CN107338306A - 一种用于GPC1mRNA表达检测的试剂盒 - Google Patents

一种用于GPC1mRNA表达检测的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种能快速、简便、敏感、特异的检测GPC1 mRNA表达量的试剂盒，采用了特异的GPC1基因特异探针和引物，以及内参基因GADPH特异探针和引物，结合荧光PCR检测技术可以高灵敏的检测血液外泌体或肿瘤组织中GPC1 mRNA的表达；使用特异性探针对定量分子进行识别，具有高准确性，特异性好，假阳性低；操作简单安全，检测廉价，可以大规模推广；检测速度快，检测过程大约需要2小时就可完成。

Description

一种用于GPC1mRNA表达检测的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于GPC1 mRNA表达的检测试剂盒。
背景技术
胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90%为起源于腺管上皮的导管腺癌。其发病率和死亡率近年来明显上升。5年生存率<1%，是预后最差的恶性肿瘤之一。手术是惟一可能根治的方法，但因胰腺癌的早期诊断困难，手术切除率低，术后五年生存率也低。因此，针对胰腺癌的治疗，能及时发现早期生物标记对治愈肺腺癌和提高治疗效果具有非常重要的意义。
GPC是一类由蛋白质、糖和脂质组成的复杂的复合物，属硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，在细胞的识别、黏附和生长中发挥重要的作用。其家族有GPC1～GPC6六个成员，都是通过糖基-磷脂酞基肌醇(Gp1)锚定在细胞膜上。家族中的GPC-1与胰腺癌的发生发展密切相关。Kleef等研究显示，GPC-1在正常胰腺组织和慢性胰腺炎组织中不表达或呈低表达，而在胰腺癌细胞以及邻近的成纤维细胞中呈高表达。Duan等通过免疫组化方法对62例胰腺癌组织研究发现GPC-1能促进胰腺癌神经导管浸润。
2015年，根据德克萨斯大学MD安德森癌症中心的一项研究表明，存在于癌症外泌体（exosomes）上的GPC1基因编码蛋白，或许可以作为一种潜在非侵入性诊断和筛查工具的组成部分，用来检测有可能尚处于适合手术治疗阶段的早期胰腺癌。这项研究工作发布在6月24日的《自然》（Nature）杂志上。
外泌体（exosomes）是一种直径在40-100nm的圆形单层膜性小囊泡，可由机体多种类型细胞释放，并广泛分布于唾液、血浆、乳汁、尿液等体液当中。外泌体含有多种蛋白、mRNAs、microRNAs、信号分子等，能够反映来源细胞的许多生物学性状。目前，关于外泌体的研究主要集中在免疫学和肿瘤学方面。MD安德森癌症中心从胰腺癌患者血液中分离出富含GPC1的循环外泌体—GPC1+crExos，并对其进行了监测。可以从腺癌患者的少量血清中检测到了GPC1+crExos，这一检测绝对的特异和敏感，而且能区分慢性胰腺炎患者与早期和晚期胰腺癌患者。研究还表明，在手术切除肿瘤后患者体内的GPC1+crExos水平显著下降。
相比常用的CA 19-9生物标志物，GPC1+crExos可能是一种更可靠的筛查工具。研究发现，在胰腺癌小鼠模型还未显示出MRI可以检测到的胰腺疾病迹象之时，GPC1+crExos就检测到了胰腺癌的可能性。
虽然GPC1表达的临床意义越来越显现，GPC1基因表达水平的检测适应了胰腺癌早期诊断和筛查的需求，对胰腺癌的早发现早治疗具有重要指导意义。但是，目前还没有可以快速便捷、经济实效的检测GPC1表达的试剂盒。基于上述研究，本发明利用GPC1 mRNA表达水平诊断胰腺癌的早期筛查。
发明内容
本发明的目的：提供一种能快速、简便、敏感、特异的检测GPC1 mRNA表达量的试剂盒，采用了特异的GPC1基因特异探针和引物，以及内参基因GADPH特异探针和引物，结合荧光PCR检测技术可以高灵敏的检测血液外泌体或肿瘤组织中GPC1 mRNA的表达；使用特异性探针对定量分子进行识别，具有高准确性，特异性好，假阳性低；操作简单安全，检测廉价，可以大规模推广；检测速度快，检测过程大约需要2小时就可完成。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种用于GPC1 mRNA表达检测的引物包括特异性反转录引物、Q-PCR特异性引物和探针。
所述特异性反转录引物包括如下序列：
GPC1RT:5’GAGCACATTTCGGCAATAGTCAG3’
GADPH反转录：5’ATACGACCAAATCCGTTGACT3’
所述Q-PCR特异性引物如下序列：
GPC1F: 5’GTCCGGAAAGTGGCTCAGGT33’
GPC1R:5’CTCCCAGGCAGTGAGCACAG33’
GAPDHF:5’CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC3’
GAPDHR:5’ATGGTGTCTGAGCGATGTGG3’
所述探针包括如下序列：
GPC1taqman:5’-FAM-CTCGAGAGCTGTCATGAAG-MGB-3’
GAPDHTaqman:5’CGTCGCCAGCCGA3’
一种用于GPC1 mRNA表达检测的试剂盒，通过所述的检测试剂盒提取RNA样本，并在RT-PCR反应体系中进行RT-PCR反应，所述的RT-PCR反应体系如下：
10XPCR Buffer 稀释为1X
模板 2uL
各引物 200-400 nM
各探针 100-400 nM
热启动Taq酶 1U
dNTP 0.5mM
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL。
一种用于GPC1 mRNA表达检测的试剂盒，其中，所述的PCR反应的条件如下。
一种用于GPC1 mRNA表达检测的试剂盒，其中，所述的DNA样本来自于新鲜血液样本。
一种用于GPC1 mRNA表达检测的试剂盒，其中，所述的血浆样本的重量为10ml。
本发明检测GPC1 mRNA表达检测，由于以血浆作为检测样本，解决了临床的肿瘤患者难于获取组织样本的现状；通过检测GPC mRNA的表达情况，比检测CPC1蛋白检测更为灵敏，提高了检测的灵敏度，降低了非专一性结合，使得临床检测结果更好判读。
具体实施方式
以下进一步说明本发明的实施例。
一种用于GPC mRNA表达检测的引物、探针，包括GPC1和GAPDH反转录引物，GPC1检测引物与探针，所述的GPC1和GAPDH引物与探针具体为：
所述特异性反转录引物包括如下序列：
GPC1RT:5’GAGCACATTTCGGCAATAGTCAG3’
GADPH反转录：5’ATACGACCAAATCCGTTGACT3’
所述Q-PCR特异性引物如下序列：
GPC1F: 5’GTCCGGAAAGTGGCTCAGGT 3’
GPC1R:5’CTCCCAGGCAGTGAGCACAG 3’
GAPDHF:5’CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC 3’
GAPDHR:5’ATGGTGTCTGAGCGATGTGG 3’
所述探针包括如下序列：
GPC1taqman:5’-FAM-CTCGAGAGCTGTCATGAAG-MGB-3’
GAPDHTaqman:5’CGTCGCCAGCCGA3’
一种用于GPC1mRNA表达检测的检测试剂盒的检测方法，该方法至少包括如下步骤：
步骤1：根据COSMIC数据公布的人类GPC1和GAPDH基因的基因序列，针对GPC1和GAPDH基因来设计引物和探针。通过GPC1和GAPDH特异性引物和探针体系优化，实现高灵敏和特异检测。
针对选定的GPC1和GAPDH序列，应用Premier 6.0引物设计软件设计多对特异引物和探针。
步骤2：提取检测样本的RNA，所述的检测样本包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织和胸腔液。
步骤3：配制实时荧光PCR扩增反应体系。
步骤4：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
步骤5：实验结束后进行分析和判定。
在所述的步骤2中，还包括如下分步骤：
步骤2.1：取约1×1 cm2的各肺癌样本切片（共约4-5片切片）置于离心管（自备）中，加入1ml二甲苯，盖紧管盖，涡旋震荡10秒。
步骤2.2：12，000 rpm（～13，400×g）离心2分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃沉。
步骤2.3：加入1ml无水乙醇，涡旋震荡混匀；12，000 rpm离心2分钟，弃上清，注意不要吸弃沉淀。
步骤2.4：打开管盖，室温或最高至37°C孵育10分钟，直至无乙醇残留。
步骤2.5：加入150μl Buffer PKD，重悬沉淀；加入10 μl Proteinase K，涡旋震荡混匀。
步骤2.6：56℃孵育15分钟，直至样品完全溶解；80℃孵育15分钟；短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
步骤2.7：加入320μl Buffer RBC，涡旋震荡彻底混匀。
步骤2.8：将步骤2.7中所得到的溶液全部加入到已装入收集管（Collection Tube2 ml）的过滤柱（DNA Remover Column）中；10，000 rpm离心1分钟，收集滤液。
步骤2.9：在步骤2.8得到的滤液中，加入720μl无水乙醇，涡旋震荡彻底混匀。
步骤2.10：将步骤2.9中所得的溶液全部加入到已装入收集管（Collection Tube2 ml）的吸附柱（Spin Column RS）中；10，000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
步骤2.11：向吸附柱中加入500μl Buffer RW2，10，000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
步骤2.12：12，000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液；将吸附柱置于室温数分钟以彻底晾干。
步骤2.13：将吸附柱置于一个新的无RNase离心管（Collection Tube 1.5 ml）中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-50 μl RNase-Free Water，室温放置2-5分钟，10，000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，准备后续实验。
在所述的步骤2.13中，所述的逆转录PCR反应体系如下：
10XPCR Buffer 稀释为1X
模板 2uL
各引物 200-400 nM
各探针 100-400 nM
热启动Taq酶 1U
dNTP 0.5mM
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL。
在所述的步骤3中，所述的PCR扩增反应体系如下：
PCR扩增反应体系如下：
10XPCR Buffer 稀释为1X
dNTP 0.2mM
模板 2uL
各引物 200-400 nM
热启动Taq酶 1U
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL。
所述的PCR反应的条件如下：
荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
步骤4：分析图像后调节Baseline的Start值、End值和阈值线，判定结果。
反应结束后，仪器自动保存结果，分析图像后调节Baseline的Start值、End值（可自行调节，Start值可以在3-10之间，End值位于15-20之间，调整阴性质控品的扩增曲线使其平直或低于阈值线）和阈值线（Threshold值，可手动调整至baseline之上）。
Ct值及△Ct值的确定：用户根据实际情况确定各反应管扩展曲线升起的拐点处，得到其Ct值。△Ct=GPC1孔FAM荧光Ct值与参照孔Ct值的差值。检测孔Ct值是指样本检测孔对应的Ct值；参照孔Ct值是指样本GAPDH对应的Ct值。
结果判读如下：样本GPC1有S型曲线且△ct值>15时，GPC1弱表达；10≤△ct≤15时，GPC1中表达；△ct值≤10时，GPC1强表达。
所述的RNA样本包括新鲜肿瘤组织或新鲜病理组织或石蜡包埋组织或新鲜血浆。
取样的所述的GPC1样本为1克左右。
在所述的步骤5中，还包括如下分步骤：
步骤5.1：运行无模板对照（NTC）时，FAM信号无曲线升起，说明实验无污染存在，可以继续分析实验情况。
步骤5.2：运行阳性质控品分析，所有阳性质控的Ct值≤30.0，说明实验体系正常，可以继续分析实验结果；其Ct值也可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。
步骤5.3：运行MIX5（ref）的Ct值计算，在FAM通道，如果Ct值≤42.0，可以继续分析；如果Ct值>42.0，则说明样本RNA降解严重，不适合实验需要。
步骤5.4：有效扩增曲线的定义及要求：典型扩增曲线具有三种典型时期，早期背景扩增期、中期指数扩增期（升高）和晚起的平台期，曲线整体形状呈S型。有效扩增曲线至少需要早期背景扩增期和中期指数扩增，曲线呈正常S型扩增趋势，方可计算曲线Ct值；其余曲线视为无效曲线，不予计算。
步骤5.5：在FAM通道中运行Ct的计算，根据每个位点的Ct值及有无扩增曲线，判定对应位点情况，具体结果判定结果为：
结果判读如下：样本GPC1有S型曲线且△ct值>15时，GPC1弱表达；10≤△ct≤15时，GPC1中表达；△ct值≤10时，GPC1强表达。
所述的mRNA反转录cDNA的操作方法，包括如下步骤：
步骤1：取逆转录反应混合液13µL，super RT逆转录酶1µl，加入无菌离心管中，混匀。
步骤2：加入待测样品RNA 6µL，RNA总量在0.1～5µg范围内至20µl。
步骤3：42°保温1个小时，85°C孵育5分钟；反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
步骤4：逆转录产物可直接用于后续PCR反应和荧光定量PCR反应。
实施例1：
利用本发明体系检测质粒，实验用质粒模板（含GPC1基因），利用上述荧光PCR检测GPC1基因表达的方法如下：
（1）质粒的处理与提取：
质粒的提取采用TIANGEN（HighPure Plasmid kid，DP116）的质粒提取试剂盒进行提取，具体提取操作步骤按试剂盒说明操作。所提DNA溶于Tris-HCl (10mM,pH 8.0), 经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-HCl (10mM,pH 8.0)溶液调整DNA浓度到20ng/ul作为稀释母液。
根据公式C拷贝浓度=（C质量浓度X6.02X1023）/MWDNA稀释野生型质粒为106个拷贝数/微升。
(2)建立PCR扩增反应体系：
将上述所得cDNA模板，用作实时荧光PCR扩增的模板，按照如下扩增体系进行PCR扩增
10XPCR Buffer 稀释为1X
dNTP 0.2mM
模板 2uL
各引物 200-400 nM
各探针 100-400 nM
热启动Taq酶 1U
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL。
实时PCR反应条件如下：
荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
实验结束以后，按以下步骤进行分析、判定：
1、运行无模板对照（NTC）时，FAM信号无曲线升起，说明实验无污染存在，可以继续分析实验情况。
2、运行阳性质控品分析，所有阳性质控的Ct值≤30.0，说明实验体系正常，可以继续分析实验结果；其Ct值也可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。
3、运行GAPDH的Ct值计算，在FAM通道，如果Ct值≤42.0，可以继续分析；如果Ct值>42.0,则说明样本RNA降解严重，不适合实验需要。
4、有效扩增曲线的定义及要求：典型扩增曲线具有三种典型时期，早期背景扩增期、中期指数扩增期（升高）和晚起的平台期，曲线整体形状呈S型。有效扩增曲线至少需要早期背景扩增期和中期指数扩增，曲线呈正常S型扩增趋势，方可计算曲线Ct值；其余曲线视为无效曲线，不予计算。
5、在FAM通道中运行Ct的计算，根据每个位点的Ct值及有无扩增曲线，判定对应位点情况，具体结果判定如下：样本GPC1有S型曲线且△ct值>15时，GPC1弱表达；10≤△ct≤15时，GPC1中表达；△ct值≤10时，GPC1强表达。
灵敏度分析：取GPC1基因质粒经定量后浓度为1000个拷贝的样品DNA，进行10倍稀释，然后分别对3个浓度进行检测，每次反应加入5µL DNA.结果表明本发明的荧光PCR方法的灵敏度高，10拷贝DNA基因即可检出。
重复性试验：每个反应分别加入质粒DNA 1000拷贝、100拷贝，重复10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值相差不到0.5个循环。
检测结果表明，本发明的检测体系可以准确检测质粒GPC1基因表达，检测的灵敏度可达到5-10拷贝。
实施例2：
运用本发明检测临床样本，取送我公司待检测的临床胰腺癌石蜡包埋组织样本118例，男性59例，女性59例，平均年龄为55岁，中位年龄47岁。利用本发明特异引物和探针荧光PCR体系检测118例临床样本的GPC1的基因表达如下：
(1)样本处理与RNA的提取
a．取约1×1 cm2的各胰腺癌样本切片（共约4-5片切片）置于离心管（自备）中，加入1ml二甲苯，盖紧管盖，涡旋震荡10秒。
b．12，000 rpm（～13,400×g）离心2分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃沉。
c．加入1ml无水乙醇，涡旋震荡混匀。12，000 rpm离心2分钟，弃上清，注意不要吸弃沉淀。
d．打开管盖，室温或最高至37°C孵育10分钟，直至无乙醇残留。
e．加入150μl Buffer PKD，重悬沉淀；加入10μl Proteinase K，涡旋震荡混匀。
f．56℃孵育15分钟，直至样品完全溶解。80℃孵育15分钟。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
g．加入320μl Buffer RBC，涡旋震荡彻底混匀。
h.将步骤g中所得到的溶液全部加入到已装入收集管（Collection Tube 2 ml）的过滤柱（DNA Remover Column）中。10，000 rpm离心1分钟，收集滤液。
i.在步骤h得到的滤液中，加入720μl无水乙醇，涡旋震荡彻底混匀。
j.将步骤i中所得的溶液全部加入到已装入收集管（Collection Tube 2 ml）的吸附柱（Spin Column RS）中。10，000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
k.向吸附柱中加入500μl Buffer RW2，10，000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
l.12，000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟以彻底晾干。
m.将吸附柱置于一个新的无RNase离心管（Collection Tube 1.5 ml）中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-50 μl RNase-Free Water，室温放置2-5分钟，10，000 rpm离心1分钟，收集RNA溶液，准备后续实验。
(2)建立PCR扩增反应体系
将所提上述RNA溶于0.1%DEPC水中，经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度OD260/OD280为1.9-2.1，并读其含量。取0.1～5µg的RNA A作为其c DNA合成的模板，采用康为世纪的RNA逆转录试剂盒合成cDNA，cDNA合成体系如下：
5×RT buffer 4µL
引物终浓度 200nM
dNTP 1mM
super RT 200U
RNA 6µL
补DEPC水至 20µL。
应用上述反转录体系按如下步骤进行逆转录。
(a)取逆转录反应混合液13µL, super RT逆转录酶1µL,加入无菌离心管中，混匀。
(b)加入待测样品RNA 6µL,RNA总量在 0.1～5µg范围内至20µL.
（c）42°C保温1个小时
(d)85°C保温5分钟后冰上冷却，得到cDNA 模板
将上述所得cDNA模板，用作实时荧光PCR扩增的模板，按照如下扩增体系进行PCR扩增：
10XPCR Buffer 稀释为1X
dNTP 0.2mM
模板 2uL
各引物 200-400 nM
各探针 100-400 nM
热启动Taq酶 1U
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL。
实时PCR反应条件如下：
荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
实验结束以后，按以下步骤进行分析、判定：
1、运行无模板对照（NTC）时，FAM信号无曲线升起，说明实验无污染存在，可以继续分析实验情况。
2、运行阳性质控品分析，所有阳性质控的Ct值≤30.0，说明实验体系正常，可以继续分析实验结果；其Ct值也可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。
3、运行GAPDH的Ct值计算，在FAM通道，如果Ct值≤42.0，可以继续分析；如果Ct值>42.0,则说明样本RNA降解严重，不适合实验需要。
4、有效扩增曲线的定义及要求：典型扩增曲线具有三种典型时期，早期背景扩增期、中期指数扩增期（升高）和晚起的平台期，曲线整体形状呈S型。有效扩增曲线至少需要早期背景扩增期和中期指数扩增，曲线呈正常S型扩增趋势，方可计算曲线Ct值；其余曲线视为无效曲线，不予计算。
5、在FAM通道中运行Ct的计算，根据每个位点的Ct值及有无扩增曲线，判定对应位点情况，具体结果判定结果为：
结果判读如下：样本GPC1有S型曲线且△ct值>15时，GPC1弱表达；10≤△ct≤15时，GPC1中表达；△ct值≤10时，GPC1强表达。
检测结果表明所检测118例胰腺癌样本中有15例GPC1高表达，高表达率为12.7%，同时对上述所有样本进行免疫组化检测对比，免疫组化检测结果表明>50%癌细胞表达的比例为14例患者，表明此方法检测与免疫组化有非常的一致性。
附表：临床样本检测结果比较：
综上所述，本发明采用了GPC1特异性探针和引物，可以检测肿瘤组织中GPC1的mRNA表达水平；创新性的利用RT-PCR的方法，跟管家基因GAPDH比较，通过 2-△△CT算法，得到GPC1的相对表达水平，提高了其灵敏度，大于传统的IHC方法；可以在血液中检测GPC1的表达；操作简单，检测廉价，可以大规模推广；检测速度快，检测过程大约需要2小时就可完成。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用附属在其他相关产品的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (4)

1.一种用于GPC1 mRNA表达检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括特异性反转录引物、Q-PCR特异性引物和探针，
所述特异性反转录引物包括如下序列：
GPC1RT:5’GAGCACATTTCGGCAATAGTCAG3’
GADPH反转录：5’ATACGACCAAATCCGTTGACT3’
所述Q-PCR特异性引物如下序列：
GPC1F: 5’GTCCGGAAAGTGGCTCAGGT33’
GPC1R:5’CTCCCAGGCAGTGAGCACAG33’
GAPDHF:5’CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC3’
GAPDHR:5’ATGGTGTCTGAGCGATGTGG3’
所述探针包括如下序列：
GPC1taqman:5’-FAM-CTCGAGAGCTGTCATGAAG-MGB-3’
GAPDHTaqman:5’CGTCGCCAGCCGA3’。
2. 根据权利要求1所述的一种用于GPC1 mRNA表达检测的试剂盒，其特征在于，通过所述的检测试剂盒提取RNA样本，并在RT-PCR反应体系中进行RT-PCR反应，所述的RT-PCR反应体系如下：
10XPCR Buffer 稀释为1X
模板 2uL
各引物 200-400 nM
各探针 100-400 nM
热启动Taq酶 1U
dNTP 0.5mM
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL。
3.根据权利要求1所述的一种用于GPC1 mRNA表达检测的试剂盒，其特征在于，所述的DNA样本来自于新鲜血液样本。
4. 根据权利要求1所述的一种用于GPC1 mRNA表达检测的试剂盒，其特征在于，所述的血浆样本的重量为10ml。
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