菌感染，由此给研究人员和临床医师提供用于诊断和研究目标疾病的有价值的工具。
借助于以下非限制性实施例可以进一步描述本文公开的方法。
实施例
从全血分离外周血单核细胞(PBMC)
将来自健康受试者(对照组)和以前诊断出乳腺癌的患者(患者组)的全血用PBS缓冲液稀释至原始体积的2-4倍。将10mL收集在肝素钠中的全血转移至50mL锥形管，并用缓冲液稀释至35mL线。将经稀释的细胞悬浮液(35mL)在单独的50mL锥形管中在15mL上面小心地分层。将试管在摆动吊桶转子中在没有制动的情况下在20摄氏度在400x g离心30分钟。
将含有PBS缓冲液和血浆的上层小心地抽吸以取出它。将混浊的单核细胞层小心地转移至新鲜50mL锥形管。然后将试管用缓冲液填充至50mL刻度并在20摄氏度在300x g离心20分钟。将澄清上清液取出并将细胞沉淀物再悬浮于8mL缓冲液中。
从分离的PBMC分离单核细胞
将细胞使用血球计数器计数，并将样品在室温在300x g离心10分钟。通过抽吸取出上清液。将细胞再悬浮于80μL缓冲液/107个细胞中。
每1x107个细胞加入20微升CD14微珠，并通过轻轻上下吸液进行混合。将微米珠/细胞混合物在4℃温育15分钟。将细胞通过每1x107个细胞加入2mL缓冲液进行洗涤，然后在300x g离心10分钟。
将上清液完全抽吸并再悬浮于缓冲液中(108个细胞在500uL缓冲液中)。将LS磁柱放在磁体上，并用3mL缓冲液洗涤。抛弃流动穿过的缓冲液。将细胞悬浮液应用于所述柱，并将流动穿过的未标签的细胞收集在经标签的15mL锥形管中。将所述柱用3mL缓冲液洗涤3次，仅当柱蓄池为空时加入新的缓冲液。
将新的清洁的标签了“单核细胞”的15mL锥形管放在柱下，并从磁体取出所述柱。将缓冲液(5mL)移入柱中，并立即将磁性地标签的细胞如下清洗：将柱塞用力推入柱。
将两个试管在300x g离心10分钟，并将上清液完全抽吸。对于标签了“单核细胞”的试管，将细胞再悬浮于2mL缓冲液中。将20微升移出以备用于细胞计数方案，并将试管在300x g离心10分钟。将细胞再悬浮于500μL并在4℃储存用于以后提取RNA。对于标签了“CD14-”的试管，将细胞再悬浮于80μL缓冲液/107个细胞。
RNA提取
将细胞在20℃在3,000rpm离心3分钟，将上清液取出，并通过轻打试管将细胞沉淀物弄松散。将BME缓冲液(350μL)加入样品中，并将细胞沉淀物通过涡旋完全地溶解。
将样品转移至QIAshredder柱，并通过在10,000rpm离心2分钟进行均质化。将柱抛弃，并将流穿物保存。将乙醇(70％，350μL)加入流穿物，并通过抽吸混合样品。将样品(700μL)转移至旋转柱并放在2ml收集试管中。将样品在10,000rpm离心15秒。将流穿物抛弃。在存在超过700μL样品的情况下，使用相同柱重复该步骤。
将700μL缓冲液RW1加入旋转柱并将样品在10,000rpm离心15秒，抛弃流穿物。将500μL缓冲液RPE加入旋转柱，并将样品在10,000rpm离心15秒，抛弃流穿物。
将500μL缓冲液RPE加入旋转柱，并将样品在10,000rpm离心2分钟。将旋转柱放在新2mL收集试管中并在10,000rpm离心1分钟以干燥柱膜。将旋转柱放在新1.5mL收集试管中。除了含有分离的调节性T细胞的样品以外，将25μL无RNA酶的水加入所有样品中。向调节性T细胞样品中加入20μL无RNA酶的水。将样品在室温静置1分钟。将样品在10,000rpm离心1分钟并抛弃柱。
使用聚合酶链式反应扩增CDR3序列
使用在WO2009/124293(Han)中公开的arm-PCR方法执行CDR3序列的PCR扩增。通常推荐具有1.8或更大的260/280的最少100ng RNA或gDNA(取决于选择的试剂系统)作为起始原料来得到arm-PCR免疫组库文库的最佳多样性。在第一轮PCR过程中，使用靶向V和J(或C)基因中的每一种的嵌套基因特异性引物。正向引物Fo(forward-out)和Fi(forward-in)靶向V基因。反向引物Ro(reverse-out)和Ri(reverse-in)靶向J或C基因中的每一种。Fi和Ri引物也分别包括测序衔接子B和A，用于平台(HiSeq，MiSeq和GAIIx)进行配对末端测序。使用公有(普通)引物B和A进行第二轮PCR。凝胶纯化以后，得到的产物准备好使用平台的高通量测序。第一轮PCR将条形码和测序引物引入PCR产物中。
在第二轮PCR中通过公有引物实现扩增的指数期；因此，均匀地和半定量地扩增靶标免疫组库，而不引入额外的扩增偏倚。
乳腺癌标签的鉴别
收集了共213个样品，包括来自乳腺癌患者的103个和来自对照的110个。从213个样品鉴别出共14,666,172个CDR3，平均来自每个样品有68,855个CDR3。发现了来自213个样品的8,301,648个独特CDR3。除去私有的CDR3以后，使用可从公司网站(例如，CDR3Algebra)得到的iRepertoire(Huntsville，Alabama USA)软件从213个样品鉴别出共98,076个公共的(即，由至少两位受试者共享)和占优势的(即，在每个样品中排序在前5,000个CDR3内)CDR3。从213个样品产生共287,198,206个阳性Linklets，平均来自每个样品有1,003,236个Linklets。除去私有Linklets以后，剩下16,921,605个被至少一个其它人共享的Linklets。对于每个共享的Linklet，得到p值以鉴别在患者之间优先共享的那些。将共117,069Linklets鉴别为具有p＜0.05的显著Linklets，从而提供疾病的“标签”。共6,171个CDR3为117,069个疾病标签Linklets做出贡献。使用600个显著Linklets的截止值，可以以93.6％的特异性诊断出95％的乳腺癌。当研究188个非乳腺癌样品时，仅3个样品是假阳性的(具有超过600个DSL)，从而产生98.4％的特异性。
本文公开的方法会增加信号和减小背景以允许鉴别可以用于产生疾病标签的共享CDR3，这对于以其它方式使用常规方法是不可能的。所以，本文公开的方法具有允许开发关于不同疾病的诊断试验的益处，所述疾病包括、但不限于，癌症、自身免疫病、炎性疾病和传染性疾病。
本申请提及多篇出版物。这些出版物的公开内容以它们的整体特此通过引用并入本申请中以更充分地描述本申请所述属领域的状态。关于在所述参考文献所依赖的句子中讨论的、在它们中所含的内容，公开的参考文献也个别地和具体地通过引用并入本文。
本文描述的方法及其各种实施方案是示例性的。本文描述的方法的各种其它实施方案是可能的。

Claims (8)

1.一种开发特定疾病的诊断试验的方法，所述方法包括下述步骤：
从患者组和对照组中的多个受试者中的每一个收集样品，其中所述患者组包含患有相同疾病的受试者，且所述对照组包含健康的受试者；
将两组中的每个组的每位受试者的免疫组库扩增并测序以鉴别存在于样品中的每个独特CDR3序列并确定每个独特CDR3序列的存在频率；
鉴别在所述对照组和所述患者组中的每个组的至少两位受试者之间共享的CDR3序列；
将所述CDR3序列按存在频率的次序排序；
鉴别来自每个组的Linklets；和
鉴别在统计上显著的程度与患者组有关的Linklets以提供疾病标签。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是血液。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是组织。
4.根据权利要求1所述的方法，其中鉴别出至少约1,000个CDR3序列在所述对照组和所述患者组中的每个组的至少两位受试者之间共享。
5.根据权利要求1所述的方法，其中鉴别出至少约106个来自每个组的Linklets。
6.根据权利要求1所述的方法，其中将与疾病标签有关的Linklets的最小数目确立为诊断数目，从而当在受试者的血液样品中鉴别出至少该数目的Linklets时，该受试者被诊断为患有所述疾病。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述诊断数目是至少约500。
8.一种开发特定疾病的诊断试验的方法，所述方法包括下述步骤：
从患者组和对照组中的多个受试者中的每一个收集血液样品，其中所述患者组包含患有相同疾病的受试者，且所述对照组包含被归类为健康的受试者；
将两组中的每个组的每位受试者的免疫组库扩增并测序以鉴别存在于血液样品中的每个独特CDR3序列并确定每个独特CDR3序列的存在频率；
鉴别出在所述对照组和所述患者组中的每个组的至少两位受试者之间共享的至少约1,000个CDR3序列；
将所述至少约1,000个CDR3序列按照存在频率的次序排序；
鉴别来自每个组的至少约106个Linklets；和
鉴别在统计上显著的程度与患者组有关的Linklets以提供疾病标签；
其中将与疾病标签有关的Linklets的最小数目确立为诊断数目，从而当在受试者的血液样品中鉴别出至少该数目的Linklets时，该受试者被诊断为患有所述疾病。
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