CN104257678A - 一种用于治疗糖尿病心肌病的药物组合及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种治疗糖尿病心肌病的天然药物组合，该组合由莫诺苷和薯蓣皂苷组成，二者重量配比为1∶1～5∶1，最佳配比为2∶1。莫诺苷从山茱萸或忍冬藤中分离得到；薯蓣皂苷可从薯蓣中分离获得。经PHLC检测，二成分纯度≥98％。药理试验显示，本发明的药物组合在治疗糖尿病心肌病方面，与单一的莫诺苷或单一的薯蓣皂苷相比，疗效明显提高，具有显著性差异。本发明的药物组合可用于治疗糖尿病心肌病的各种制剂中。

Description

一种用于治疗糖尿病心肌病的药物组合及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于天然药物技术领域，涉及一种治疗糖尿病心肌病的天然药物组合，特别涉及一种由莫诺苷(morroniside)和薯蓣皂苷(dioscin)配合而成的药物组合及其制法和用途。
背景技术
糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病主要的心血管并发症。其指发生于糖尿病患者，但不能用高血压性心脏病、冠状动脉粥样硬化性心脏病、心脏瓣膜病及其它心脏病变来解释的特异性心肌疾病。DCM的特征性病理改变包括进行性心肌细胞凋亡及坏死，左心室心肌增生性肥厚和间质纤维化等。目前，DCM已成为糖尿病患者心功能衰竭及死亡的首要原因。
目前，临床上还没有针对性治疗糖尿病心肌病的天然药物。一般用降糖药代替，如二甲双胍、格列吡嗪等，多为西药，均有一定副作用，具肝肾功能损伤的患者不能服用。有文献报道了莫诺苷等环烯醚萜苷类可治疗糖尿病，但无防治糖尿病心肌病的药物组合出现，且对于薯蓣皂苷治疗糖尿病心肌病也无相关报道。
如今，糖尿病心肌病是导致糖尿病患者产生并发症死亡的主要原因，因此，研究开发一种防治糖尿病心肌病的特效药显得尤其重要和迫切。
发明内容
鉴于现有研究的不足，本发明的目的在于，通过对莫诺苷和薯蓣皂苷的理化性质及药效作用进行研究，提供一种天然药物组合，解决临床上无治疗糖尿病心肌病的特效药问题。
为了达到本发明的目的，发明人通过大量实验研究，获得如下技术方案：
一种治疗糖尿病心肌病药物组合，含有莫诺苷单体和薯蓣皂苷单体，所述组合中单体的重量配比为1∶1～5∶1，最佳配比为2∶1。
上述药物组合的制备方法的主要步骤为：(1)莫诺苷单体可从山茱萸(Cornus officinalisSieb.et Zucc.)或忍冬藤(Lonicerajaponica Thunb.)中提取分离得到。将山茱萸或忍冬藤药材，以70％乙醇提取，提取物经大孔树脂及反相硅胶柱分离，得莫诺苷单体。(2)薯蓣皂苷单体从薯蓣(Dioscorea opposite Thunb.)中分离得到。将薯蓣药材，用80％乙醇提取，提取物经大孔树脂及反相硅胶柱分离，得薯蓣皂苷单体。(3)将莫诺苷及薯蓣皂苷按2∶1的重量比配合均匀，即得本发明的药物组合。
上述药物组合，所述的大孔树脂为HPD-400或AB-8或其它类似树脂。
上述药物组合，所述的反相硅胶为YMC，ODS-AAG，50μm。
与目前研究现状相比，本发明涉及的治疗糖尿病心肌病的药物组合具有以下优点和显著进步：(1)首次将莫诺苷和薯蓣皂苷配合，研制成治疗糖尿病心肌病的天然药物组合，弥补了临床上用药的不足。(2)通过先进分离技术获得纯度大于98％的莫诺苷单体和薯蓣皂苷单体，二者成分结构明确，由此制备成的药物制剂，生物利用度高。(3)药效试验结果显示，本发明的药物组合在治疗糖尿病心肌病方面，与单一的莫诺苷或单一的薯蓣皂苷相比，疗效明显提高，具有显著性差异。(4)制备工艺相对简单，适合医药工业生产。
具体实施方式
以下为本发明涉及的治疗糖尿病心肌病药物组合的具体制备实例，旨在对本发明的技术方案作进一步描述，但本发明的保护范围并不局限于这些实施例。凡与本发明思路类同的改变或替代方法均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1治疗糖尿病心肌病药物组合物的制备
1.取山茱萸或忍冬藤药材500g，用6倍量70％乙醇回流提取1小时，过滤。药渣再加4倍量70％乙醇回流提取0.5小时，过滤。合并2次滤液，回收溶剂，浓缩至500ml。
2.将上述醇提物，上样于AB-8或HPD400型大孔树脂上，依次用6倍量水、10％乙醇、30％乙醇洗脱，收集合并10％及30％乙醇洗脱液；回收乙醇，浓缩至500ml。
3.把上述提取物上样于YMC ODS-AAG 50μm反相硅胶柱，以甲醇-水系统梯度洗脱，收集甲醇-水(9∶1)洗脱部位，收集液经冷冻干燥后重结晶，得莫诺苷单体(纯度≥98％)。
4.取薯蓣药材100g，用6倍量80％乙醇回流提取1小时，药渣再加4倍量80％乙醇回流提取1.5小时。合并2次滤液，浓缩至500ml。
5.将上述醇提物经AB-8或HPD400大孔树脂分离，收集合并50％、70％乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至500ml。
6.将上述浓缩物上样于YMC ODS-AAG 50μm反相硅胶柱，以甲醇-水系统梯度洗脱，收集甲醇-水(8∶2)洗脱部位，合并减压浓缩，经冷冻干燥后重结晶，得薯蓣皂苷单体(纯度≥98％)。
7.将上述莫诺苷单体及薯蓣皂苷单体按重量配比(2∶1)混合均匀，即得治疗糖尿病心肌病药物组合物。
实施例2治疗糖尿病心肌病药物组合物的制备
1.取山茱萸或忍冬藤药材1000g，用6倍量70％乙醇回流提取1小时，过滤。药渣再加4倍量70％乙醇回流提取0.5小时，过滤。合并2次滤液，回收溶剂，浓缩至1000ml。
2.将上述醇提物，上样于AB-8或HPD400型大孔树脂上，依次用6倍量水、10％乙醇、30％乙醇洗脱，收集合并10％及30％乙醇洗脱液；回收乙醇，浓缩至1000ml。
3.把上述提取物上样于YMC ODS-AAG 50μm反相硅胶柱，以甲醇-水系统梯度洗脱，收集甲醇-水(9∶1)洗脱部位，收集液经冷冻干燥后重结晶，得莫诺苷单体(纯度≥98％)。
4.取薯蓣药材500g，用6倍量80％乙醇回流提取1小时，药渣再加4倍量80％乙醇回流提取1.5小时。合并2次滤液，浓缩至1000ml。
5.将上述醇提物经AB-8或HPD400大孔树脂分离，收集合并50％、70％乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至1000ml。
6.将上述浓缩物上样于YMC ODS-AAG 50μm反相硅胶柱，以甲醇-水系统梯度洗脱，收集甲醇-水(8∶2)洗脱部位，合并减压浓缩，经冷冻干燥后重结晶，得薯蓣皂苷单体(纯度≥98％)。
7.将上述莫诺苷单体及薯蓣皂苷单体按重量配比(2∶1)混合均匀，即得治疗糖尿病心肌病药物组合物。
实验研究1.MTT法检测莫诺苷、薯蓣皂苷及药物组合对糖尿病心肌细胞增殖的影响摘要目的：观察莫诺苷、薯蓣皂苷及药物组合对糖尿病心肌细胞增殖的影响。方法：体外培养乳大鼠原代心肌细胞，建立高血糖模型，MTT法观察不同浓度的莫诺苷、薯蓣皂苷及药物组合(在培养基中加入终浓度25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL)对糖尿病心肌细胞增值的影响。结果：与模型组比较，不同剂量的莫诺苷、薯蓣皂苷及药物组合，在不同时间点均可促进糖尿病心肌细胞的增殖，但药物组合组明显大于莫诺苷组及薯蓣皂苷组，具显著性差异。
1.1实验材料及仪器新生1-2d龄SD大鼠数只，雌雄不限，由南京医科大学实验动物中心提供。许可证号：SCXK(苏)2008-0004。超净工作台：SW-CJ-1F型，苏净集团安泰公司；CO2恒温培养箱：3111型，FORMA；生物倒置显微镜：IX51，日本OLYMPUS；移液器：德国eppendorf；分析天平：BL310，德国Sartorius；紫外光度仪：UV-2450，日本SHIMADZU；酶标仪：PowerWave X340型，Bio-Rad公司。
1.2主要试剂青、链霉素混合液：KGY002，南京凯基生物科技发展有限公司；胰蛋白酶-EDTA消化液：KGY001，南京凯基生物科技发展有限公司；PBS(无Ca2+、Mg2+，Ph7.2)：NaCl 8.0g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO40.2g，加超纯水至1000ml，搅拌使完全溶解，调整pH至7.2，0.22μm滤膜过滤4℃保存；DMEM培养基：美国Gibco；胎牛血清(FBS)：美国Gibco；四甲基偶氮唑盐(3，4，5-dimethylthliazol-2，5-dipenyltetrazoliumbromide，MTT)：北京索来宝科技公司；莫诺苷、薯蓣皂苷及药物组合：由本课题组自制，经HPLC检测，纯度＞98％；
1.3实验方法
1.3.1原代大鼠心肌细胞分离与培养新生1-2d龄SD大鼠数只，在75％酒精中浸泡5min。在无菌条件下用眼科剪剪开胸腔，镊取心脏心尖部，置于预温的PBS中漂洗3次。将心尖在少量PBS中剪成约1mm3的小块，静止2min弃上清，向剩余的心肌组织中加入0.125％胰酶溶液10-15ml，消化10min，重复消化，待组织块基本消失时，将细胞悬液以1000r/min离心5min，加入适量DMEM+10％FBS重悬细胞，细胞悬液用无菌200目过滤器过滤，至培养皿中，置37℃、5％CO2培养箱中培养。
1.3.2实验分组和干预方法
取培养好的心肌细胞随机分为：(1)空白组：不加药及葡萄糖；(2)模型组：葡萄糖终浓度为30mmol/L；(3)给药组：莫诺苷、薯蓣皂苷及药物组合以不同浓度给药(在培养基中加入终浓度25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL)。
1.3.3MTT显色法
分别取对数生长期的细胞，消化、计数、配置成5×104/mL的细胞悬液，按100μL每孔接种于96孔板中(每孔5×103个细胞)，设3个复孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h后弃去培养液，PBS清洗2次，用完全培养基稀释药物至所需浓度，加入含有不同浓度药物的培养基200μL，对照组加入含有0.2％DMSO的培养基200μL，空白组只加200μL DMEM培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中培养72h后，每孔加入浓度为5g/L MTT溶液20μL，继续培养4h后，弃去培养液，加入150μL DMSO/孔终止反应，振荡10min使结晶完全溶解，用酶标仪于490nm波长测定光密度值(OD值)。
1.4数据分析
实验数据采用SPSS 17.0统计软件分析完成。计量数据资料先进行正态分布检验，符合正态分布者，两组间比较采用独立t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以p＜0.05、p＜0.01作为显著性和极显著性差异的标准。
1.5结果
实验结果如表1所示。与空白组比较，模型组作用于心肌细胞24h后，细胞增殖率显著降低(p＜0.01)。与模型组比较，作用24h时，莫诺苷低剂量组、薯蓣皂苷和药物组合的中剂量组可显著促进糖尿病心肌细胞的增殖(p＜0.05)，而薯蓣皂苷和药物组合的高剂量组有极显著差异(p＜0.01)。作用48h及72h时，三种药物各剂量组均有极显著差异(p＜0.01)。将药物组合各剂量组分别与莫诺苷及薯蓣皂苷相应剂量组比较，在24h和48h时均无明显差异，而在72h时，药物高剂量组有显著差异(p＜0.05)，说明随着时间延长，差异越来越明显。
表1莫诺苷、薯蓣皂苷及药物组合对糖尿病心肌细胞增殖的影响
Group 24h 48h 72h
空白组 0.302±0.008** 0.461±0.019** 0.841±0.042**
模型组 0.261±0.012 0.214±0.006 0.257±0.003
莫诺苷低剂量组 0.265±0.008 0.254±0.007** 0.307±0.007**
莫诺苷中剂量组 0.272±0.001 0.284±0.013** 0.399±0.016**
莫诺苷高剂量组 0.28±0.016* 0.308±0.016** 0.522±0.012**
薯蓣皂苷低剂量组 0.264±0.011 0.239±0.025* 0.317±0.015**
薯蓣皂苷中剂量组 0.285±0.013* 0.258±0.011** 0.399±0.014**
薯蓣皂苷高剂量组 0.288±0.012** 0.31±0.027** 0.52±0.03**
药物组合低剂量组 0.262±0.016 0.26±0.02** 0.335±0.025**
药物组合中剂量组 0.286±0.017* 0.291±0.008** 0.424±0.021**☆
药物组合高剂量组 0.288±0.003** 0.337±0.026** 0.555±0.02**#
注：与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与莫诺苷组比较：☆p＜0.05，☆☆p＜0.01；与薯蓣皂苷比较：#p＜0.05，##p＜0.01
1.6结论
莫诺苷、薯蓣皂苷及药物组合均可促进糖尿病心肌细胞的增值，但药物组合作用明显高于单一莫诺苷或单一薯蓣皂苷的作用，具有显著性差异。
试验2TUNEL法检测莫诺苷、薯蓣皂苷及药物组合对糖尿病心肌细胞凋亡的影响
2.1实验材料及仪器
2.1.1材料见试验1。
2.1.2主要仪器及试剂离心机：TGL-16M型，长沙湘仪离心机仪器有限公司；立式压力锅：YXQ-LS-50，上海博讯。细胞培养瓶：美国FALCON；DMEM培养基：美国Gibco；胎牛血清(FBS)：美国Gibco；TUNEL检测试剂盒：20121001，南京凯基生物科技发展有限公司。
2.2实验方法
将对数生长期的细胞消化接种到六孔板中，次日，待细胞贴壁后，根据组别与剂量设置加入相应的含药培养基，同时设立阴性对照组；用PBS洗涤细胞二次；浸入丙酮固定液，室温(15-25℃)固定0.5h；PBS漂洗2次；浸入通透液中，冰上(2-8℃)促渗210min(通透液：0.3％TritonX-100溶于PBS。PBS漂洗2次；各样本滴加100ulTdT酶反应液(含FITC标记的dUTP)，避光湿润37℃反应1h。复染：滴加DAPI，染色五分钟。PBS漂洗2次；
封片：滴加防淬灭封片剂封片。观察：荧光显微镜观察拍照。
2.3数据分析同试验1。
2.4结果
结果如下表2所示。与空白组比较，模型组心肌细胞凋亡率增加，差异非常显著(p＜0.01)。与模型组比较，莫诺苷、薯蓣皂苷及药物组合三者的低、中、高剂量组均能降低糖尿病心肌细胞的凋亡率，具有极显著差异(p＜0.01)。与莫诺苷相应剂量组比较，药物组合高剂量组有极显著差异(p＜0.01)；与薯蓣皂苷相应剂量组比较，药物组合中剂量组有显著差异(p＜0.05)，高剂量组有极显著差异(p＜0.01)。
表2TUNEL法检测莫诺苷、薯蓣皂苷及药物组合对糖尿病心肌细胞凋亡的影响
注：与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与莫诺苷组比较：☆p＜0.05，☆☆p＜0.01；与薯蓣皂苷比较：#p＜0.05，##p＜0.01
2.5结论
莫诺苷、薯蓣皂苷及药物组合均可降低糖尿病心肌细胞的凋亡率，具有保护糖尿病心肌细胞的作用；但药物组合组作用明显大于单一莫诺苷组及单一薯蓣皂苷组，具显著性差异。
以上二个试验结果为本发明提供了可靠的科学依据。

Claims (4)

1.一种治疗糖尿病心肌病的天然药物组合物，其特征在于：该组合物是由莫诺苷与薯蓣皂苷配合组成，重量配比1∶1～5∶1，最佳配比为2∶1。
2.根据权利要求1所述的一种药物组合物，其制备方法的特征在于：(1)取山茱萸或忍冬藤药材适量，用70％乙醇提取得到醇提物；醇提物再用AB-8或HPD400型大孔树脂分离，分别收集10％和30％乙醇洗脱液，合并，回收溶剂，浓缩，得分离物；分离物再经反相硅胶柱分离纯化，得莫诺苷单体。(2)取薯蓣药材适量，用80％乙醇回流提取得醇取物；提取物经大孔树脂及反相硅胶柱分离，得薯蓣皂苷单体。(3)将莫诺苷及薯蓣皂苷按2∶1的重量比配合均匀，即得本发明的药物组合物。
3.根据权利要求2所得的药物组合物，经HPLC法检测，其中莫诺苷及薯蓣皂苷的纯度≥98％。
4.根据权利要求1所述的一种天然药物组合物，其特征是，该组合物能促进糖尿病心肌细胞的增殖，并且可降低糖尿病心肌细胞的凋亡率，效果明显高于单一莫诺苷或单一薯蓣皂苷，具有显著性差异。该组合物可应用于治疗糖尿病心肌病的各种药物制剂中。
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