CN107334801A - 矢车菊花序活性部位作为制备5α还原酶抑制剂药物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及5α还原酶抑制剂技术领域,是一种矢车菊花序活性部位作为制备5α还原酶抑制剂药物的应用,本发明通过现代分离技术和活性研究方法,进一步精制矢车菊花序活性部位,且将矢车菊花序活性部位对5α还原酶活性的抑制方面,具有较好的抑制作用,同时本发明的矢车菊花序活性部位为纯绿色植物提取物,用于5α还原酶活性的抑制方面,安全无毒、作用显著。
Description
技术领域
本发明涉及5α还原酶抑制剂技术领域,是一种矢车菊花序活性部位作为制备5α还原酶抑制剂药物的应用。
背景技术
矢车菊(Centaurea cyanus L .)系矢车菊属( Centaurea L .)植物,我国新疆、青海、甘肃、陕西、河北、山东、江苏、湖北、湖北、广东及西藏等各地公园、花园及校园普遍栽培,供观赏。在新疆伊犁地区已大规模种植。在欧洲为传统植物药,常用于治疗眼部炎症,主要活性成分为其多糖部分;在化妆品行业用矢车菊提取物作为护发成分。
α-还原酶的同工酶有I型和II型,有研究发现鼠的非雄性目标组织和卵巢中主要含有I型酶及其mRNA,特别是肝脏中只产生I型酶,且雌性鼠肝脏中I型酶活性比雄性高10~20倍。II型酶主要分布于雄性生殖组织,如睾丸、输精管等,正常前列腺的间质细胞和基底上皮细胞,精囊的间质细胞,附睾的上皮细胞产生II型酶,而增生的前列腺和前列腺肿瘤仅由间质细胞合成II型酶。
脂溢性脱发,也被称为雄激素源性脱发或者男性型脱发,它与女性型脱发的特点是油腻的头发、头皮屑、痒、额头区域渐进性脱发形成斑秃。也许它不是一种威胁生命的混乱,但是它对个人的外表、自信心、心理健康和生活质量造成很大的影响。5α还原酶将头发毛囊中的睾酮转化为二轻睾酮导致脂溢性脱发的病理过程中扮演了重要的角色,虽然雄激素通过同种的雄激素受体调节它们的活性,二氢睾酮的活性仍然较睾酮高5倍。雄激素受体属于细胞核受体亚族,功能是作为转录因子。依据其配基,雄激素受体经历一个结构变化,转运至细胞核,与目标基因的特定DNA序列结合,调节基因的表达,表现出促进头发生长和抑制头发生长。因此,抑制5α还原酶活性是一个研究脂溢性脱发的比较好的目标。实际上,近几年许多甾体或者非甾体的5α还原酶抑制剂已经被合成。作为一种5α还原酶抑制剂的非那雄胺,非那雄胺已经被用来治疗雄激素相关的疾病,并取得显著的效果。然而,这些合成的抑制剂经常导致一些副作用,譬如勃起功能障碍、性功能异常、男性乳房发育、损害肌肉生长等等。
近几年,研究者致力于从天然植物中寻找新的、有效的、毒性更低的5α还原酶抑制剂用于治疗脂溢性脱发,这具有非凡的意义。目前对矢车菊提取物进行抑制5α还原酶活性的研究鲜见于文献报道;同时植物粗提物在使用过程中疗效不够稳定,效果不是非常突出,目前普遍采用西药非那雄胺作为抑制5α还原酶活性的的药物,其效果目前处于较好水平,但是西药副作用大。
发明内容
本发明提供了一种矢车菊花序活性部位作为制备5α还原酶抑制剂药物的应用,克服了上述现有技术之不足,其能有效解决目前对矢车菊提取物进行抑制5α还原酶活性的研究鲜见于文献报道以及植物粗提物在使用过程中疗效不够稳定、效果不是非常突出以及西药非那雄胺作为抑制5α还原酶活性的的药物副作用大的问题。
本发明的技术方案是通过以下措施来实现的:一种矢车菊花序活性部位作为制备5α还原酶抑制剂药物的应用。
下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进:
上述矢车菊花序活性部位按下述方法得到:采摘矢车菊的花,将矢车菊的花进行干燥至含水量低于20%,干燥后的矢车菊粉碎后进行醇提1至3次,每次醇提均用5倍至15倍量50%至100%浓度的乙醇溶液进行提取,合并提取液,得矢车菊提取液;
第二步,将提取液浓缩至提取液初始体积的1/6至1/3得到浓缩液Ⅰ;
第三步,将浓缩液Ⅰ采用大孔树脂柱进行第一步精制,先用2倍至5倍大孔树脂柱柱体积的纯水洗脱,洗脱液弃去,然后用3倍至4倍大孔树脂柱柱体积的60%至95%乙醇溶液进行洗脱得到洗脱液Ⅰ,将洗脱液Ⅰ浓缩至洗脱液Ⅰ原体积的10%至20%,将浓缩液Ⅱ进行干燥至含水量为6%至10%后得到物料A;
第四步,将物料A用甲醇溶解得到混合溶液Ⅰ,用1.5倍至2倍物料A重量的100目至400目的硅胶对混合溶液Ⅰ进行硅胶拌样并混匀后去除甲醇后得到料样,并将料样研磨至粒度≤200目;
第五步,取20倍至100倍物料A重量的100至400目硅胶装填于层析柱,层析柱径高比为1:5至1:10,将上一步所制备的料样均匀装填于层析柱上部;
第六步,先用2倍至3倍层析柱柱体积的低极性溶剂洗脱,再用低极性溶剂与甲醇的体积比为9:1至1:1的混合溶液Ⅱ洗脱得到洗脱液Ⅱ,将洗脱液Ⅱ减压浓缩至洗脱液Ⅱ原体积的10%至20%得到浓缩液Ⅲ,浓缩液Ⅲ挥干有机溶剂后即得矢车菊花序活性部位。
上述第二步中,将提取液浓缩得到浓缩液Ⅰ的方法为:采用常温加热浓缩,浓缩温度为60℃至95℃;或者,采用减压浓缩,浓缩温度为45℃至80℃、真空度不大于50mbar;或者,采用蒸发浓缩,浓缩温度设置为50℃至65℃,真空度26 mbar至150mbar。
上述第三步中,大孔树脂柱的型号为D101或AB-8或HPD100或HPD600或XDA-6或ADS17或LX27或LX28。
上述第四步中,采用水浴、自然通风、减压发方式去除甲醇。
上述第一步中的乙醇溶液的浓度为80%;或/和,第六步中的低极性溶剂为二氯甲烷或氯仿。
上述第六步中的低极性溶剂为二氯甲烷或氯仿。
本发明通过现代分离技术和活性研究方法,进一步精制矢车菊花序活性部位,且将矢车菊花序活性部位对5α还原酶活性的抑制方面,具有较好的抑制作用,同时本发明的矢车菊花序活性部位为纯绿色植物提取物,用于5α还原酶活性的抑制方面,安全无毒、作用显著。
附图说明
附图1正常对照组的雌性大鼠的10×10倍镜下毛囊生长图。
附图2正常对照组的雄性大鼠的10×10倍镜下毛囊生长图。
附图3阳性对照组的雌性大鼠的10×10倍镜下毛囊生长图。
附图4阳性对照组的雄性大鼠的10×10倍镜下毛囊生长图。
附图5实验组的雌性大鼠的10×10倍镜下毛囊生长图。
附图6实验组的雄性大鼠的10×10倍镜下毛囊生长图。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制,可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明,均为现技术中公知公用的化学试剂和化学用品;本发明中的百分数如没有特殊说明,均为质量百分数;本发明中的水如没有特殊说明,为自来水或纯净水;本发明中的溶液若没有特殊说明,均为溶剂为水的水溶液,例如,盐酸溶液即为盐酸水溶液;本发明中的常温一般指15℃到25℃的温度,一般定义为25℃。
下面结合实施例对本发明作进一步描述:
实施例1,该矢车菊花序活性部位作为制备5α还原酶抑制剂药物的应用。本发明将矢车菊花序活性部位对5a还原酶活性的抑制作用,其相对于目前的西药非那雄胺相比,其活性抑制率大大提高,该矢车菊花序活性部位可以从现有技术中获得。
实施例2,作为实施例1的优化,矢车菊花序活性部位按下述方法得到:采摘矢车菊的花,将矢车菊的花进行干燥至含水量低于20%,干燥后的矢车菊粉碎后进行醇提1至3次,每次醇提均用5倍至15倍量50%至100%浓度的乙醇溶液进行提取,合并提取液,得矢车菊提取液;
第二步,将提取液浓缩至提取液初始体积的1/6至1/3得到浓缩液Ⅰ;
第三步,将浓缩液Ⅰ采用大孔树脂柱进行第一步精制,先用2倍至5倍大孔树脂柱柱体积的纯水洗脱,洗脱液弃去,然后用3倍至4倍大孔树脂柱柱体积的60%至95%乙醇溶液进行洗脱得到洗脱液Ⅰ,将洗脱液Ⅰ浓缩至洗脱液Ⅰ原体积的10%至20%,将浓缩液Ⅱ进行干燥至含水量为6%至10%后得到物料A;
第四步,将物料A用甲醇溶解得到混合溶液Ⅰ,用1.5倍至2倍物料A重量的100目至400目的硅胶对混合溶液Ⅰ进行硅胶拌样并混匀后去除甲醇后得到料样,并将料样研磨至粒度≤200目;
第五步,取20倍至100倍物料A重量的100至400目硅胶装填于层析柱,层析柱径高比为1:5至1:10,将上一步所制备的料样均匀装填于层析柱上部;
第六步,先用2倍至3倍层析柱柱体积的低极性溶剂洗脱,再用低极性溶剂与甲醇的体积比为9:1至1:1的混合溶液Ⅱ洗脱得到洗脱液Ⅱ,将洗脱液Ⅱ减压浓缩至洗脱液Ⅱ原体积的10%至20%得到浓缩液Ⅲ,浓缩液Ⅲ挥干有机溶剂后即得矢车菊花序活性部位。
将浓缩液Ⅱ进行大孔树脂柱层析洗脱,活性部位在树脂柱上的吸附量最大,可以有效的利用大孔树脂的吸附容量,单次洗脱,得率最高。
实施例3,作为实施例2的优化,第二步中,将提取液浓缩得到浓缩液Ⅰ的方法为:采用常温加热浓缩,浓缩温度为60℃至95℃;或者,采用减压浓缩,浓缩温度为45℃至80℃、真空度不大于50mbar;或者,采用蒸发浓缩,浓缩温度可以设置为50℃至65℃,真空度26 mbar至150mbar。
实施例4,作为实施例2和实施例3的优化,第三步中,大孔树脂柱的型号为D101或AB-8或HPD100或HPD600或XDA-6或ADS17或LX27或LX28。
实施例5,作为实施例2、实施例3和实施例4的优化,第四步中,采用水浴、自然通风、减压发方式去除甲醇。
实施例6,作为作为实施例2、实施例3、实施例4和实施例5的优化,上述第一步中的乙醇溶液的浓度为80%;或/和,第六步中的低极性溶剂为二氯甲烷或氯仿。矢车菊在用乙醇提取时优选的乙醇溶液的浓度为80%,此时可以尽可能的将有效成分提取出来,同时避免花絮中胶体、蛋白等大分子物质对提取效率的影响。
实施例7,作为作为实施例2、实施例3、实施例4、实施例5和实施例6第六步中的低极性溶剂为二氯甲烷或氯仿。
一、将根据本发明上述实施例得到的矢车菊花序活性部位进行抑制5α还原酶活性的测定:
1、原理:通过测定反应体系中反应前后睾酮的消耗量表征样品抑制5α还原酶的活性强弱。
、方法及结果:将根据本发明上述实施例得到的矢车菊花序活性部位(以下简称矢车菊)100mg溶解于l0mL75%的乙醇中,得浓度为10g/L的储备液。
根据文献资料及预试,将从睾酮提取的粗酶液(II型酶)用Tris缓冲液稀释2倍,将从肝脏中提取的粗酶液(I型酶)用Tris缓冲液稀释10倍,供试酶液(粗酶液(II型酶)和粗酶液(I型酶))的浓度分别为4.45mg/mL、3.76mg/mL。
建立如表1的反应体系:其中Tris-HCl缓冲液浓度为1mmol/L(附睾粗酶液pH5.5、肝脏粗酶液pH7.5)、NADPH浓度1mmol/L/、睾酮(T)浓度1mmol/L、非那雄胺2.5mg/mL,将矢车菊设置0.5mg/mL至10mg/mL的浓度梯度供试,其中,样品如表2所示。
建立反应体系进行反应后,测定每个反应体系中睾酮的含量,进而判断矢车菊对5α还原酶活性的抑制作用。
设置睾酮浓度梯度0.02、0.04、0.08、0.20mmol/L的浓度梯度,液相色谱方法建立睾酮标准曲线。色谱条件为Waters UPLC BEH Shiled RP18 1.7µm,100mm*2.1mm色谱柱,柱温30℃,流速0.2mL/min,甲醇/0.2%甲酸=65:35,242nm检测。
在0.02mmol/L至0.20mmol/L的范围内,睾酮浓度与峰面积之间成线性相关,且相关系数为1,相应的回归方程为Y=9535326.5725X-1274.8359,R2=1。
配制10g/L矢车菊储备液,将其稀释为10.0、0.5g/L的供试液,按照上述方法进行酶抑制活性测定,每样品3个平行。测定结果如表3所示,其中,表3中的抑制率=[(矢车菊-阳性对照)/阳性对照]*100%。
结果表明,由表3可见,根据本发明上述实施例得到的矢车菊花序活性部位对附睾II型5α还原酶、肝脏I型5α还原酶均有较好的抑制作用,且相对于阳性药非那雄胺,矢车菊花序活性部位对附睾II型5α还原酶活性的抑制率提高了34.4%至62.07%,矢车菊花序活性部位对肝脏Ⅰ型5α还原酶活性的抑制率提高了67.65%至73.7%。
二、将根据本发明上述实施例得到的矢车菊花序活性部位进行动物模型试验
2.1动物实验方法
试药:实验组用药:根据本发明上述实施例得到的矢车菊花序活性部位1g加5ml甘油;
阳性对照组用药:西药:二氢神经鞘氨醇(0.1%,m/m),该药为目前用于治疗毛发生长发面效果较好的最新药,普遍接受度较高;
健康Wistar大鼠28只,雌雄各半,普通级,体重(200±20)g;由新疆实验动物中心提供;
促毛发生长试验大鼠随机分2组,分别为实验组和阳性对照组,每组14只雌雄各半,在其背部先用手术剪剪毛后,再用理发器仔细将各区域杂毛去除干净(硫化钠脱毛效果好,但易损大鼠皮肤)。按如下方式给药:大鼠背部选定区域用医用棉棒适量蘸取药液涂于该区域,每日定时涂药1次,观察大鼠被毛生长情况,连续给药21d;3周后,每只大鼠各给药区域随机拔取一撮新生毛发,游标卡尺测量5根毛发的长度,取其平均值,作为该给药区域的大鼠毛发长度值(mm),结果见表4。再仔细将给药区域毛发全部剪下,置于培养皿中,万分之一电子天平称其重量,作为该给药区域的毛发重量值(mg),结果见表4;表4中,正常对照组为选取的各大鼠自身正常毛发。
大鼠去毛区皮肤组织中毛囊数的影响,将去毛后大鼠的各给药区域皮肤取下,用10%的中性甲醛固定3天,其中固定液更换3次,进行常规的组织脱水、石蜡包埋,切片,经H-E染色后,在光学显微镜下观察毛囊的数目和生长状况。每张标本随机选取5个视野,于10×10倍镜下计数毛囊数目,取其平均值,作为该给药组的毛囊数,结果见表5;表5中,正常对照组为选取的各大鼠自身正常区域皮肤;分别随机选取正常对照组、阳性对照组和实验组的雌性大鼠和雄性大鼠的标本各一,于10×10倍光学显微镜下观察毛囊的数目和生长状况,正常对照组的雌性大鼠的10×10倍镜下毛囊生长图如附图1所示、正常对照组的雄性大鼠的10×10倍镜下毛囊生长图如附图2所示、阳性对照组的雌性大鼠的10×10倍镜下毛囊生长图如附图3所示、阳性对照组的雄性大鼠的10×10倍镜下毛囊生长图如附图4所示、实验组的雌性大鼠的10×10倍镜下毛囊生长图如附图5所示、实验组的雄性大鼠的10×10倍镜下毛囊生长图如附图6所示。
数据处理及统计检验
本实验中所有计量资料均以均数±标准差(±s)表示。应用PEMS3.1统计软件包处理数据,两组间比较采用t检验。
结果
2.3.1促毛发生长毛发长度及重量检测结果(±s,n=10),实验结果见表4;
由表4可以看出,阳性对照组毛发长度雄性、雌性大鼠与自身正常对照相比,差异具有统计学意义(*P <0.05),实验组毛发长度雌性大鼠与自身正常对照相比,差异具有统计学意义(*P <0.05);实验组毛发长度雄性大鼠与自身正常对照相比,差异具有统计学意义(*P <0.05);阳性对照组雄性毛发长度及重量与矢车菊提取物相比,差异具有统计学意义(# P <0.01);阳性对照组雌性性毛发长度与矢车菊提取物相比,差异具有统计学意义(# P <0.01);表4中,虽然阳性对照组大鼠毛发长度和重量均优于实验组毛发长度和重量,但是由于阳性对照组的所选用的药为西药,西药为合成药,其毒副作用大,而本发明的矢车菊花序活性部位虽然效果没有阳性对照组的西药的效果好,但是相对于正常组来说,仍然具有较明显的效果,并且,本发明的矢车菊花序活性部位为纯绿色植物提取物,用于5a还原酶活性的抑制方面,安全无毒。
矢车菊提取物对大鼠毛囊数的影响,实验结果见表5;
实验结果显示西药组皮肤毛囊数与自身正常对照相比,差异具有统计学意义(*P <0.05),矢车菊提取物大鼠皮肤毛囊数与自身正常对照相比,差异具有统计学意义(*P <0.05);结合表5和附图1至附图6可以看出,虽然阳性对照组大鼠毛毛囊数均优于实验组大鼠毛毛囊数,但是由于阳性对照组的所选用的药为西药,西药为合成药,其毒副作用大,而本发明的矢车菊花序活性部位虽然效果没有阳性对照组的西药的效果好,但是相对于正常组来说,仍然具有较明显的效果,并且,本发明的矢车菊花序活性部位为纯绿色植物提取物,用于5a还原酶活性的抑制方面,安全无毒。
本发明通过现代分离技术和活性研究方法,进一步精制矢车菊花序活性部位,且将矢车菊花序活性部位对5α还原酶活性的抑制作用,虽然本发明相对于西药二氢神经鞘氨醇来说,效果没有其好,但是其相对于目前的西药非那雄胺相比,其活性抑制率大大提高,仍然说明本发明的矢车菊花序活性部位对5a还原酶活性具有较好的抑制作用,同时本发明的矢车菊花序活性部位为纯绿色植物提取物,用于5α还原酶活性的抑制方面,安全无毒、作用显著。
以上技术特征构成了本发明的实施例,其具有较强的适应性和实施效果,可根据实际需要增减非必要的技术特征,来满足不同情况的需求。
Claims (10)
1.一种矢车菊花序活性部位作为制备5α还原酶抑制剂药物的应用。
2.根据权利要求1所述的矢车菊花序活性部位作为制备5α还原酶抑制剂药物的应用,其特征在于矢车菊花序活性部位按下述方法得到:采摘矢车菊的花,将矢车菊的花进行干燥至含水量低于20%,干燥后的矢车菊粉碎后进行醇提1至3次,每次醇提均用5倍至15倍量50%至100%浓度的乙醇溶液进行提取,合并提取液,得矢车菊提取液;
第二步,将提取液浓缩至提取液初始体积的1/6至1/3得到浓缩液Ⅰ;
第三步,将浓缩液Ⅰ采用大孔树脂柱进行第一步精制,先用2倍至5倍大孔树脂柱柱体积的纯水洗脱,洗脱液弃去,然后用3倍至4倍大孔树脂柱柱体积的60%至95%乙醇溶液进行洗脱得到洗脱液Ⅰ,将洗脱液Ⅰ浓缩至洗脱液Ⅰ原体积的10%至20%,得到浓缩液Ⅱ,将浓缩液Ⅱ进行干燥至含水量为6%至10%后得到物料A;
第四步,将物料A用甲醇溶解得到混合溶液Ⅰ,用1.5倍至2倍物料A重量的100目至400目的硅胶对混合溶液Ⅰ进行硅胶拌样并混匀后去除甲醇后得到料样,并将料样研磨至粒度≤200目;
第五步,取20倍至100倍物料A重量的100至400目硅胶装填于层析柱,层析柱径高比为1:5至1:10,将上一步所制备的料样均匀装填于层析柱上部;
第六步,先用2倍至3倍层析柱柱体积的低极性溶剂洗脱,再用低极性溶剂与甲醇的体积比为9:1至1:1的混合溶液Ⅱ洗脱得到洗脱液Ⅱ,将洗脱液Ⅱ减压浓缩至洗脱液Ⅱ原体积的10%至20%得到浓缩液Ⅲ,浓缩液Ⅲ挥干有机溶剂后即得矢车菊花序活性部位。
3.根据权利要求2所述的矢车菊花序活性部位作为制备5α还原酶抑制剂药物的应用,其特征在于第二步中,将提取液浓缩得到浓缩液Ⅰ的方法为:采用常温加热浓缩,浓缩温度为60℃至95℃;或者,采用减压浓缩,浓缩温度为45℃至80℃、真空度不大于50mbar;或者,采用蒸发浓缩,浓缩温度设置为50℃至65℃,真空度26 mbar至150mbar。
4.根据权利要求2或3所述的矢车菊花序活性部位作为制备5α还原酶抑制剂药物的应用,其特征在于第三步中,大孔树脂柱的型号为D101或AB-8或HPD100或HPD600或XDA-6或ADS17或LX27或LX28。
5.根据权利要求2或3所述的矢车菊花序活性部位作为制备5α还原酶抑制剂药物的应用,其特征在于第四步中,采用水浴、自然通风、减压方式去除甲醇。
6.根据权利要求4所述的矢车菊花序活性部位作为制备5α还原酶抑制剂药物的应用,其特征在于第四步中,采用水浴、自然通风、减压方式去除甲醇。
7.根据权利要求2或3所述的矢车菊花序活性部位作为制备5α还原酶抑制剂药物的应用,其特征在于第一步中的乙醇溶液的浓度为80%;或/和,第六步中的低极性溶剂为二氯甲烷或氯仿。
8.根据权利要求4所述的矢车菊花序活性部位作为制备5α还原酶抑制剂药物的应用,其特征在于第六步中的低极性溶剂为二氯甲烷或氯仿。
9.根据权利要求5所述的矢车菊花序活性部位作为制备5α还原酶抑制剂药物的应用,其特征在于第六步中的低极性溶剂为二氯甲烷或氯仿。
10.根据权利要求6所述的矢车菊花序活性部位作为制备5α还原酶抑制剂药物的应用,其特征在于第六步中的低极性溶剂为二氯甲烷或氯仿。
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CN (1) | CN107334801B (zh) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001163734A (ja) * | 1999-12-13 | 2001-06-19 | Lion Corp | 養育毛剤組成物 |
EP1090629B1 (fr) * | 1999-10-08 | 2004-08-04 | L'oreal | Association d'escine et de sulfate de dextran |
CN101717419A (zh) * | 2009-11-16 | 2010-06-02 | 大连大学 | 一种5-α还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷D及其制备方法与用途 |
JP5037038B2 (ja) * | 2005-09-16 | 2012-09-26 | 株式会社 資生堂 | 血管内皮増殖因子(vegf)発現促進剤 |
-
2016
- 2016-12-30 CN CN201611259742.1A patent/CN107334801B/zh active Active
Patent Citations (4)
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