KR20170134427A - 면역 레퍼토리에서 질환과 관련된 cdr3 패턴을 확인하는 방법 - Google Patents
면역 레퍼토리에서 질환과 관련된 cdr3 패턴을 확인하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 개시는 일반적으로 면역 반응 및 그로부터 형성된 면역 레퍼토리에 기초한 진단 검사를 개발하는 방법에 관한 것이다. 본 출원에 개시된 방법은 시그널을 증가시키고 백그라운드를 감소시켜, 질환 지표(disease signature)를 생성하는 데 이용될 수 있는 공유된 CDR3을 확인할 수 있게 한다. 본 출원에 개시된 방법은 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 및 감염성 질환을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 다양한 질환의 진단 검사를 개발하는 데 이용될 수 있다.
Description
[관련 출원에 대한 상호 참조]
본 출원은, 발명의 명칭이 "면역 레퍼토리에서 질환과 관련된 CDR3 패턴을 확인하는 방법"인, 2015년 3월 9일에 출원된 미국 가특허출원 제62/130,512호를 기초로 우선권을 주장하며, 상기 가특허출원은 본 출원에 참조에 의해 포함된다.
[발명의 분야]
본 발명은 인간 및/또는 동물 대상체의 질환과 관련된 면역 레퍼토리(immune repertoire)를 확인하는 방법 및 질환 진단 및 질환 진행의 연구를 위한 상기 방법의 용도에 관한 것이다.
T 및 B 림프구의 다양한 항원 수용체가, 한정된, 그러나 많은 수의 유전자 세그먼트의 체세포 재조합에 의해 생성된다. 이들 유전자 세그먼트 - V(가변), D(다양성), J(연결), 및 C(불변) - 는 결합 특이성과 면역글로불린 및 T 세포 수용체(TCR)의 다운스트림 적용을 결정한다. V 영역으로 불리는 수용체의 재배열된 V(D)J 부분이 특히 관심의 대상인데, 그 이유는 이것이 에피토프 인식을 담당하기 때문이다. V(D)J가 아미노산 서열로 번역될 경우, V 영역은 리더 서열, 프레임워크(FR) 1, 상보성 결정 영역 1(CDR1), FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4, 및 C 도메인으로 이루어지는 7개 파트로 세분될 수 있다.
연구에 따르면 CDR3 영역이 항원 특이성과 연관이 있기 때문에 CDR3이 특히 관심의 대상이다. 정상 대상체와 비교하여, 각종 질환을 갖는 환자들은 그들의 면역 레퍼토리에 있어서 정량적 및/또는 정성적 변화를 겪을 수 있다. 정량적 변화는 면역 레퍼토리 다양성의 증가 및 감소로서 나타날 수 있다. 정성적 변화는 T 또는 B 세포에서의 질환 특이적 CDR3의 공유 증가로서 나타날 수 있다.
면역계는 암, 박테리아 감염, 바이러스 감염 및 진균 감염과 같은 다양한 병태들에 대한 반응을 일으킨다. 또한, 일부 대상체에서는, 이것이 실제로 신체 조직에 대한 유해 반응을 유발하여, 예를 들어, 자가면역 질환 또는 이식편의 거부를 초래할 수 있다. 이들 면역 반응의 유형 및 정도는, 정확히 입수될 수 있다면, 잠재적으로, 특정 질환의 존부 또는 바람직하지 않은 면역 반응의 가장 중요하고 정확한 지표자 중 하나가 될 수 있다.
그러나, 인간은, 가능한 VDJ 재배열, n-부가 및 알파-베타 사슬 조합의 수로 인하여 무려 1015∼1025개의 서로 다른 T 세포를 갖는 것으로 추정되고 있다. 특정 질환에 대해, 정량적으로(상향 또는 하향 조절을 통해) 또는 정성적으로(획득(gain) 또는 손실(loss)을 통해) 바뀔 수 있는 질환 특이적 CDR3이 단지 103개 존재한다고 가정해도, 이러한 상황에서의 시그널 대 노이즈 비는 매우 약하다. 따라서, 종래의 방법은 진단을 목적으로 이러한 정보를 평가하는 데 실용적이지 않다.
면역 반응의 평가 및 그러한 면역 반응 및 결과적인 면역 레퍼토리에 기초한 진단 검사의 개발을 위한 방법의 개선이 필요한 실정이다.
일 실시형태에서, 본 개시는 면역 레퍼토리를 이용하여 진단 검사를 개발하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (a) 환자 그룹 및 대조군 그룹의 복수의 대상체 각각으로부터 샘플을 수집하는 단계로서, 상기 환자 그룹은 동일한 질환을 갖는 대상체를 포함하고, 상기 대조군 그룹은 건강하다고 분류되는 대상체를 포함하는 것인 단계; (b) 두 그룹 각각에서 각각의 대상체의 면역 레퍼토리를 증폭시키고 시퀀싱하여 샘플 중에 존재하는 각각의 독특한 CDR3 서열을 확인하고 각각의 독특한 CDR3 서열의 발생 빈도를 결정하는 단계; (c) 대조군 그룹과 환자 그룹 각각에서 적어도 두 대상체가 공유하는 CDR3 서열을 확인하는 단계; (d) 확인된 CDR3 서열을 발생 빈도 순으로 순위화하는 단계; (e) 각각의 그룹으로부터 링클릿을 확인하는 단계; 및 (f) 환자 그룹과 통계적으로 유의적인 수준으로 연관되어 있는 링클릿을 확인하여 질환 지표(disease signature)를 제공하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 샘플은 말초혈이다. 다른 실시형태에서, 상기 샘플은 조직이다. 특정 실시형태에서, 적어도 두 대상체 사이에 1,000개보다 적은 CDR3 서열이 공유되는 것으로 확인된다. 다른 실시형태에서, 적어도 두 대상체 사이에 1,000개 이상의 CDR3 서열이 공유되는 것으로 확인된다. 특정 실시형태에서, 각 그룹으로부터 약 106개 이상의 링클릿이 확인된다. 다른 실시형태에서, 각 그룹으로부터 106개 미만의 링클릿이 확인된다.
본 개시는 첨부된 도면을 참조하면 더 잘 이해될 수 있다.
도 1은, 면역계 세포로부터의 폴리뉴클레오티드 서열 데이터가, 그 서열을 소팅 및 카운팅하고, 빈도수로 그 순위를 정하고, p 값 및 다른 기준을 생성하여, "유의 링클릿(Significant Linklet)"으로서 명명된 링클릿으로부터 진단 지표를 생성하도록 설계된 소프트웨어를 이용하여 처리되는, 개시된 방법의 기본 개념을 예시하는 카툰(cartoon)이다.
도 2는 샘플 중에 존재하는 클론수에 의한 CDR3의 순위화를 예시하는 표이다. 일반적으로, 한 샘플로부터의 시퀀싱 결과는 무려 400,000개의 CDR3을 생성할 것이다. 각각의 CDR3은 리드 카운트(read count)와 연관되어 있으며; 증폭법(arm-PCR)의 반정량적 특성으로 인해, 리드 카운트는 또한 클론의 상대 존재도(abundance)를 반영한다. 소프트웨어 분석은 오차를 없애고 CDR3을 순위화하여 표에 나타낸 바와 같은 출력 파일을 생성한다.
도 3은 혈액 샘플로부터 얻은 서열에서 링클릿을 어떻게 검출하지를 예시하는 표이다. CDR3 서열을 집계하여 혈액 샘플 중에 가장 많은 수로 존재하는 CDR3 서열의 리스트를 제공한다. 이들 CDR3 서열 중에서, 링클릿은 정해진 컷오프 수준보다 높은 수준으로 동일한 샘플 내에 존재하는 CDR3의 쌍을 나타낸다.
도 4는, 유방암 연구 중에 확인된 링클릿의 일부의 대표적 리스트이다(두 연구 그룹에서 검출된 링클릿 간의 비교 - 유방암으로 진단된 제1 대상체 그룹과 건강한 대조군으로서 지정된 제2 대상체 그룹).
도 5는, 유방암 연구에서, 그 p 값을 기초로 검출된 퍼블릭 링클릿을 나열한다. 예를 들어 상위 링클릿은 CDR3 쌍 'ASSYSRGEEF' 및 'ASSLGRTHQPQH'이고, 이 링클릿은 98개의 유방암 환자 샘플 중 32개에서 공유되는 반면, 106개 대조군 샘플 중 1개만이 그것을 가졌다. p 값은 0이었다. p 값이 0.05 미만인 링클릿만이 유방암 진단 지표를 나타내는 최종 리스트에 포함된다. 총 101,902개의 유의 링클릿이 확인되었다.
도 6은, 3개 그룹, 즉 대조군 그룹, 유방암 그룹, 및 CMV(사이토메갈로바이러스) 그룹의 대상체의 결과를 예시하는 산점도이다. 수신자 조작 특성(Receiver Operating Characteristic; ROC) 곡선 분석은 컷오프 값 600 DSL을 제시하였다. 103명의 유방암 환자 중에서 98명이 600 초과의 유의 링클릿을 가졌고; 110명의 대조군 중 7명만이 600 초과의 유의 링클릿을 가졌다. 따라서, 진단 감도 및 특이성은 각각 95% 및 93%였다. (CMV 연구에 등록된 환자로부터) 188개의 비유방암 샘플을 유방암 질환 지표에 대해 분석하였으며, 단 3개 샘플만이 600 초과의 유의 링클릿을 갖는 위양성(false positive)이어서, 98.4%의 특이성을 제공하였다.
도 1은, 면역계 세포로부터의 폴리뉴클레오티드 서열 데이터가, 그 서열을 소팅 및 카운팅하고, 빈도수로 그 순위를 정하고, p 값 및 다른 기준을 생성하여, "유의 링클릿(Significant Linklet)"으로서 명명된 링클릿으로부터 진단 지표를 생성하도록 설계된 소프트웨어를 이용하여 처리되는, 개시된 방법의 기본 개념을 예시하는 카툰(cartoon)이다.
도 2는 샘플 중에 존재하는 클론수에 의한 CDR3의 순위화를 예시하는 표이다. 일반적으로, 한 샘플로부터의 시퀀싱 결과는 무려 400,000개의 CDR3을 생성할 것이다. 각각의 CDR3은 리드 카운트(read count)와 연관되어 있으며; 증폭법(arm-PCR)의 반정량적 특성으로 인해, 리드 카운트는 또한 클론의 상대 존재도(abundance)를 반영한다. 소프트웨어 분석은 오차를 없애고 CDR3을 순위화하여 표에 나타낸 바와 같은 출력 파일을 생성한다.
도 3은 혈액 샘플로부터 얻은 서열에서 링클릿을 어떻게 검출하지를 예시하는 표이다. CDR3 서열을 집계하여 혈액 샘플 중에 가장 많은 수로 존재하는 CDR3 서열의 리스트를 제공한다. 이들 CDR3 서열 중에서, 링클릿은 정해진 컷오프 수준보다 높은 수준으로 동일한 샘플 내에 존재하는 CDR3의 쌍을 나타낸다.
도 4는, 유방암 연구 중에 확인된 링클릿의 일부의 대표적 리스트이다(두 연구 그룹에서 검출된 링클릿 간의 비교 - 유방암으로 진단된 제1 대상체 그룹과 건강한 대조군으로서 지정된 제2 대상체 그룹).
도 5는, 유방암 연구에서, 그 p 값을 기초로 검출된 퍼블릭 링클릿을 나열한다. 예를 들어 상위 링클릿은 CDR3 쌍 'ASSYSRGEEF' 및 'ASSLGRTHQPQH'이고, 이 링클릿은 98개의 유방암 환자 샘플 중 32개에서 공유되는 반면, 106개 대조군 샘플 중 1개만이 그것을 가졌다. p 값은 0이었다. p 값이 0.05 미만인 링클릿만이 유방암 진단 지표를 나타내는 최종 리스트에 포함된다. 총 101,902개의 유의 링클릿이 확인되었다.
도 6은, 3개 그룹, 즉 대조군 그룹, 유방암 그룹, 및 CMV(사이토메갈로바이러스) 그룹의 대상체의 결과를 예시하는 산점도이다. 수신자 조작 특성(Receiver Operating Characteristic; ROC) 곡선 분석은 컷오프 값 600 DSL을 제시하였다. 103명의 유방암 환자 중에서 98명이 600 초과의 유의 링클릿을 가졌고; 110명의 대조군 중 7명만이 600 초과의 유의 링클릿을 가졌다. 따라서, 진단 감도 및 특이성은 각각 95% 및 93%였다. (CMV 연구에 등록된 환자로부터) 188개의 비유방암 샘플을 유방암 질환 지표에 대해 분석하였으며, 단 3개 샘플만이 600 초과의 유의 링클릿을 갖는 위양성(false positive)이어서, 98.4%의 특이성을 제공하였다.
본 개시는 일반적으로 면역 반응 및 그로부터 형성된 면역 레퍼토리에 기초한 진단 검사를 개발하는 방법에 관한 것이다. 본 출원에 개시된 방법은 시그널을 증가시키고 백그라운드를 감소시켜서, 진단 지표를 생성하는 데 이용될 수 있는 공유된 CDR3을 확인할 수 있도록 한다. 본 출원에 개시된 방법은 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 및 감염성 질환을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 다양한 질환들에 대한 진단 검사를 개발하는 데 이용될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 바와 같이, "질환"은 진단된 질환과, 진단된, 그리고 진단되지 않은, 대상체의 정상적인 건강의 기타 파괴 상태를 포함한다.
본 출원에서 사용되는 바와 같이, "건강한"이란 질환의 증상을 현재 나타내지 않고 현재 질환을 갖는 것으로 진단되지 않은 것을 의미한다.
본 출원에서 사용되는 바와 같이, "면역 레퍼토리"는 대상체의 기능적으로 다양한 T 세포 및 B 세포를 포함한다.
본 출원에서 사용되는 바와 같이, "링클릿(Linklet)"은 동일 샘플 중에 존재하는 독특한 CDR3의 쌍이다. 2인 이상이 특정 링클릿을 공유할 경우, 그것은 "퍼블릭 링클릿(Public Linklet)"이다. 링클릿이 단 1명의 대상체에서만 검출된다면, 그것은 "프라이빗 링클릿(Private Linklet)"이다. 퍼블릭 링클릿은 퍼블릭 CDR3(즉, 1명보다 많은 대상체에서 검출되는 CDR3)으로부터 유래된다. 일반적으로, 각각의 대상체의 레퍼토리는 대체로 "프라이빗"이고, 대상체의 면역 레퍼토리의 적은 비율만이 공유된 CDR3을 나타낸다. 따라서, 퍼블릭 링클릿은 프라이빗 링클릿보다 훨씬 더 적은 수준으로 존재하며, 이 점이 질환 지표의 확인을 더 어렵게 만든다. 그래서, 하나 이상의 질환 지표를 구성하는 유의적인 CDR3 레퍼토리를 확인할 수 있도록 백그라운드를 감소시키는 접근법을 이용하는 것이 중요하다.
본 출원에서 사용되는 바와 같이, "샘플"은 혈액 및 조직을 포함한다. 특정 실시형태에서, 혈액은 대상체로부터 수집한 말초혈이다. 특정 실시형태에서, 조직은 대상체로부터 얻은 생검이다.
본 출원에서 사용되는 바와 같이, "대상체"는 인간 또는 동물을 의미한다.
특정 실시형태에서, 본 출원에 개시된 방법은 "포지티브 링클릿(Positive Linklet)"의 사용을 통해 백그라운드를 감소시킨다. 2개의 CDR3 서열, 즉 A 및 B가 시퀀싱될 경우, 리드 카운트로 나타내어지는 정량적 정보가 또한 얻어진다. 이용된 면역 레퍼토리 증폭법이 반정량적(arm-PCR)이고, CDR3-A가 CDR3-B보다 샘플에서 더 높은 수준으로 발현될 경우, B보다 A에 대해 더 많은 서열 리드 카운트가 얻어질 것이다. 그러한 시나리오에서, A-B 쌍은 포지티브 링클릿으로 지정되는 반면, B-A 쌍은 네거티브 링클릿으로 지정된다. 본 출원에 개시된 방법의 특정 실시형태에서, 포지티브 링클릿만이 추가 분석에 사용된다. 포지티브 링클릿의 사용은 실험 노이즈를 필터링하는 데 도움이 되기 때문에 진단 시그널을 강화시킨다.
생물학적으로 볼 때, 특정 질환에 일반적으로 1종 초과의 항원 또는 에피토프가 관련되어 있다. 따라서, 관련된 T 및 B 세포 수용체는 일반적으로 환자 샘플 중에 클러스터로서 나타난다. 포지티브 링클릿(및 네거티브 링클릿)에 의해 제공되는 정량적 정보는 질환 특이적 항원 발현 프로파일을 반영할 수 있다.
실험 절차는 생성된 데이터에 추가적인 "노이즈"를 도입할 수 있다. 예를 들어, 비용을 줄이기 위해 서로 다른 대상체로부터의 다수의 샘플을 1회 시퀀싱 런으로 합쳐 넣는 것이 일반적인 관행이다(면역 레퍼토리는 바코딩된 프라이머를 이용하여 개별적으로 증폭시킴). 그러나, CDR3이 한 샘플에서 크게 우위를 점할 경우, 그것이 시퀀싱 칩 상에 여러 번 나타날 것이다. 그 우점(도미넌트) 클론은, 틀린 바코드에 배정되어져서 동일 런에서 다른 모든 샘플에 의해 "공유되어질" 기회가 1/8,000이 된다. CDR3이 기분 분석 단위로서 이용될 경우, 이러한 "오염된" 서열은 생물학적으로 공유된 것으로 간주되어 진단 시그널로서 사용될 것이다. 링클릿의 사용은 이들 노이즈를 필터링해 낼 수 있는데, 왜냐하면 그러한 잘못 배정된 CDR3은 일반적으로 매우 낮은 빈도로 존재하고, 이들이 하나 이상의 포지티브 링클릿의 일부가 될 가능성이 줄어들기 때문이다(이들이 네거티브 링클릿을 형성할 가능성은 더 커짐). 포지티브 링클릿만을 고려함으로써, 노이즈를 필터링할 수 있다. 또한, 샘플로부터의 상위 CDR3만 사용할 경우(예를 들어, 상위 CDR3 중 5,000개, 또는 1,000∼50,000개), 이러한 잘못 배정된 CDR3은 이들의 낮은 빈도로 인해 일반적으로 고려되지 않는다.
퍼블릭 링클릿 그룹이 특정 질환을 공통으로 갖는 대상체 그룹과 더 높은 수준으로 연관되어 있다고 확인될 경우, 그러한 퍼블릭 링클릿은 질환 특이적 링클릿 또는 "유의 링클릿"으로서 간주될 수 있다. 따라서, 특정 질환과 관련된 유의 링클릿 그룹은 "질환 지표"를 구성할 수 있다. 따라서, 대상체의 샘플이 질환 지표와 통계적으로 유의적인 오버랩을 갖는 것으로 확인된다면, 그 대상체에 그 질환의 진단을 할 수 있다.
본 출원에 개시된 방법은 하기 단계들을 포함한다: (1) 환자 그룹 및 대조군 그룹에 배정된 대상체로부터 샘플을 수집하는 단계; (2) 각 샘플에 대한 면역 레퍼토리를 증폭시키고 시퀀싱하는 단계; (3) 각 샘플의 면역 레퍼토리로부터 독특한 CDR3 서열을 확인하는 단계; (4) 개개의(독특한) CDR3 서열이 면역 레퍼토리에서 검출되는 횟수를 집계하여, 우위를 점하는 클론을 확인하는 단계(가장 높은 발생 빈도로부터 가장 낮은 발생 빈도의 순으로 순위화함으로써 결정함); (5) 대상체의 면역 레퍼토리를 비교하여, 적어도 두 대상체 사이에 공유되는 CDR3("퍼블릭 CDR")을 확인하는 단계; (6) 발생 빈도를 기초로 퍼블릭 CDR3을 순위화하는 단계; (7) 상위 CDR3으로부터 포지티브 링클릿의 리스트를 생성하는 단계; (8) 프라이빗 링클릿을 필터링하고 퍼블릭 링클릿을 유지시키는 단계; 및 (9) 표적 질환 그룹의 환자와 연관되어 있으나 대조군 그룹과는 연관되어 있지 않은 퍼블릭 링클릿을 확인하는 단계.
특정 실시형태에서, 약 100 이상의 대상체가 각 그룹에 배정된다. 특정 실시형태에서, arm-PCR법(WO2009/124293에 기재됨)을 이용하여 면역 레퍼토리를 증폭시킨다. 특정 실시형태에서, 상위 5,000개 클론을 도미넌트로서 확인한다. 특정 실시형태에서, 포지티브 링클릿의 리스트는 상위 1,000∼20,000개의 CDR3을 포함한다. 특정 실시형태에서, 표적 질환 그룹의 환자와 연관되어 있으나 대조군 그룹과는 연관되어 있지 않은 퍼블릭 링클릿에 대한 신뢰값은 p < 0.05이다.
환자와 연관되어 있으나 대조군 그룹과는 연관되어 있지 않은 퍼블릭 링클릿(질환 관련 링클릿, 또는 DSL)의 리스트를 "지표 링클릿(Signature Linklet)"이라 명명한다. 특정 실시형태에서, 지표는 약 100명의 환자와 동수의 대조군을 분석함으로써 얻을 수 있다. 그 후, 컷오프 질환 지표 링클릿(Disease Signature Linklet; DSL)을 결정한다. 시퀀싱에 이어 DSL을 카운팅함으로써 미확인 샘플을 검사할 수 있다. DSL 수가 컷오프를 충족하거나 초과할 경우, 특정 질환에 대한 진단이 이루어진다.
예를 들어, 분석을 위한 서열 데이터를 얻기 위한 특정 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 인간 또는 동물, 질환 그룹 또는 대조군(건강한))으로부터 얻은 전혈을 Ficoll®로 처리하여, 말초혈 단핵구 또는 PBMC를 추출하고 최고 농도의 림프구를 얻는다. 각 유형의 림프구는 번호가 매겨지는 CD 마커 또는 분화 마커의 클러스터라 불리는 특이적인 식별자를 갖고 있다. 예를 들어, 세포독성 T 세포는 CD8 마커를 갖고 있고, 헬퍼 T 세포는 CD4 마커를 갖고 있다. 특이적 항-CD 마커로 표지된 마그네틱 비드를 세포 현탁액에 첨가할 수 있다. 컬럼을 자기장에 적용하면, 비드에 결합된 세포가 포획되거나 양성 선별되는 한편, 다른 세포 유형은 통과하여 흘러갈 것이다. 통과액 또는 음성 선별된 세포 현탁액을, 다운스트림 적용에서 다른 세포 집단을 추가로 단리하는 데 이용할 수 있다. 다른 실시형태에서, 샘플은 조직일 수 있으며, 이것은 당업계에 알려진 림프구 단리 방법을 이용하여 처리될 수 있다.
T 세포의 특정 집단 내에 아집단이 존재하기 때문에(예를 들어, 조절 T 세포는 헬퍼 T 세포의 아집단이다), 아집단을 분리할 필요가 있다면, CD4-비드 결합 세포에 유리 시약을 첨가하여, 비드를 떼어내어, 다른 마그네틱 비드가 그 세포에 결합할 수 있도록 할 수 있다. 조절 T 세포의 경우, 예를 들어, CD25+ 선별 마이크로비드를 세포 현탁액에 첨가하여, 헬퍼 T 세포 집단으로부터 조절 T 세포 집단을 추출할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 단리(RNA 또는 DNA)는 당업자에게 공지된 방법으로 수행할 수 있다(예를 들어, 문헌[Murray, BMC Res Notes. 2013 Nov 1;6:440] 참조). 서열 증폭은 WO2009/124293(arm-PCR)에 기재된 방법을 이용하여 수행할 수 있으며, 이 방법은 본 출원에 개시된 방법에서 우수한 결과를 얻는 데 필요한 감도와 특이성을 제공한다.
시퀀싱 역시 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 결정되어야 하는 서열의 수를 고려하여, 예를 들어 Illumina 시퀀싱 프라이머를 이용하는 Illumina의 차세대 시퀀싱(Next-Generation Sequencing)과 같은 고속대량(high-throughput) 시퀀싱법이 일반적으로 이용된다.
대량의 데이터가 생성되며, 그 데이터는 시퀀싱, (개개의 클론을 나타내는) 특정 서열이 발생하는 횟수의 집계, 발생 빈도를 기초로 순서대로 클론을 순위화하는 것 및 본 출원에 기재된 다른 분석의 결과로서 분석되고 조작되어야 한다. 이것을 서열 데이터 분석 프로그램을 이용하여 가장 편리하고 효율적으로 수행한다. 그러한 프로그램 중 하나가 연구자를 위해 소팅, 순위화 및 페어링을 하는 CDR3 알지브라(Algebra)이다. p 값의 계산과 같은 통계 분석도 그러한 프로그램을 이용하여 행할 수 있다.
본 출원에 개시된 방법은 암, 자가면역 질환, 박테리아 감염, 바이러스 감염 및 진균 감염을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 각종 질환에 대한 진단 검사를 개발하는 데 적합하여, 연구자 및 임상의에게 관심있는 질환의 진단 및 연구를 위한 유용한 툴을 제공한다.
이하의 비한정적인 실시예를 이용하여 본 출원에 개시된 방법을 추가로 설명할 수 있다.
실시예
전혈로부터 말초혈 단핵구(PBMC)를 단리함
건강한 대상체(대조군 그룹)와 이미 유방암 진단을 받은 환자(환자 그룹)로부터 얻은 전혈을 원래 부피의 2∼4x로 PBS 완충제로 희석시켰다. 나트륨 헤파린에 모은 전혈 10 mL를 50 mL 코니칼 튜브로 옮겨서 완충제로 35 mL 라인까지 희석시켰다. 희석된 세포 현탁액(35 mL)을 별개의 50 mL 코니칼 튜브의 15 mL의 Ficoll-Paque® 위에 조심스럽게 적층시켰다. 스윙 버킷 로터(swing bucket rotor)에서 제동 없이 20℃에서 400 x g로 30분 동안 튜브를 원심분리하였다.
PBS 완충제와 혈장을 포함하는 상층을 조심스럽게 흡인하여 제거하였다. 혼탁한 단핵구층을 조심스럽게 새로운 50 mL 코니칼 튜브로 옮겼다. 그 후, 튜브에 완충제를 50 mL 표시까지 채우고 20℃에서 300 x g로 20분 동안 원심분리하였다. 맑은 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 8 mL의 완충제에 재현탁시켰다.
단리된 PBMC로부터 단핵구를 단리함
혈구계를 이용하여 세포를 카운팅하고, 샘플을 실온에서 300 x g로 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 흡인하여 제거하였다. 세포를 107개 세포당 80 ㎕의 완충제에 재현탁시켰다.
1 x 107개 세포당 20 ㎕의 CD14 마이크로비드를 첨가하고, 약하게 위아래로 피펫팅함으로써 혼합하였다. 마이크로비드/세포 혼합물을 4℃에서 15분 동안 인큐베이트하였다. 1 x 107개 세포당 2 mL의 완충제를 첨가하여 세포를 세척한 후, 300 x g로 10분 동안 원심분리하였다.
상청액을 완전히 흡인하여 완충제(완충제 500 ㎕ 중 108개 세포)에 재현탁시켰다. LS 마그네틱 컬럼을 자석 위에 올려 놓고 3 mL의 완충제로 세척하였다. 통류 완충제는 버렸다. 세포 현탁액을 컬럼에 적용하고, 통과한 비표지 세포를 표지된 15 mL 코니칼 튜브에 모았다. 컬럼을 3 mL의 완충제로 3회 세척하고, 컬럼 저장소가 비었을 때에만 새로운 완충제를 추가하였다.
"단핵구"로 표지한 새로운 깨끗한 15 mL 코니칼 튜브를 컬럼 아래에 배치하고, 컬럼을 자석으로부터 분리하였다. 완충제(5 mL)를 컬럼에 피펫팅하여 넣고, 플런저를 컬럼으로 단단히 밀어 넣음으로써 자성으로 표지된 세포를 바로 내보냈다.
양 튜브 모두 300 x g로 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 완전히 흡인시켰다. "단핵구"로 표지된 튜브의 경우, 세포를 2 mL의 완충제에 재현탁시켰다. 세포 카운팅 프로토콜에 사용될 수 있도록 20 ㎕를 피펫팅하여 빼내고, 튜브를 300 x g로 10분 동안 원심분리하였다. 세포를 500 ㎕의 RNAprotect®에 재현탁시키고, 나중의 RNA 추출을 위해 4℃에 저장하였다. "CD14-"로 표지된 튜브의 경우, 세포를 107개 세포당 80 ㎕의 완충제에 재현탁시켰다.
RNA 추출
세포를 20℃에서 3,000 rpm으로 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 튜브를 가볍게 쳐서 세포 펠릿을 풀었다. 샘플에 BME 완충제(350 ㎕)를 첨가하고, 볼텍싱으로 세포 펠릿을 완전히 용해시켰다.
샘플을 QIAshredder 컬럼으로 옮겨, 10,000 rpm으로 2분 동안 원심분리하여 균질화하였다. 컬럼을 버리고, 통과액을 모아 두었다. 통과액에 에탄올(70%, 350 ㎕)을 첨가하고, 샘플을 피펫팅으로 혼합하였다. 샘플(700 ㎕)을 RNeasy® 스핀 컬럼으로 옮겨서 2 ml 수집 튜브에 넣었다. 샘플을 10,000 rpm으로 15초 동안 원심분리하였다. 통과액은 버렸다. 샘플량이 700 ㎕를 넘는 경우, 동일 컬럼을 이용하여 이 단계를 반복하였다.
완충제 RW1 700 ㎕를 스핀 컬럼에 첨가하고, 샘플을 10,000 rpm으로 15초 동안 원심분리하고, 통과액은 버렸다. 완충제 RPE 500 ㎕를 스핀 컬럼에 첨가하고, 샘플을 10,000 rpm으로 15초 동안 원심분리하고, 통과액은 버렸다.
완충제 RPE 500 ㎕를 스핀 컬럼에 첨가하고, 샘플을 10,000 rpm으로 2분 동안 원심분리하였다. 스핀 컬럼을 새로운 2 mL 수집 튜브에 넣고 10,000 rpm으로 1분 동안 원심분리하여 컬럼 막이 건조되게 하였다. 스핀 컬럼을 새로운 1.5 mL 수집 튜브에 넣었다. 단리된 조절 T 세포를 함유하는 샘플을 제외한 모든 샘플에 RNase가 없는 물 25 ㎕를 첨가하였다. 조절 T 세포 샘플에 RNase가 없는 물 20 ㎕를 첨가하였다. 샘플을 실온에서 1분 동안 정치시켰다. 샘플을 10,000 rpm으로 1분 동안 원심분리하고, 컬럼을 버렸다.
폴리머라제 연쇄 반응을 이용한 CDR3 서열의 증폭
WO2009/124293(Han)에 개시된 arm-PCR법을 이용하여 CDR3 서열의 PCR 증폭을 행하였다. 260/280이 1.8 이상인 100 ng의 최소량의 RNA 또는 gDNA(선택된 시약 시스템에 따라)가 arm-PCR 면역 레퍼토리 라이브러리의 최상의 다양성을 얻기 위한 출발 물질로서 일반적으로 권장된다. 제1 라운드의 PCR에서, V 및 J(또는 C) 유전자 각각을 표적으로 하는 네스티드(nested) 유전자 특이적 프라이머를 사용하였다. 정방향 프라이머 Fo(포워드 아웃) 및 Fi(포워드 인)는 V 유전자를 표적으로 했다. 역방향 프라이머 Ro(리버스 아웃) 및 Ri(리버스 인)은 J 또는 C 유전자를 각각 표적으로 했다. Fi 프라이머 및 Ri 프라이머는 또한 페어드-엔드 시퀀싱을 위한 Illumina® 플랫폼(HiSeq, MiSeq 및 GAIIx)을 위해 각각 시퀀싱 어댑터 B 및 A를 포함하였다. 제2 라운드의 PCR은 공동 사용되는(공통된) 프라이머 B 및 A를 이용하여 수행하였다. 겔 정제 후, 얻어진 생성물은 Illumina® 플랫폼을 이용한 고속대량 시퀀싱에 바로 사용되었다. 제1 라운드의 PCR은 바코드와 시퀀싱 프라이머를 PCR 생성물에 도입하였다.
제2 라운드 PCR에서 공통 사용 프라이머로 지수기(exponential phase)의 증폭에 도달되었고, 따라서, 표적 면역 레퍼토리는, 추가의 증폭 바이어스를 도입하는 일 없이, 균일하게 반정량적으로 증폭되었다.
유방암 지표의 확인
유방암 환자로부터의 103개와 대조군으로부터의 110개를 포함하여 총 213개 샘플을 수집하였다. 213개 샘플로부터 총 14,666,172개 CDR3이 확인되었으며, 각 샘플로부터의 CDR3은 평균 68,855개였다. 213개 샘플로부터 8,301,648개의 독특한 CDR3이 확인되었다. 프라이빗 CDR3을 제거한 후, 회사 웹사이트를 통해 입수 가능한 iRepertoire(미국 앨라배마주 헌츠빌 소재) 소프트웨어(예를 들어, CDR3 알지브라)를 이용하여, 총 98,076개의 퍼블릭(즉, 적어도 두 대상체가 공유함) 및 도미넌트(즉, 각 샘플에서 상위 5,000 CDR3 내에 순위를 차지함) CDR3을 213개 샘플로부터 확인하였다. 213개 샘플로부터 총 287,198,206개의 포지티브 링클릿이 생성되었고, 각 샘플로부터의 평균은 1,003,236개 링클릿이었다. 프라이빗 링클릿을 제거한 후, 적어도 1명의 다른 사람에 의해 공유되는 16,921,605개 링클릿이 남았다. 각각의 공유된 링클릿에 대해, 환자 간에 우선적으로 공유되는 것들을 찾기 위해 p 값을 구하였다. p < 0.05로, 총 117,069개의 링클릿이 유의 링클릿으로서 확인되어, 질환의 "지표"를 제공하였다. 총 6,171개의 CDR3이 117,069개 질환 지표 링클릿에 기여하였다. 600 유의 링클릿의 컷오프 값을 이용할 때, 유방암의 95%를 진단할 수 있었고, 특이성은 93.6%였다. 188개의 비유방암 샘플을 조사하였을 때, 3개 샘플만이 위양성이어서(600 초과의 DSL을 가짐), 98.4%의 특이성을 제공하였다.
본 출원에 개시된 방법은 시그널을 증가시키고 백그라운드를 감소시켜서, 종래의 방법을 이용해서는 불가능한, 질환 지표를 만드는 데 이용될 수 있는 공유된 CDR3을 확인할 수 있도록 한다. 그 결과, 본 출원에 개시된 방법은 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 및 감염성 질환을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 다양한 질환들에 대한 진단 검사의 개발을 가능하게 한다는 이점을 갖는다.
본 출원은 다양한 간행물을 참조하고 있다. 이들 간행물의 개시내용은 그 전체가 본 출원이 속하는 기술분야의 선행기술을 더 충분히 설명하기 위해 본 출원에 참조에 의해 포함된다. 개시된 참고문헌들은 또한 그 참고문헌이 종속된 문장에서 언급되어 있는 그 문헌들 내에 포함된 자료를 인용함으로써 본 출원에 개별적이고 구체적으로 포함된다.
본 출원에 기재된 방법론과 다양한 실시형태들은 예시적인 것이다. 본 출원에 기재된 방법론의 다른 다양한 실시형태들도 가능하다.
Claims (8)
- 환자 그룹 및 대조군 그룹의 복수의 대상체 각각으로부터 샘플을 수집하는 단계로서, 상기 환자 그룹은 동일한 질환을 갖는 대상체를 포함하고, 상기 대조군 그룹은 건강한 대상체를 포함하는 것인 단계;
두 그룹 각각에서 각각의 대상체의 면역 레퍼토리를 증폭시키고 시퀀싱하여, 샘플 중에 존재하는 각각의 독특한 CDR3 서열을 확인하고 각각의 독특한 CDR3 서열의 발생 빈도를 결정하는 단계;
대조군 그룹과 환자 그룹 각각에서 적어도 두 대상체가 공유하는 CDR3 서열을 확인하는 단계;
CDR3 서열을 발생 빈도 순으로 순위화하는 단계;
각각의 그룹으로부터 링클릿(Linklet)을 확인하는 단계; 및
환자 그룹과 통계적으로 유의적인 수준으로 연관되어 있는 링클릿을 확인하여, 질환 지표(disease signature)를 제공하는 단계
를 포함하는, 특정 질환에 대한 진단 검사를 개발하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 샘플이 혈액인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 샘플이 조직인 방법.
- 제1항에 있어서, 대조군 그룹과 환자 그룹 각각에서 적어도 두 대상체가 공유하는 약 1,000개 이상의 CDR3 서열을 확인하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 각각의 그룹으로부터 약 106개 이상의 링클릿을 확인하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 질환 지표와 연관된 최소수의 링클릿을 진단수(diagnostic number)로 설정하고, 그 수 이상의 링클릿이 대상체의 혈액 샘플에서 확인될 경우, 그 대상체를 질환을 갖는 것으로 진단하는 것인 방법.
- 제6항에 있어서, 진단수가 약 500 이상인 방법.
- 환자 그룹 및 대조군 그룹의 복수의 대상체 각각으로부터 혈액 샘플을 수집하는 단계로서, 상기 환자 그룹은 동일한 질환을 갖는 대상체를 포함하고, 상기 대조군 그룹은 건강하다고 분류된 대상체를 포함하는 것인 단계;
두 그룹 각각에서 각각의 대상체의 면역 레퍼토리를 증폭시키고 시퀀싱하여, 혈액 샘플 중에 존재하는 각각의 독특한 CDR3 서열을 확인하고 각각의 독특한 CDR3 서열의 발생 빈도를 결정하는 단계;
대조군 그룹과 환자 그룹 각각에서 적어도 두 대상체가 공유하는 약 1,000개 이상의 CDR3 서열을 확인하는 단계;
약 1,000개 이상의 CDR3 서열을 발생 빈도 순으로 순위화하는 단계;
각각의 그룹으로부터 약 106개 이상의 링클릿을 확인하는 단계; 및
환자 그룹과 통계적으로 유의적인 수준으로 연관되어 있는 링클릿을 확인하여, 질환 지표를 제공하는 단계
를 포함하는, 특정 질환에 대한 진단 검사를 개발하는 방법으로서,
질환 지표와 연관된 최소수의 링클릿을 진단수로 설정하고, 그 수 이상의 링클릿이 대상체의 혈액 샘플에서 확인될 경우, 그 대상체를 질환을 갖는 것으로 진단하는 것인 특정 질환에 대한 진단 검사를 개발하는 방법.
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