CN107326053A - 两步酶法制备1,3,7,9‑四甲基尿酸 - Google Patents

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Abstract

本发明通过点突变法获得了高酶活力的咖啡因脱氢酶突变体和双甲基黄嘌呤‑N‑甲基转移酶突变体，首次通过两步酶法制备出1,3,7,9‑四甲基尿酸，生产工艺包括下述步骤：1)以天然植物原料咖啡因为原料，用咖啡因脱氢酶或者其突变体催化生成1,3,7‑三甲基尿酸；2)以步骤1)中所得1,3,7‑三甲基尿酸为原料，用氨基酸序列为SEQ ID NO:9的双甲基黄嘌呤‑N‑甲基转移酶、或者其突变体SEQ ID NO:11催化生成1,3,7,9‑四甲基尿酸。本发明的方法具有反应条件温和、易于控制、环境友好等优点，具有工业化应用前景。

Description

两步酶法制备1,3,7,9-四甲基尿酸
技术领域
本发明属于生物催化领域，具体地说，涉及一种通过两步酶法制备1,3,7,9-四甲基尿酸的生产工艺，并且涉及通过点突变法获得的高酶活力的咖啡因脱氢酶突变体和三甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶。
背景技术
1,3,7,9-四甲基尿酸(1,3,7,9-tetramethyluric acid，theacrine)是一种天然产物，属于甲基黄嘌呤生物碱类物质，其结构式为：
甲基黄嘌呤生物碱类物质是嘌呤核苷酸的二次衍生物，其分子结构以嘌呤环为主体，植物中的嘌呤类生物碱最为人熟知的是黄嘌呤的三种甲基衍生物，即咖啡碱(1,3,7-三甲基黄嘌呤)、可可碱(3,7-二甲基黄嘌呤)和茶碱(1,3-二甲基黄嘌呤)。该类物质在中枢神经系统、循环系统、呼吸系统等方面都具有广泛的生物活性，部分已经成为临床药物或具有开发潜力的临床候选药物。不同嘌呤生物碱类物质的结构区别主要在于嘌呤环上甲基的位置和个数。结构上的微小差别，导致了生理活性的不同。关于1,3,7,9-四甲基尿酸的活性，据Lyles MB等发现，1,3,7,9-四甲基尿酸能与杂环类诱变剂和致癌物结合从而起抗诱变作用(Cell Biol Int,2002,26:145-154)；Xu等研究发现，1,3,7,9-四甲基尿酸具有中枢神经药理方面的活性，在动物实验中表现出显著的镇静催眠作用(J Asian Nat Prod Res，2007,7:665-672)。
目前1,3,7,9-四甲基尿酸的制备方法主要是化学合成法，Vestnik Slovenskega报导了以尿酸为反应底物进行化学反应，反应过程中使用到叠氮化钠，在使用该方法进行大量制备时易爆炸(Kemijskega Drustva.29-4.331-43；1982)。用于1,3,7,9-四甲基尿酸的化学合成方法普遍存在反应原料昂贵、反应收率低、过程难以控制、易发生危险、产品质量不稳定等缺点，大大限制了工业化生产。现在主要是通过从苦茶等植物中提取，中山大学学报(1999,38(5):82-86)中公开了一种从苦茶中分离得到1,3,7,9-四甲基尿酸的方法；中国发明专利ZL200410077237.6公开了一种用苦茶芽叶为原料，经过溶剂提取、氯仿萃取或聚酰胺柱层析、反相色谱分离制备1,3,7,9-四甲基尿酸的方法，该发明虽然产物纯度高，但苦茶芽叶原料处理工艺成本高，步骤繁琐，溶剂耗量大而且费时，同样难以实施工业化生产。
Hiroshi Ashihara等人于2008年在综述文献中预测了以咖啡因为原料合成1,3,7,9-四甲基尿酸的可能的代谢路线，见下图(Phytochemistry 69(2008)841–856)。文献同时指出，部分双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶具有三甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶的活性。
K.M.Madyastha等人发现，一种咖啡因氧化酶可以氧化咖啡因生成1,3,7-三甲基尿酸，(Biochemical and Biophysical Research Communications 263,460–464(1999))。Chi Li Yu等人在2008年从假单胞菌Pseudomonas sp.Strain CBB1分离出一个新的咖啡因脱氢酶，能在辅酶Q10的存在的条件下，将咖啡因氧化成1,3,7-三甲基尿酸(J.Bacteriol.2008,190(2):772.DOI:10.1128/JB.01390-07)。Misako Kato等人1999年在茶叶中发现一种咖啡因合成酶具有1,3,7-位转甲基活性(Plant Physiology,June 1999,Vol.120,pp.579–586)。
这些研究表明，通过生物转化法实现以天然植物原料咖啡因为原料生产另一种天然产物1,3,7,9-四甲基尿酸是有可能的。
生物转化法的优点主要体现在反应条件温和，易于控制，安全、环保。但要实现工业化，必须大幅度提高作为催化剂的相关酶的酶活性，并要解决降低或消除底物抑制和/或产物抑制、保障相关酶的稳定性和充足供应等等诸多问题。
发明内容
为了探索利用生物技术实现1,3,7,9-四甲基尿酸工业化生产的途径，本发明通过点突变法来提高现有的咖啡因脱氢酶和双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶的酶活性，并构建工程菌来制备上述两种酶。借此，本发明首次利用两步酶法制备出了1,3,7,9-四甲基尿酸。
因此，本发明的第一个目的在于提供一种制备1,3,7,9-四甲基尿酸的方法。
本发明的第二个目的在于提供酶活性提高的咖啡因脱氢酶突变体和双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶突变体。
本发明的第三个目的在于提供表达上述突变酶的基因工程菌。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种制备1,3,7,9-四甲基尿酸的方法，其包括下述步骤：1)以咖啡因为原料，用野生型咖啡因脱氢酶、或者其突变体催化生成1,3,7-三甲基尿酸；2)以步骤1)中所得1,3,7-三甲基尿酸为原料，用氨基酸序列为SEQ ID NO:9的双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶、或者其突变体SEQ ID NO:11催化生成1,3,7,9-四甲基尿酸。其中，
野生型咖啡因脱氢酶的氨基酸序列由大亚基SEQ ID NO:2、中亚基SEQ ID NO:3、小亚基SEQ ID NO:4组成：
MFADINKGDAFGTWVGKSVPRREDADILAGRAEYIADIKLPGMLEAAFLRSPFAHARIVSIDVSQALALPGVYDVMVGADIPDYVKPLPLMITYQNHRETPTSPLARDIVRYAGEPVAVVAAINRYVAEDALELIVVKYEELPVVASIDASLAVDGPRLYEGWPDNVVAKVSSEIGDVDAAMASADLVFEERFEIQRCHPAPLETRGFIAQWDFKGENLNVWNGTQIINQCRDFMSEVLDIPASKIRIRSPRLGGGFGAKFHFYVEEPAIVLLAKRVKAPVRWIEDRLEAFSATVHAREQVIDVKLCAMNDGRITGIVADIKGDLGASHHTMSMGPVWLTSVMMTGVYLIPNARSVAKAIVTNKPPSGSYRGWGQPQANFAVERMVDLLAHKLQLDPAAVRRINYVPEARMPYTGLAHTFDSGRYEVLHDRALKTFGYEAWLERQAAAQAQGRRIGIGMSFYAEVSAHGPSRFLNYVGGRQGGYDIARIRMDTTGDVYVYTGLCDMGQGVTNSLAQIAADALGLNPDDVTVMTGDTALNPYTGWGTGASRSITIGGPAVMRAATRLREKILSIARHWLQADPDTLVLANRGVMVRDDPGRYVSFASIGRAAYCQIIELPEDVEPGLEAVGVFDTVQLAWPYGMNLVAVEVDEDTGAVSFLDCMLVHDMGTIVNPMIVDGQLHGGIAQGIAQALYEELRYDENGQLGTGSFADFLMPTASEIPNMRFDHMVTESPLIPGGMKGVGEGGTIGTPAAVVNAIENALRPITNSKLNRTPVTPDRILTAISAGACA(SEQ ID NO:2)；
MKPTAFDYIRPTSLPEALAILAEHSDDVAILAGGQSLMPLLNFRMSRPALVLDINDISELQQVRCENDTLYVGSMVRHCRVEQEEIFRSTIPLMSEAMTSVAHIQIKTRGTLGGNLCNAHPASEMPAVITALGASMVCKSEKRGERVLTPEEFFEGALQNGLQSDELLCEIRIPVPSQYVGWAFEEVARRHGDFAQCGAAVLIGAEDRKIDYARIALCSIGETPIRFHALEQWLIGRPVGNDLPADVKLHCREILDVAEDSTMTAENRAKLASAVTSRAIARAADRIVHLDVKRG(SEQ ID NO:3)；
MSSHVISLTVNGQAIERKVDSRTLLADFLRDELRLTGTHVGCEHGVCGACTIQFDGEPARSCLMLAVQAEGHSIRTVEALAVDGCLGALQQAFHEKHGLQCGFCTPGLLMTLDYALTADLHIDFSSDKEIRELISGNLCRCTGYQNIINAIKSVSPTTEIAKSEELV(SEQ ID NO:4)。
所述咖啡因脱氢酶突变体的氨基酸序列由大亚基SEQ ID NO:6、中亚基SEQ IDNO:7、小亚基SEQ ID NO:4组成：
MFADINKGDAFGTWVGKSVPRREDADILAGRAEYIADIKLPGMLEAAFLRSPFAHARIVSIDVSQALALPGVYDVMVGADIPDYVKPLPLMITYQNHRETPTSPLARDIVRYAGKPVAVVAAINRYVAEDALELIVVKYEELPVVASIDASLAVDGPRLYEGWPDNVVAKVSSEIGDVDAAMASADLVFEERFEIQRCHPAPLETRGFIAQWDFKGENLNVWNGTQIINQCRDFMSEVLDIPASKIRIRSPRLGGGFGAKFHFYVEEPAIVLLAKRVKAPVRWIEDRLEAFSATVHAREQVIDVKLCAMNDGRITGIVADIKGDLGASHHTMSMGPVWLTSVMMTGVYLIPNARSVAKAIVTNKPPSGSYRGWGQPQANFAVERMVDLLAHKLQLDPAAVRRINYVPEARMPYTGLAHTFDSGRYEVLHDRALKTFGYEAWLERQAAAQAQGRRIGIGMSFYAEVSAHGPSRFLNYVGGRQGGYDIARIRMDTTGDVYVYTGLCDMGQGVTNSLAQIAADALGLNPDDVTVMTGDTALNPYTGWGTGASRSITIGGPAVMRAATRLREKILSIARHWLQADPDTLVLANRGVMVRDDPGRYVSFASIGRAAYCQIIELPEDVEPGLEAVGVFDTVQLAWPYGMNLVAVEVDEDTGAVSFLDCMLVHDMGTIVNPMIGDGQLHGGIAEGIAQALYRELRYDENGQLGTGSFADFLMPTASEIPNMRFDHMVTESPLIPGGMKGVGEGGTIGTPAAVVNAIENALRPITNSKLNRTPVTPDRILTAISAGACA(SEQ ID NO:6)；
MKPTAFDYIRPTSLPEALAILAEHSDDVAILAGGQSLMPLLNFRMSRPALVLDINDISELQQVRCENDTLYVGSMVRHCRVEQEEIFRSTIPLMSEAMTSVAHIQIKTRGTLGGNLCNAHPASEMPAVITALGASMVCKSEKRGERVLTPEEFFEGALQNGLQTDELLCEIRIPVPSQYVGWAFEEVARRHGDFAQCGAAVLIGAEDRKIDYARIALCSIGETPIRFHALEQWLIGRPVGNDLPADVKLHCREILDVAEDSTMTAENRAKLASAVTSRAIARAADRIVHLDVKRG(SEQ ID NO:7)；
MSSHVISLTVNGQAIERKVDSRTLLADFLRDELRLTGTHVGCEHGVCGACTIQFDGEPARSCLMLAVQAEGHSIRTVEALAVDGCLGALQQAFHEKHGLQCGFCTPGLLMTLDYALTADLHIDFSSDKEIRELISGNLCRCTGYQNIINAIKSVSPTTEIAKSEELV(SEQ ID NO:4)。
野生型双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶的氨基酸序列为：
MELQEVLHMNGGEGDTSYAKNSSYNLFLIRVKPVLEQCIQELLRANLPNINKCFKVGDLGCASGPNTFSTVRDIVQSIDKVGQEKKNELERPTIQIFLNDLFQNDFNSVFKLLPSFYRNLEKENGRKIGSCLIGAMPGSFYSRLFPEESMHFLHSCYCLHWLSQVPSGLVTELGISANKGCIYSSKASGPPIKKAYLDQFTKDFTTFLRIHSEELISRGRMLLTFICKEDEFDHPNSMDLLEMSINDLVIEGHLEEEKLDSFNVPIYAPSTEEVKRIVEEEGSFEILYLETFYAPYDAGFSIDDDYQGRSHSPVSCDEHARAAHVASVVRSIYEPILASHFGEAILPDLSHRIAKNAAKVLRSGKGFYDSVIISLAKKPEKADM(SEQ ID NO:9)；
本发明通过定向进化对双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶SEQ ID NO:9进行基因工程改造后，所形成的突变体SEQ ID NO:11已经不再属于严格意义上的双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶了，而是一种三甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶(TNMT1)。由于它是从双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶经过点突变法获得的，故也称为双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶突变体，该名称在本文中与三甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶可以通用。
MELQEVLHMNGGEGDTSYAKNSSYNLFLIRVKPVLEQCIQELLRANLPNINKCFKVGRLGCASGPNTFATVRDIVQSIDKVGQEKKNELERPTIQIFLNDLFQNDFNSVFKLLPSFYRNLEKENGRKIGSCLIGAMPGSFYSRLFPEESMHFLHSCYCLHWLSQVPSGLVTELGISANKGCIYSSKASGPPIKKAYLDQFTKDFTTFLRIHSEELISRGRMLLTAICKEDEFDHPNSMDLLKMSILDLVIEGHLEEEKLDSFNVPIYAPSTEEVKRIVEEEGSFEILYLETFYAPYDAGFSIDDDYQGRSHSPVSCDEHARAAHVASVVRSIYEPILASHFGEAILPDLSHRIAKNAAKVLRSGKGFYDSVIISLAKKPEKADM(SEQ ID NO:11)。
在上述两步酶法的生产工艺中，可以是野生型咖啡因脱氢酶与野生型双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶的组合使用，也可以是咖啡因脱氢酶突变体与野生型双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶的组合使用、野生型咖啡因脱氢酶与三甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶(即双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶突变体)的组合使用、或者咖啡因脱氢酶突变体与三甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶(即双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶突变体)的组合使用。
优选地，上述组合是咖啡因脱氢酶突变体与三甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶的组合使用。
在一种实施方式中，上述步骤1)中加入辅酶Q0，以便促进咖啡因反应生成1,3,7-三甲基尿酸。
在另一种实施方式中，上述步骤2)中加入S-腺苷基-L-蛋氨酸，以便促进1,3,7-三甲基尿酸反应生成1,3,7,9-四甲基尿酸。
在一种优选的实施方式中，所述咖啡因脱氢酶和所述双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶及其突变体呈微生物菌体形式，无需从表达宿主中提取纯化出来。
上述咖啡因脱氢酶突变体的编码基因可以是SEQ ID NO:5：
上述三甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶SEQ ID NO:11的编码基因可以是SEQ ID NO:10。
一种包含上述基因的质粒。该质粒包含用于表达上述基因的载体，优选载体是pSH或者pET系列质粒比如pET24a(+)，但并不受限于此。
一种转化了上述质粒的微生物，该微生物可作为宿主用于表达上述咖啡因脱氢酶和三甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶。
优选地，上述微生物选自枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的双酶法采用天然植物原料咖啡因作为底物原料，通过温和的酶促反应可以制备出1,3,7,9-四甲基尿酸，克服了化学合成法和天然植物提取法的一些缺陷，而且属于环境友好型生产工艺，具有工业化应用前景。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
本文的实施例中，如果对于反应温度或操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(15-25℃)。
作为构建咖啡因脱氢酶突变体的基础模板，假单胞菌CBB1菌株(Pseudomonassp.Strain CBB1)来源的野生型咖啡因脱氢酶的编码基因(GenBank:HM053473.1)是序列表中的SEQ ID NO:1。
鉴于双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶突变体SEQ ID NO:11具有三甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶的活性，即，具有将1,3,7-三甲基尿酸转化为1,3,7,9-四甲基尿酸的催化活性，本文中可将其称为三甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶(TNMT1)。
作为构建双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶突变体的基础模板，阿拉比卡咖啡豆(Coffea arabica)来源的野生型双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶的氨基酸序列是序列表中的SEQ ID NO:9。该酶为S-腺苷基蛋氨酸依赖的N-甲基转移酶，其编码基因(GenBank:AB086414.1)是序列表中的SEQ ID NO:8。
为了获得酶活性更高的咖啡因脱氢酶突变体，本发明对野生型咖啡因脱氢酶的基因序列SEQ ID NO:1进行点突变。通过易错PCR技术获得一个或多个氨基酸位点取代的突变体氨基酸序列，筛选出5个可提高咖啡因脱氢酶的酶活力或是增加底物特异性的位点，然后以定点组合突变的方式，获得突变体。
野生型咖啡因脱氢酶的氨基酸序列由大亚基(ADH1-L)SEQ ID NO:2、中亚基(ADH1-M)SEQ ID NO:3和小亚基(ADH1-S)SEQ ID NO:4组成。在定向进化过程中，突变位点选择在大亚基SEQ ID NO:2和中亚基SEQ ID NO:3上，在小亚基(ADH1-S)SEQ ID NO:4上未选择突变。
咖啡因脱氢酶及其突变体的大亚基、中亚基、小亚基三个序列不在一个氨基酸序列上，尽管它们对应的核苷酸序列在一个核苷酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5上，但是它们对应的核苷酸序列是三个独立的ORF(开放读码框)。三个亚基的核苷酸有重复序列，大亚基和中亚基中间有重复序列，中亚基和小亚基中间有间隔序列。为了简明地表述咖啡因脱氢酶的氨基酸修饰，本文中可以将咖啡因脱氢酶及其突变体当作一个氨基酸序列看待，并且依照“大亚基+中亚基+小亚基”的顺序依序相加地描述氨基酸的位点。比如，大亚基(ADH1-L)SEQ ID NO:2的氨基酸有791个，当描述中亚基(ADH1-M)SEQ ID NO:3上的第2个氨基酸K(赖氨酸Lys)时，可以表示为K793；当描述中亚基(ADH1-M)SEQ ID NO:3上的第164个氨基酸S(丝氨酸Ser)替换为T(苏氨酸Thr)时，可以表示为S955T。以此类推。
类似地，为了获得高酶活性的三甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶突变体，本发明对具有三甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶活性的野生型双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶SEQ ID NO:9的基因序列SEQ ID NO:8进行点突变。通过易错PCR技术获得一个或多个氨基酸位点取代的突变体氨基酸序列，筛选出数个可提高咖啡因脱氢酶的酶活力或是增加底物特异性的位点，然后以定点组合突变的方式，获得本发明中具有氨基酸序列SEQ ID NO:11的突变体。
在本文中，术语“咖啡因脱氢酶突变体”、“突变体咖啡因脱氢酶”和“突变咖啡因脱氢酶”表示相同的意义，都是指野生型咖啡因脱氢酶的突变体。类似地，术语“双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶突变体”、“突变体双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶”和“突变双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶”表示相同的意义，都是指野生型双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶(SEQ ID NO:9)的突变体。
在本发明中，术语“野生(型)”、“野生酶”、“野生型酶”表示相同的意义，都是指未经基因工程改造的咖啡因脱氢酶或者未经基因工程改造的双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶。
本发明的咖啡因脱氢酶突变体的氨基酸数量有1253个，双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶突变体的氨基酸数量只有384个，且它们结构明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。
上述转化体宿主可以是任何适合表达咖啡因脱氢酶突变体的微生物和任何适合表达双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶突变体的微生物，括细菌和真菌。优选微生物是枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、或者大肠杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。
当作为生物催化剂用于生产1,3,7,9-四甲基尿酸时，本发明的咖啡因脱氢酶及其突变体、双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶及其突变体都可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。
本发明的咖啡因脱氢酶和三甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶的分离纯化、包括固定化酶制备技术也是本领域技术人员所熟知的。
为简要起见，在实施例中有时将咖啡因脱氢酶简写为ADH1。实施例中有时将三甲基尿酸-N-甲基转移酶称作双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶突变体，皆简写为TNMT1。
实施例
材料和方法
本文中的全基因合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成；表达载体由南京金斯瑞生物科技有限公司亚克隆制备。引物合成及测序皆由上海生工完成。。
本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
酶活力测定
1.咖啡因脱氢酶酶活力测定
酶活测定方法参照文献(J.Bacteriol.2008,190(2):772.DOI:10.1128/JB.01390-07)所提供的方法，利用ATS高压匀浆机破碎发酵液中工程细胞，离心去除沉淀。在50mM，pH7.5的磷酸缓冲液中，加入0.5mM咖啡因，0.25mM的四氮唑硝基蓝(或称四氮唑蓝，nitroblue tetrazolium，NBT)，添加微量辅酶Q0，加入适量的细胞菌体，或者细胞提取液，或者提纯的咖啡因脱氢酶，在25℃下反应60min，测定566nm的光吸收。
酶活力定义：在25℃下每分钟还原1微摩尔(μmol)NBT所需要的酶量定义为1个单位(U)。
2.三甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶酶活力测定
利用ATS高压匀浆机破碎发酵液中工程细胞，离心去除沉淀，50mM，pH7.5的磷酸缓冲液中，加入0.1mM的1,3,7-三甲基尿酸，0.3mM的S-腺苷基-L-蛋氨酸，加入适量的细胞菌体，或者细胞提取液，或者提纯的三甲基尿酸-N-甲基转移酶，25℃，反应90min，HPLC测定1,3,7-三甲基尿酸消耗以及1,3,7,9-四甲基尿酸的生成。
酶活力定义：在25℃下每分钟催化1,3,7-三甲基尿酸产生1微摩尔(μmol)1,3,7,9-四甲基尿酸所需要的酶量定义为1个单位(U)。
实施例1野生型ADH1和TNMT1基因重组大肠杆菌的构建
1.1构建野生型咖啡因脱氢酶ADH1基因重组大肠杆菌
对于假单胞菌CBB1菌株(Pseudomonas sp.Strain CBB1)来源的野生型咖啡因脱氢酶，以其编码基因SEQ ID NO:1为基础，全基因合成基因序列，并在基因两端设计限制性内切酶位点NdeI和XhoI，亚克隆到载体pET24a(Novagen)的相应位点，获得重组质粒，转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达野生型咖啡因脱氢酶的重组大肠杆菌。
1.2构建野生型双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶基因重组大肠杆菌
对于阿拉比卡咖啡豆(Coffea arabica)来源的野生型双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶SEQ ID NO:9，以其编码基因SEQ ID NO:8为基础，全基因合成基因序列，并在基因两端设计限制性内切酶位点NdeI和XhoI，亚克隆到载体pET24a(Novagen)的相应位点，获得重组质粒，转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达野生型双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶的重组大肠杆菌。
实施例2咖啡因脱氢酶基因工程菌构建
2.1易错PCR法构建咖啡因脱氢酶(ADH1)随机突变点库
以野生型咖啡因脱氢酶基因序列SEQ ID NO:1为模板，应用易错PCR技术构建随机突变体库。正向引物ADH1-Nde-F为5’-ATGTACTTCGCGGATATAAACAAAGGCGACG-3’，反向引物ADH1-Xho-R为5’-CTCGAGTCATACAAGTTCCTCACTCTTTGC-3’。
50μL易错PCR反应体系包括：50ng质粒模板pET24a-wt-ADH1，30pmol一对引物ADH1-Nde-F和ADH1-Xho-R，1X Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl2，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl2，2.5个单位的Taq酶(fermentas)。PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min/kbp；30个循环；72℃10min。胶回收2.0kb随机突变片段作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃5min，；98℃10s，60℃30s，68℃2min/kbp，25个循环；68℃10min。DpnI消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到超过104个克隆的随机突变库。
2.2突变体库的高通量筛选
选取突变体库中的转化子接种到含700μL LB培养基的96孔深孔培养板中，培养基中含100μg/mL卡那霉素和0.1mM IPTG，37℃培养6h后，降温至25℃，培养过夜。5000rpm离心10min，弃上清，置于-70℃冷冻1h，室温融化30min。加入200μL含1mg/mL溶菌酶的0.1M磷酸钾盐缓冲液(pH8.0)，重悬菌体，37℃孵育1h，4℃，5000rpm离心20min，取20μL上清，用于ADH1活力测定。
2.3高通量咖啡因脱氢酶活力测定
底物反应液：0.5mM咖啡因，0.25mM的四氮唑硝基蓝(NBT)，添加微量比如0.02-0.1mM的辅酶Q0。
终止反应液：0.05M NaOH，20v/v％冰醋酸。
将上述步骤1.2中的上清20μL加入20μL底物反应液中，在25℃的条件下反应过夜，加入200μL终止反应液，然后5000rpm离心10min。取200μL离心上清，用酶标仪检测吸光度。
2.4高酶活突变体的筛选
在随机突变库中，通过对约20000个突变体克隆筛选，发现了一些突变体的酶活相比野生型ADH1有显著的提高。结果显示突变点F11K、F53A、A115K、P674A、V677G、Q687E、E695R、F710L、S955T、A974F能够提高ADH1的酶活。
根据上述位点，设计突变点引物，以实施例1.1中的重组质粒为模板，构建定点组合库。通过定向进化改造ADH1，获得数个高酶活性的突变体。
其中一个突变体的酶活相比野生型ADH1提高了32倍，其氨基酸序列由大亚基SEQID NO:6、中亚基SEQ ID NO:7、小亚基SEQ ID NO:4组成，其为野生型咖啡因脱氢酶第115位的A替换为K、第677位的V替换为G、第687位的Q替换为E、第695位的E替换为R、第955位的S替换为T的突变体。本文中将其命名为ADH1-931。
作为一种优选的实施方式，咖啡因脱氢酶突变体ADH1-931的编码基因是SEQ IDNO:5。该基因可在枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌中表达，更优选在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。
实施例3三甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶基因工程菌构建
3.1易错PCR法构建三甲基尿酸-N-甲基转移酶(TNMT1)随机突变点库
以野生型双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶基因序列SEQ ID NO:8为模板，应用易错PCR技术构建随机突变体库。正向引物TNMT1-Nde-F为5’-CATATGGAGCCGACCTCGAC-3’，反向引物TNMT1-Xho-R为5’-CTCGAGTGGCTTGAAGTTGAAG-3’。
50μL易错PCR反应体系包括：50ng质粒模板pET24a-wt-TNMT1，30pmol一对引物TNMT1-Nde-F和TNMT1-Xho-R，1X Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mMdTTP，7mM MgCl2，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl2，2.5个单位的Taq酶(fermentas)。PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min/kbp；30个循环；72℃10min。胶回收2.0kb随机突变片段作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃5min，；98℃10s，60℃30s，68℃2min/kbp，25个循环；68℃10min。DpnI消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到超过104个克隆的随机突变库。
3.2突变体库的高通量筛选
选取突变体库中的转化子接种到含700μL LB培养基的96孔深孔培养板中，培养基中含100μg/mL卡那霉素和0.1mM IPTG，37℃培养6h后，降温至25℃，培养过夜。5000rpm离心10min，弃上清，置于-70℃冷冻1h，室温融化30min。加入200μL含1mg/mL溶菌酶的0.1M磷酸钾盐缓冲液(pH8.0)，重悬菌体，37℃孵育1h，4℃，5000rpm离心20min，取20μL上清，用于TNMT1酶活力测定。
3.3高通量三甲基尿酸-N-甲基转移酶活力测定
底物反应液：50mM，pH7.5的磷酸缓冲液中，含有0.1mM的1,3,7-三甲基尿酸，0.3mM的S-腺苷基-L-蛋氨酸。
终止反应液：0.05M NaOH，20v/v％冰醋酸。
将上述步骤2.2中的上清20μL加入20μL底物反应液中，在25℃的条件下反应过夜，加入200μL终止反应液，然后5000rpm离心10min。取200μL离心上清，检测566nm下的吸光度。
3.4高酶活突变体的筛选
在随机突变库中，通过对约100000个突变体克隆筛选，发现了一些突变体的酶活相比野生型TNMT1有显著的提高。结果显示突变点L47E、D58R、S69A、M221T、F225A、E242K、N246L能够提高TNMT1的酶活。
根据上述位点，设计突变点引物，以实施例1.2中的重组质粒为模板，构建定点组合库。通过定向进化改造TNMT1，获得数个高酶活性的突变体。
其中一个突变体的酶活相比野生型TNMT1提高了大约100倍，其氨基酸序列为SEQID NO:11，其为野生型双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶SEQ ID NO:9第58位的D替换为R、第69位的S替换为A、第225位的F替换为A、第242位的E替换为K、第246位的N替换为L的突变体。本文中将其命名为TNMT1-127。
作为一种优选的实施方式，三甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶TNMT1-127的编码基因是SEQ ID NO:10。该基因可在枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌中表达，更优选在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。
实施例4基因工程菌ADH1-931的发酵
将在实施例2中筛选出的表达咖啡因脱氢酶突变体ADH1-931的大肠杆菌菌株命名为菌株ADH1-931。
挑取ADH1-931单菌落，接种至5mL含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜。取2mL过夜培养物接种至200mL TB培养基中，37℃，250rpm摇床培养2-3h，至OD600 0.7-0.8时，加入0.1mM IPTG，28℃，200rpm培养过夜。4℃，10000rpm，离心10min，收集菌体。
可选地，可以进一步对发酵菌体进行破壁处理，获得粗酶液。比如将菌体用50mL平衡缓冲液(50mM磷酸钾盐缓冲液，200mM NaCl，pH8.0)重悬，然后超声破碎，破碎后的菌体4℃，12000rpm，离心20min，收集上清，得咖啡因脱氢酶粗酶液。
实施例5突变酶ADH1-931催化咖啡因反应生成1,3,7-三甲基尿酸
5.1菌体催化
在50mM，pH7.5的5ml磷酸缓冲液中，加入30mM咖啡因，添加0.05mM辅酶Q0，加入1ml的实施例4中所得的发酵菌体，25℃下反应。用高效液相色谱HPLC跟踪反应。反应180min后，咖啡因转化率为54％。
HPLC条件为：Dionex HPLC系统：P680泵/PDA100二极管阵列检测器/ASI-100自动进样器；
色谱柱：Mightysil RP-18 150-4.6(5um)
柱温：40℃
流速：1ml/min
检测波长：231nm
流动相：A:乙腈：水：85％磷酸(5：95：0.05)
B:乙腈：水：85％磷酸(50：50：0.05)
0min 5min 8min 10min 15min 20min
B％ 10 10 30 30 80 80
5.2粗酶液催化
在50mM，pH7.5的5ml磷酸缓冲液中，加入50mM咖啡因，0.05mM辅酶Q0，1ml的实施例4中所得的粗酶液，25℃反应。用高效液相色谱HPLC跟踪反应。反应200min后，咖啡因转化率为71％。
实施例6基因工程菌TNMT1-127的发酵
将在实施例3中筛选出的表达三甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶TNMT1-127的大肠杆菌菌株命名为菌株TNMT1-127。
挑取TNMT1-127单菌落，接种至5mL含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜。取2mL过夜培养物接种至200mL TB培养基中，37℃，250rpm摇床培养2-3h，至OD600 0.7-0.9时，加入0.1mM IPTG，28℃，200rpm培养过夜。4℃，10000rpm，离心10min，收集菌体。
可选地，可以进一步对发酵菌体进行破壁处理，获得粗酶液。比如将菌体用50mL平衡缓冲液(50mM磷酸钾盐缓冲液，200mM NaCl，pH8.0)重悬，然后超声破碎，破碎后的菌体4℃，12000rpm，离心20min，收集上清，得三甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶粗酶液。
实施例7突变酶TNMT1-127催化1,3,7-三甲基尿酸反应生成1,3,7,9-四甲基尿酸
7.1菌体催化
在50mM，pH7.5的5ml磷酸缓冲液反应体系中，含有30mM的1,3,7-三甲基尿酸，50mM的S-腺苷基L-蛋氨酸。加入1ml的实施例6中所得的发酵菌体，25℃下反应。用高效液相色谱HPLC跟踪反应。反应200min后，测得1,3,7-三甲基尿酸转化率为61％。
HPLC条件为：Dionex HPLC系统：P680泵/PDA100二极管阵列检测器/ASI-100自动进样器；
色谱柱：Mightysil RP-18 150-4.6(5um)
柱温：40℃
流速：1ml/min
检测波长：231nm
流动相：A:乙腈：水：85％磷酸(5：95：0.05)
B:乙腈：水：85％磷酸(50：50：0.05)
0min 5min 8min 10min 15min 20min
B％ 10 10 30 30 80 80
7.2粗酶液催化
在50mM，pH7.5的5ml磷酸缓冲液反应体系中，含有30mM的1,3,7-三甲基尿酸，50mM的S-腺苷基L-蛋氨酸。加入1ml的实施例6中所得的的粗酶液，25℃下反应。用高效液相色谱HPLC跟踪反应。反应180min后，测得1,3,7-三甲基尿酸转化率为55％。
上述实施例对本发明的双酶法生产1,3,7,9-四甲基尿酸的工艺进行了验证，相关的工艺条件可以进一步优化。本领域的技术人员应理解，在不违背本发明的思想下，本领域技术人员可以在此基础上做出各种改动或者修改，所做的各种变形或者修改的等价形式，同样应属于本发明的范围。
另外，需说明的是，本说明书中对先前公开的文献的列举和论述不应视为承认该文献是现有技术或者是公知常识。
序列表
<110> 湖州恒睿营养健康科技有限公司
<120> 两步酶法制备1,3,7,9-四甲基尿酸
<130> SHPI1700352
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3768
<212> DNA
<213> Pseudomonas sp. Strain CBB1
<400> 1
atgttcgcgg atataaacaa aggcgacgcc ttcggtacct gggtcggaaa aagcgtaccg 60
cgtcgcgagg atgcggatat ccttgcaggg cgagccgagt acattgccga tatcaagctt 120
cctggcatgc ttgaggccgc gttcctgcgt agtccgtttg ctcatgctag gatcgtctcg 180
atagacgtct cacaagccct ggctctgcct ggtgtgtacg acgtcatggt gggcgcggat 240
attccggact atgtcaaacc gcttcccctc atgattacct accagaacca tcgcgaaacc 300
ccgacttccc cgctggcccg agacatcgtt cgctatgccg gtgaaccggt cgctgtggtc 360
gccgcgataa atcgctatgt cgcagaagat gcactggagt tgatcgtcgt caaatatgag 420
gaattgcctg tcgtcgcttc catcgatgct tcgcttgctg ttgacgggcc acgtctctat 480
gagggatggc ctgacaatgt cgtggccaag gtcagctcgg aaattggcga tgtggacgcg 540
gccatggcat ctgccgacct cgtctttgag gagcggttcg aaatccaacg ctgccatccg 600
gctccgctcg agacgcgcgg cttcatcgcg caatgggact tcaagggcga gaacttgaat 660
gtctggaatg gtacgcagat catcaatcag tgccgtgatt tcatgtcgga agtgctggat 720
attccggcca gcaagatacg catcagatcg ccccgtttgg gtggaggctt cggtgcgaaa 780
tttcatttct acgtcgaaga acccgcgatc gtgctccttg ccaagcgggt caaggcaccg 840
gtgcgctgga tagaagaccg gctggaggct ttttcggcga cagttcacgc ccgcgagcaa 900
gtcatcgacg tcaaactctg tgccatgaac gacgggcgca ttaccggcat tgtcgcggac 960
ataaaaggcg atctcggcgc gagccatcat acaatgtcga tgggaccggt ctggctgact 1020
tcggtgatga tgacgggtgt ctatttgatc ccgaacgcac gttccgtcgc aaaggcgatt 1080
gtaaccaaca agccgccgtc aggttcctat cgcggctggg gacagcctca ggcaaacttt 1140
gcagtcgaac ggatggtgga tcttttggcg cacaaactcc agcttgatcc ggctgcggtg 1200
cggcggatca attacgtgcc tgaagccaga atgccttaca ccggtcttgc tcatacgttc 1260
gacagcggcc ggtatgaggt attgcatgac agagcactga agacgttcgg ctacgaggca 1320
tggttggagc gccaggcagc agcgcaggcc caaggacggc gtattgggat cggaatgtcg 1380
ttttacgccg aggttagcgc ccatggccca tcgcgttttc ttaattatgt tggtggacgg 1440
caaggtggtt acgacattgc acgtattcgg atggatacga ccggtgatgt gtatgtctac 1500
acaggcctct gcgacatggg tcagggcgtg accaatagct tggcgcaaat agctgccgat 1560
gcgttaggtt tgaatcctga tgacgtgacg gtaatgacgg gagatacggc ccttaacccc 1620
tacaccggct ggggcacagg ggctagccgt tcgatcacta tcggcggtcc ggctgtcatg 1680
cgcgcggcga cgcgtttgcg ggaaaagata ctctctattg ctcgtcattg gcttcaggcc 1740
gatccggata cgttagttct ggcaaatcgc ggcgtcatgg tgcgcgacga tccgggtcgt 1800
tatgtatctt tcgcttccat cggcagggct gcctattgcc aaatcatcga gctgccggag 1860
gatgtagagc cggggctcga ggcggtagga gttttcgaca cagtgcagtt agcttggcca 1920
tacggcatga acctggttgc cgttgaagtc gatgaagata ccggcgcggt gtcgttcctg 1980
gactgcatgc tggttcacga catgggaacg atcgtcaatc cgatgatcgt ggatggccaa 2040
cttcacggcg gaattgctca aggcatcgca caggctctct atgaagagtt gcgctatgac 2100
gagaacggtc aactagggac aggctccttt gcggacttcc tgatgcctac agccagcgaa 2160
ataccaaaca tgcgttttga ccatatggtg accgagtcac cgctcatacc gggggggatg 2220
aagggagtcg gagaaggagg cactatcggt actccggccg cagtagtgaa cgctatcgag 2280
aatgcactac gcccaatcac gaactcgaaa ttgaaccgaa ctccggttac cccagatcgc 2340
atcttgaccg ccatttctgc cggagcatgc gcatgaaacc taccgcgttt gactatattc 2400
ggccgaccag cttgccagaa gcgctcgcaa tcctggccga acattccgac gatgtcgcta 2460
tacttgctgg cgggcaaagc ctgatgccgc tgctcaactt ccgaatgtcc cgtccggcac 2520
tggtactcga tatcaatgac atttccgagc tgcagcaggt tcgatgcgaa aacgatacct 2580
tgtatgtcgg gtcgatggtc cggcactgtc gtgttgaaca ggaagaaatc ttccgctcga 2640
cgataccgtt gatgtccgag gcgatgactt cggtcgcgca cattcagatc aagacgcgag 2700
gtactttggg tggcaatctt tgcaatgcgc acccggcgtc ggaaatgcct gcggtgataa 2760
ctgcattagg cgcctcaatg gtctgcaagt ccgagaaacg gggggagcgc gttcttacgc 2820
ccgaagagtt cttcgaaggc gccttgcaaa acggtcttca aagcgatgaa ctgctttgcg 2880
aaatccgcat tcccgtacca tcccaatacg ttggatgggc gtttgaggaa gtcgcgcggc 2940
ggcatggcga tttcgcacaa tgcggcgccg cagttctgat cggcgctgag gataggaaga 3000
tcgattatgc gcgcatagcc ctttgcagca ttggcgaaac gccgatccgt ttccatgctc 3060
tggagcaatg gcttatcggc aggccggtcg gaaatgatct gcctgcagat gtaaagctcc 3120
attgccgcga aatcctcgac gttgcggagg actcgacgat gactgccgag aacagggcga 3180
agcttgcctc cgccgtgact tccagagcca tcgccagggc cgcagaccgg attgttcatc 3240
tcgatgtaaa gagaggttga agttatgagc agtcacgtaa tttctcttac cgtcaacggc 3300
caagcaattg aacgaaaagt ggacagcaga actttgctgg cggatttcct gcgcgacgag 3360
ttgcgcctca ccgggaccca tgtcggttgc gaacatggcg tgtgtggcgc atgcacaatc 3420
cagtttgatg gggaaccggc acgcagttgt ttgatgcttg cggttcaggc cgaaggccat 3480
tcgatccgga ctgtcgaagc cttggccgtc gatggctgtt tgggagcgct ccagcaggca 3540
ttccatgaaa aacacggtct tcagtgcggg ttttgtacgc ctggcctgct aatgacactg 3600
gactacgcgc tgacagcgga tcttcacatt gacttttcaa gcgacaagga aattcgagag 3660
ctcatttccg gaaacctttg tcgttgcacg ggctaccaga acataatcaa cgcaataaag 3720
tccgtttctc ctacgactga aattgcaaag agtgaggaac ttgtatga 3768
<210> 2
<211> 791
<212> PRT
<213> Pseudomonas sp. Strain CBB1
<400> 2
Met Phe Ala Asp Ile Asn Lys Gly Asp Ala Phe Gly Thr Trp Val Gly
1 5 10 15
Lys Ser Val Pro Arg Arg Glu Asp Ala Asp Ile Leu Ala Gly Arg Ala
20 25 30
Glu Tyr Ile Ala Asp Ile Lys Leu Pro Gly Met Leu Glu Ala Ala Phe
35 40 45
Leu Arg Ser Pro Phe Ala His Ala Arg Ile Val Ser Ile Asp Val Ser
50 55 60
Gln Ala Leu Ala Leu Pro Gly Val Tyr Asp Val Met Val Gly Ala Asp
65 70 75 80
Ile Pro Asp Tyr Val Lys Pro Leu Pro Leu Met Ile Thr Tyr Gln Asn
85 90 95
His Arg Glu Thr Pro Thr Ser Pro Leu Ala Arg Asp Ile Val Arg Tyr
100 105 110
Ala Gly Glu Pro Val Ala Val Val Ala Ala Ile Asn Arg Tyr Val Ala
115 120 125
Glu Asp Ala Leu Glu Leu Ile Val Val Lys Tyr Glu Glu Leu Pro Val
130 135 140
Val Ala Ser Ile Asp Ala Ser Leu Ala Val Asp Gly Pro Arg Leu Tyr
145 150 155 160
Glu Gly Trp Pro Asp Asn Val Val Ala Lys Val Ser Ser Glu Ile Gly
165 170 175
Asp Val Asp Ala Ala Met Ala Ser Ala Asp Leu Val Phe Glu Glu Arg
180 185 190
Phe Glu Ile Gln Arg Cys His Pro Ala Pro Leu Glu Thr Arg Gly Phe
195 200 205
Ile Ala Gln Trp Asp Phe Lys Gly Glu Asn Leu Asn Val Trp Asn Gly
210 215 220
Thr Gln Ile Ile Asn Gln Cys Arg Asp Phe Met Ser Glu Val Leu Asp
225 230 235 240
Ile Pro Ala Ser Lys Ile Arg Ile Arg Ser Pro Arg Leu Gly Gly Gly
245 250 255
Phe Gly Ala Lys Phe His Phe Tyr Val Glu Glu Pro Ala Ile Val Leu
260 265 270
Leu Ala Lys Arg Val Lys Ala Pro Val Arg Trp Ile Glu Asp Arg Leu
275 280 285
Glu Ala Phe Ser Ala Thr Val His Ala Arg Glu Gln Val Ile Asp Val
290 295 300
Lys Leu Cys Ala Met Asn Asp Gly Arg Ile Thr Gly Ile Val Ala Asp
305 310 315 320
Ile Lys Gly Asp Leu Gly Ala Ser His His Thr Met Ser Met Gly Pro
325 330 335
Val Trp Leu Thr Ser Val Met Met Thr Gly Val Tyr Leu Ile Pro Asn
340 345 350
Ala Arg Ser Val Ala Lys Ala Ile Val Thr Asn Lys Pro Pro Ser Gly
355 360 365
Ser Tyr Arg Gly Trp Gly Gln Pro Gln Ala Asn Phe Ala Val Glu Arg
370 375 380
Met Val Asp Leu Leu Ala His Lys Leu Gln Leu Asp Pro Ala Ala Val
385 390 395 400
Arg Arg Ile Asn Tyr Val Pro Glu Ala Arg Met Pro Tyr Thr Gly Leu
405 410 415
Ala His Thr Phe Asp Ser Gly Arg Tyr Glu Val Leu His Asp Arg Ala
420 425 430
Leu Lys Thr Phe Gly Tyr Glu Ala Trp Leu Glu Arg Gln Ala Ala Ala
435 440 445
Gln Ala Gln Gly Arg Arg Ile Gly Ile Gly Met Ser Phe Tyr Ala Glu
450 455 460
Val Ser Ala His Gly Pro Ser Arg Phe Leu Asn Tyr Val Gly Gly Arg
465 470 475 480
Gln Gly Gly Tyr Asp Ile Ala Arg Ile Arg Met Asp Thr Thr Gly Asp
485 490 495
Val Tyr Val Tyr Thr Gly Leu Cys Asp Met Gly Gln Gly Val Thr Asn
500 505 510
Ser Leu Ala Gln Ile Ala Ala Asp Ala Leu Gly Leu Asn Pro Asp Asp
515 520 525
Val Thr Val Met Thr Gly Asp Thr Ala Leu Asn Pro Tyr Thr Gly Trp
530 535 540
Gly Thr Gly Ala Ser Arg Ser Ile Thr Ile Gly Gly Pro Ala Val Met
545 550 555 560
Arg Ala Ala Thr Arg Leu Arg Glu Lys Ile Leu Ser Ile Ala Arg His
565 570 575
Trp Leu Gln Ala Asp Pro Asp Thr Leu Val Leu Ala Asn Arg Gly Val
580 585 590
Met Val Arg Asp Asp Pro Gly Arg Tyr Val Ser Phe Ala Ser Ile Gly
595 600 605
Arg Ala Ala Tyr Cys Gln Ile Ile Glu Leu Pro Glu Asp Val Glu Pro
610 615 620
Gly Leu Glu Ala Val Gly Val Phe Asp Thr Val Gln Leu Ala Trp Pro
625 630 635 640
Tyr Gly Met Asn Leu Val Ala Val Glu Val Asp Glu Asp Thr Gly Ala
645 650 655
Val Ser Phe Leu Asp Cys Met Leu Val His Asp Met Gly Thr Ile Val
660 665 670
Asn Pro Met Ile Val Asp Gly Gln Leu His Gly Gly Ile Ala Gln Gly
675 680 685
Ile Ala Gln Ala Leu Tyr Glu Glu Leu Arg Tyr Asp Glu Asn Gly Gln
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Leu Gly Thr Gly Ser Phe Ala Asp Phe Leu Met Pro Thr Ala Ser Glu
705 710 715 720
Ile Pro Asn Met Arg Phe Asp His Met Val Thr Glu Ser Pro Leu Ile
725 730 735
Pro Gly Gly Met Lys Gly Val Gly Glu Gly Gly Thr Ile Gly Thr Pro
740 745 750
Ala Ala Val Val Asn Ala Ile Glu Asn Ala Leu Arg Pro Ile Thr Asn
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Ile Ser Ala Gly Ala Cys Ala
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<211> 295
<212> PRT
<213> Pseudomonas sp. Strain CBB1
<400> 3
Met Lys Pro Thr Ala Phe Asp Tyr Ile Arg Pro Thr Ser Leu Pro Glu
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ile Leu Ala Glu His Ser Asp Asp Val Ala Ile Leu Ala
20 25 30
Gly Gly Gln Ser Leu Met Pro Leu Leu Asn Phe Arg Met Ser Arg Pro
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Ala Leu Val Leu Asp Ile Asn Asp Ile Ser Glu Leu Gln Gln Val Arg
50 55 60
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65 70 75 80
Val Glu Gln Glu Glu Ile Phe Arg Ser Thr Ile Pro Leu Met Ser Glu
85 90 95
Ala Met Thr Ser Val Ala His Ile Gln Ile Lys Thr Arg Gly Thr Leu
100 105 110
Gly Gly Asn Leu Cys Asn Ala His Pro Ala Ser Glu Met Pro Ala Val
115 120 125
Ile Thr Ala Leu Gly Ala Ser Met Val Cys Lys Ser Glu Lys Arg Gly
130 135 140
Glu Arg Val Leu Thr Pro Glu Glu Phe Phe Glu Gly Ala Leu Gln Asn
145 150 155 160
Gly Leu Gln Ser Asp Glu Leu Leu Cys Glu Ile Arg Ile Pro Val Pro
165 170 175
Ser Gln Tyr Val Gly Trp Ala Phe Glu Glu Val Ala Arg Arg His Gly
180 185 190
Asp Phe Ala Gln Cys Gly Ala Ala Val Leu Ile Gly Ala Glu Asp Arg
195 200 205
Lys Ile Asp Tyr Ala Arg Ile Ala Leu Cys Ser Ile Gly Glu Thr Pro
210 215 220
Ile Arg Phe His Ala Leu Glu Gln Trp Leu Ile Gly Arg Pro Val Gly
225 230 235 240
Asn Asp Leu Pro Ala Asp Val Lys Leu His Cys Arg Glu Ile Leu Asp
245 250 255
Val Ala Glu Asp Ser Thr Met Thr Ala Glu Asn Arg Ala Lys Leu Ala
260 265 270
Ser Ala Val Thr Ser Arg Ala Ile Ala Arg Ala Ala Asp Arg Ile Val
275 280 285
His Leu Asp Val Lys Arg Gly
290 295
<210> 4
<211> 167
<212> PRT
<213> Pseudomonas sp. Strain CBB1
<400> 4
Met Ser Ser His Val Ile Ser Leu Thr Val Asn Gly Gln Ala Ile Glu
1 5 10 15
Arg Lys Val Asp Ser Arg Thr Leu Leu Ala Asp Phe Leu Arg Asp Glu
20 25 30
Leu Arg Leu Thr Gly Thr His Val Gly Cys Glu His Gly Val Cys Gly
35 40 45
Ala Cys Thr Ile Gln Phe Asp Gly Glu Pro Ala Arg Ser Cys Leu Met
50 55 60
Leu Ala Val Gln Ala Glu Gly His Ser Ile Arg Thr Val Glu Ala Leu
65 70 75 80
Ala Val Asp Gly Cys Leu Gly Ala Leu Gln Gln Ala Phe His Glu Lys
85 90 95
His Gly Leu Gln Cys Gly Phe Cys Thr Pro Gly Leu Leu Met Thr Leu
100 105 110
Asp Tyr Ala Leu Thr Ala Asp Leu His Ile Asp Phe Ser Ser Asp Lys
115 120 125
Glu Ile Arg Glu Leu Ile Ser Gly Asn Leu Cys Arg Cys Thr Gly Tyr
130 135 140
Gln Asn Ile Ile Asn Ala Ile Lys Ser Val Ser Pro Thr Thr Glu Ile
145 150 155 160
Ala Lys Ser Glu Glu Leu Val
165
<210> 5
<211> 3768
<212> DNA
<213> 人工序列
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atgttcgcgg atataaacaa aggcgacgcc ttcggtacct gggtcggaaa aagcgtaccg 60
cgtcgcgagg atgcggatat ccttgcaggg cgagccgagt acattgccga tatcaagctt 120
cctggcatgc ttgaggccgc gttcctgcgt agtccgtttg ctcatgctag gatcgtctcg 180
atagacgtct cacaagccct ggctctgcct ggtgtgtacg acgtcatggt gggcgcggat 240
attccggact atgtcaaacc gcttcccctc atgattacct accagaacca tcgcgaaacc 300
ccgacttccc cgctggcccg agacatcgtt cgctatgccg gtgctccggt cgctgtggtc 360
gccgcgataa atcgctatgt cgcagaagat gcactggagt tgatcgtcgt caaatatgag 420
gaattgcctg tcgtcgcttc catcgatgct tcgcttgctg ttgacgggcc acgtctctat 480
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gctccgctcg agacgcgcgg cttcatcgcg caatgggact tcaagggcga gaacttgaat 660
gtctggaatg gtacgcagat catcaatcag tgccgtgatt tcatgtcgga agtgctggat 720
attccggcca gcaagatacg catcagatcg ccccgtttgg gtggaggctt cggtgcgaaa 780
tttcatttct acgtcgaaga acccgcgatc gtgctccttg ccaagcgggt caaggcaccg 840
gtgcgctgga tagaagaccg gctggaggct ttttcggcga cagttcacgc ccgcgagcaa 900
gtcatcgacg tcaaactctg tgccatgaac gacgggcgca ttaccggcat tgtcgcggac 960
ataaaaggcg atctcggcgc gagccatcat acaatgtcga tgggaccggt ctggctgact 1020
tcggtgatga tgacgggtgt ctatttgatc ccgaacgcac gttccgtcgc aaaggcgatt 1080
gtaaccaaca agccgccgtc aggttcctat cgcggctggg gacagcctca ggcaaacttt 1140
gcagtcgaac ggatggtgga tcttttggcg cacaaactcc agcttgatcc ggctgcggtg 1200
cggcggatca attacgtgcc tgaagccaga atgccttaca ccggtcttgc tcatacgttc 1260
gacagcggcc ggtatgaggt attgcatgac agagcactga agacgttcgg ctacgaggca 1320
tggttggagc gccaggcagc agcgcaggcc caaggacggc gtattgggat cggaatgtcg 1380
ttttacgccg aggttagcgc ccatggccca tcgcgttttc ttaattatgt tggtggacgg 1440
caaggtggtt acgacattgc acgtattcgg atggatacga ccggtgatgt gtatgtctac 1500
acaggcctct gcgacatggg tcagggcgtg accaatagct tggcgcaaat agctgccgat 1560
gcgttaggtt tgaatcctga tgacgtgacg gtaatgacgg gagatacggc ccttaacccc 1620
tacaccggct ggggcacagg ggctagccgt tcgatcacta tcggcggtcc ggctgtcatg 1680
cgcgcggcga cgcgtttgcg ggaaaagata ctctctattg ctcgtcattg gcttcaggcc 1740
gatccggata cgttagttct ggcaaatcgc ggcgtcatgg tgcgcgacga tccgggtcgt 1800
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gactgcatgc tggttcacga catgggaacg atcgtcaatc cgatgatcgg agatggccaa 2040
cttcacggcg gaattgctga gggcatcgca caggctctct atcgcgagtt gcgctatgac 2100
gagaacggtc aactagggac aggctccttt gcggacttcc tgatgcctac agccagcgaa 2160
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atcttgaccg ccatttctgc cggagcatgc gcatgaaacc taccgcgttt gactatattc 2400
ggccgaccag cttgccagaa gcgctcgcaa tcctggccga acattccgac gatgtcgcta 2460
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<210> 6
<211> 791
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
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Lys Ser Val Pro Arg Arg Glu Asp Ala Asp Ile Leu Ala Gly Arg Ala
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Glu Tyr Ile Ala Asp Ile Lys Leu Pro Gly Met Leu Glu Ala Ala Phe
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Leu Arg Ser Pro Phe Ala His Ala Arg Ile Val Ser Ile Asp Val Ser
50 55 60
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Ile Pro Asp Tyr Val Lys Pro Leu Pro Leu Met Ile Thr Tyr Gln Asn
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100 105 110
Ala Gly Lys Pro Val Ala Val Val Ala Ala Ile Asn Arg Tyr Val Ala
115 120 125
Glu Asp Ala Leu Glu Leu Ile Val Val Lys Tyr Glu Glu Leu Pro Val
130 135 140
Val Ala Ser Ile Asp Ala Ser Leu Ala Val Asp Gly Pro Arg Leu Tyr
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Glu Gly Trp Pro Asp Asn Val Val Ala Lys Val Ser Ser Glu Ile Gly
165 170 175
Asp Val Asp Ala Ala Met Ala Ser Ala Asp Leu Val Phe Glu Glu Arg
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Ile Pro Ala Ser Lys Ile Arg Ile Arg Ser Pro Arg Leu Gly Gly Gly
245 250 255
Phe Gly Ala Lys Phe His Phe Tyr Val Glu Glu Pro Ala Ile Val Leu
260 265 270
Leu Ala Lys Arg Val Lys Ala Pro Val Arg Trp Ile Glu Asp Arg Leu
275 280 285
Glu Ala Phe Ser Ala Thr Val His Ala Arg Glu Gln Val Ile Asp Val
290 295 300
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370 375 380
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Gln Ala Gln Gly Arg Arg Ile Gly Ile Gly Met Ser Phe Tyr Ala Glu
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485 490 495
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515 520 525
Val Thr Val Met Thr Gly Asp Thr Ala Leu Asn Pro Tyr Thr Gly Trp
530 535 540
Gly Thr Gly Ala Ser Arg Ser Ile Thr Ile Gly Gly Pro Ala Val Met
545 550 555 560
Arg Ala Ala Thr Arg Leu Arg Glu Lys Ile Leu Ser Ile Ala Arg His
565 570 575
Trp Leu Gln Ala Asp Pro Asp Thr Leu Val Leu Ala Asn Arg Gly Val
580 585 590
Met Val Arg Asp Asp Pro Gly Arg Tyr Val Ser Phe Ala Ser Ile Gly
595 600 605
Arg Ala Ala Tyr Cys Gln Ile Ile Glu Leu Pro Glu Asp Val Glu Pro
610 615 620
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625 630 635 640
Tyr Gly Met Asn Leu Val Ala Val Glu Val Asp Glu Asp Thr Gly Ala
645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
Ile Ala Gln Ala Leu Tyr Arg Glu Leu Arg Tyr Asp Glu Asn Gly Gln
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740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
Ile Ser Ala Gly Ala Cys Ala
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<213> 人工序列
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Ala Leu Val Leu Asp Ile Asn Asp Ile Ser Glu Leu Gln Gln Val Arg
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<212> DNA
<213> Coffea arabica
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tgcatttact cttccaaagc aagtggtccg cccatcaaga aggcatattt ggatcaattt 600
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atgctcctta ctttcatttg taaagaagat gaattcgacc acccgaattc catggacttg 720
cttgagatgt caataaacga cttggttatt gagggacatc tggaggaaga aaaattggat 780
agcttcaatg ttccaatcta tgcaccttca acagaagaag taaagcgcat agttgaggag 840
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tctattgatg atgattacca aggaagatcc cattcccctg tatcctgcga tgaacatgct 960
agagcagcgc atgtggcatc tgtcgttaga tcaatttacg aacccatcct cgcgagtcat 1020
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<213> Coffea arabica
<400> 9
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tacagcagac tcttccccga ggagtccatg cattttttac actcttgtta ctgtttgcat 480
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acgaaagatt ttaccacatt tcttaggatt cattcggaag agttgatttc acgtggccga 660
atgctcctta ctgcaatttg taaagaagat gaattcgacc acccgaattc catggacttg 720
cttaagatgt caatattaga cttggttatt gagggacatc tggaggaaga aaaattggat 780
agcttcaatg ttccaatcta tgcaccttca acagaagaag taaagcgcat agttgaggag 840
gaaggttctt ttgaaatttt atacctggag actttttatg ccccttatga tgctggcttc 900
tctattgatg atgattacca aggaagatcc cattcccctg tatcctgcga tgaacatgct 960
agagcagcgc atgtggcatc tgtcgttaga tcaatttacg aacccatcct cgcgagtcat 1020
tttggagaag ctattttacc tgacttatcc cacaggattg cgaagaatgc agcaaaggtt 1080
ctccgctcgg gcaaaggctt ctatgatagt gttatcattt ctctcgccaa aaagccggag 1140
aaggcagaca tgtaa 1155
<210> 11
<211> 384
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Met Glu Leu Gln Glu Val Leu His Met Asn Gly Gly Glu Gly Asp Thr
1 5 10 15
Ser Tyr Ala Lys Asn Ser Ser Tyr Asn Leu Phe Leu Ile Arg Val Lys
20 25 30
Pro Val Leu Glu Gln Cys Ile Gln Glu Leu Leu Arg Ala Asn Leu Pro
35 40 45
Asn Ile Asn Lys Cys Phe Lys Val Gly Arg Leu Gly Cys Ala Ser Gly
50 55 60
Pro Asn Thr Phe Ala Thr Val Arg Asp Ile Val Gln Ser Ile Asp Lys
65 70 75 80
Val Gly Gln Glu Lys Lys Asn Glu Leu Glu Arg Pro Thr Ile Gln Ile
85 90 95
Phe Leu Asn Asp Leu Phe Gln Asn Asp Phe Asn Ser Val Phe Lys Leu
100 105 110
Leu Pro Ser Phe Tyr Arg Asn Leu Glu Lys Glu Asn Gly Arg Lys Ile
115 120 125
Gly Ser Cys Leu Ile Gly Ala Met Pro Gly Ser Phe Tyr Ser Arg Leu
130 135 140
Phe Pro Glu Glu Ser Met His Phe Leu His Ser Cys Tyr Cys Leu His
145 150 155 160
Trp Leu Ser Gln Val Pro Ser Gly Leu Val Thr Glu Leu Gly Ile Ser
165 170 175
Ala Asn Lys Gly Cys Ile Tyr Ser Ser Lys Ala Ser Gly Pro Pro Ile
180 185 190
Lys Lys Ala Tyr Leu Asp Gln Phe Thr Lys Asp Phe Thr Thr Phe Leu
195 200 205
Arg Ile His Ser Glu Glu Leu Ile Ser Arg Gly Arg Met Leu Leu Thr
210 215 220
Ala Ile Cys Lys Glu Asp Glu Phe Asp His Pro Asn Ser Met Asp Leu
225 230 235 240
Leu Lys Met Ser Ile Leu Asp Leu Val Ile Glu Gly His Leu Glu Glu
245 250 255
Glu Lys Leu Asp Ser Phe Asn Val Pro Ile Tyr Ala Pro Ser Thr Glu
260 265 270
Glu Val Lys Arg Ile Val Glu Glu Glu Gly Ser Phe Glu Ile Leu Tyr
275 280 285
Leu Glu Thr Phe Tyr Ala Pro Tyr Asp Ala Gly Phe Ser Ile Asp Asp
290 295 300
Asp Tyr Gln Gly Arg Ser His Ser Pro Val Ser Cys Asp Glu His Ala
305 310 315 320
Arg Ala Ala His Val Ala Ser Val Val Arg Ser Ile Tyr Glu Pro Ile
325 330 335
Leu Ala Ser His Phe Gly Glu Ala Ile Leu Pro Asp Leu Ser His Arg
340 345 350
Ile Ala Lys Asn Ala Ala Lys Val Leu Arg Ser Gly Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Asp Ser Val Ile Ile Ser Leu Ala Lys Lys Pro Glu Lys Ala Asp Met
370 375 380

Claims (10)

1.一种制备1,3,7,9-四甲基尿酸的方法，其包括下述步骤：1)以咖啡因为原料，用咖啡因脱氢酶或者其突变体催化生成1,3,7-三甲基尿酸；2)以步骤1)中所得1,3,7-三甲基尿酸为原料，用氨基酸序列为SEQ ID NO:9的双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶、或者其突变体SEQID NO:11催化生成1,3,7,9-四甲基尿酸，其中所述咖啡因脱氢酶的氨基酸序列由大亚基SEQ ID NO:2、中亚基SEQ ID NO:3、小亚基SEQ ID NO:4组成，所述咖啡因脱氢酶突变体的氨基酸序列由大亚基SEQ ID NO:6、中亚基SEQ ID NO:7、小亚基SEQ ID NO:4组成。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中加入辅酶Q0。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中使用所述咖啡因脱氢酶突变体，其氨基酸序列由大亚基SEQ ID NO:6、中亚基SEQ ID NO:7、小亚基SEQ ID NO:4组成；步骤2)中使用双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶的突变体SEQ ID NO:11。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述咖啡因脱氢酶或者其突变体和/或所述双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶或者其突变体呈微生物菌体形式。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，咖啡因脱氢酶突变体的编码基因是SEQ IDNO:5。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，双甲基黄嘌呤-N-甲基转移酶突变体SEQ IDNO:11的编码基因是SEQ ID NO:10。
7.包含如权利要求5或6所述基因的质粒。
8.转化了如权利要求7所述质粒的微生物。
9.如权利要求8所述的微生物，所述微生物选自大肠杆菌、酵母、枯草杆菌。
10.如权利要求8所述的微生物，其为大肠杆菌BL21(DE3)。
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