CN107271678B - 肾病发展风险的诊断试剂盒制造用途及辅助诊断方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供第1捕获体、第2捕获体和标记物质用于制造诊断肾病发展风险用试剂盒的用途。第1捕获体及，第2捕获体与肾病前期的糖尿病患者的尿中ApoA1特异性地结合。第1捕获体、第2捕获体及标记物质用于肾病前期的糖尿病患者的尿中ApoA1浓度测定。尿中ApoA1浓度的值在指定的阈值以上时，上述患者被判断为发展成肾病的风险高，当上述尿中ApoA1浓度的值低于上述指定的阈值时，上述患者被判断为发展成肾病的风险低。

Description

肾病发展风险的诊断试剂盒制造用途及辅助诊断方法
【技术领域】
本发明涉及用于制造诊断肾病发展风险用试剂盒的各种试剂的用途、及在肾病前期的糖尿病患者中的辅助诊断肾病发展风险的方法。
【背景技术】
糖尿病性肾病是糖尿病的并发症之一，是经阶段发展的肾脏病。糖尿病性肾病的病期被分类为肾病前期(第1期)至透析疗法期(第5期)这5个期。在肾病前期(第1期)及早期肾病期(第2期)的阶段，患者几乎无自觉症状。但是，肾病如果发展，则终究成肾功能衰竭，透析治疗变得必要。透析治疗对于患者是大的负担。近年，需要透析治疗的患者数增加，伴随其的医疗费的增加成为问题。
在糖尿病性肾病中，如果可在初期的阶段开始适宜的治疗，则可恢复肾功能。但是，在更进晚期阶段，即使可由治疗延迟疾病的发展，也难使肾功能维持恢复。从而，在期望肾功能的恢复的初期的阶段发现有发展成糖尿病性肾病的风险的患者而积极进行治疗减轻患者将来的负担。另外，对于医疗费的削减也有大的贡献。
现在，在糖尿病性肾病的检查中，进行肾小球过滤量(GFR)及尿白蛋白值等的测定。另外，各种生物标志物也用于肾病的诊断。例如，在美国专利申请公开第2003/0017523号说明书中记载了基于尿中的载脂蛋白A1(ApoA1)，检查肾障碍。另外，在Gomo ZA.等人,High-Density Lipoprotein Apolipoproteins in Urine：II.Enzyme-LinkedImmunoassay of Apolipoprotein A-I,Clinical Chemistry,Vol.34,No.9,1781-1786(1988)中记载了，尿中的ApoA1浓度在健康者和有肾功能障碍的患者之间有1000倍以上的差异。结果，在Gomo ZA.等人,High-Density Lipoprotein Apolipoproteins in Urine：II.Enzyme-Linked Immunoassay of Apolipoprotein A-I,Clinical Chemistry,Vol.34,No.9,1781-1786(1988)中叙述展望，可能通过测定尿中ApoA1，区别健康者和无症状的肾病患者。在Patel ML.等人,Clinical Correlation between ApoB/Apo-A1 Ratio in Type 2Diabetic Nephropathy-A Tertiary Centre Experience,Int.J.Sci.Res.Pub,Vol.2,Issue 9,1-8(2012)中，对于血清中的载脂蛋白B(ApoB)和ApoA1的浓度比(血清ApoB/ApoA1比)达到糖尿病性肾病的初期指标的可能性进行了提示。
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
在Gomo ZA.等人,High-Density Lipoprotein Apolipoproteins in Urine：II.Enzyme-Linked Immunoassay of Apolipoprotein A-I,Clinical Chemistry,Vol.34,No.9,1781-1786(1988)中记载了可由尿中ApoA1浓度判别受试者现在是否健康或是否发生肾功能障碍。但是，在此文献中，对于基于尿中ApoA1浓度诊断肾病前期的糖尿病患者将来进一步发展成肾病的风险无任何记载或提示。如上所述，在初期的阶段发现，有发展成肾病的风险的糖尿病患者而开始治疗是重要的。从而，期望使这样的风险的诊断成为可能的手段的开发。
【解决课题的技术方案】
本发明提供下列物质用于制造诊断肾病发展风险用试剂盒的用途：
·与肾病前期的糖尿病患者的尿中ApoA1特异性地结合的第1捕获体，
·与肾病前期的糖尿病患者的尿中ApoA1特异性地结合的第2捕获体，及
·标记物质。
上述第1捕获体、上述第2捕获体及上述标记物质用于肾病前期的糖尿病患者的尿中ApoA1浓度测定，当上述尿中ApoA1浓度的值在指定的阈值以上时，上述患者被判断为发展成肾病的风险高，当上述尿中ApoA1浓度的值低于上述指定的阈值时，上述患者被判断为发展成肾病的风险低。
本发明提供辅助诊断肾病发展风险的方法，其包括测定肾病前期的糖尿病患者的尿中ApoA1浓度的工序，及当尿中ApoA1浓度的值在指定的阈值以上时，上述的患者被判断为发展成肾病的风险高，当尿中ApoA1浓度的值低于指定的阈值时，上述的患者被判断为发展成肾病的风险低的工序。
【发明效果】
本发明使对于肾病前期的糖尿病患者，诊断发展成肾病的风险变得可能。
【附图说明】
【图1】是显示在肾病前期的糖尿病患者中，在试样采集的6个月后发展成糖尿病性肾病的组及未发展成糖尿病性肾病的组的试样(尿)中的ApoA1及ApoB浓度的坐标图。
【图2】是显示在肾病前期的糖尿病患者中，在试样采集的6个月后发展成糖尿病性肾病的组及未发展成糖尿病性肾病的组的试样(血清)中的ApoA1及ApoB浓度的坐标图。
【图3A】是显示对于肾病前期的糖尿病患者用尿中ApoA1浓度判断肾病的发展风险时的判断精度的ROC(接受者操作特征)曲线。
【图3B】是显示对于早期肾病期的糖尿病患者用尿中ApoA1浓度判断肾病的发展风险时的判断精度的ROC曲线。
【图3C】是显示对于显性肾病期的糖尿病患者用尿中ApoA1浓度判断肾病的发展风险时的判断精度的ROC曲线。
【图4】是显示在肾病前期、早期肾病期及显性肾病期的糖尿病患者中，在试样采集的6个月后发展成糖尿病性肾病的组及未发展成糖尿病性肾病的组的试样(尿)中的ApoA1及ApoB浓度的坐标图。
【图5A】是显示本实施方式涉及的试剂盒的外观的一例的图。
【图5B】是显示本实施方式涉及的试剂盒的外观的一例的图。
【图5C】是显示本实施方式涉及的试剂盒的外观的一例的图。
【图5D】是显示本实施方式涉及的试剂盒的外观的一例的图。
【图5E】是显示本实施方式涉及的试剂盒的外观的一例的图。
【图5F】是显示本实施方式涉及的试剂盒的外观的一例的图。
【实施方式】
在本实施方式的诊断向肾病发展风险的方法(以下，也被称为“诊断方法”)中，首先，测定肾病前期的糖尿病患者的尿中载脂蛋白A1(ApoA1)浓度。
在本实施方式的诊断方法中，以肾病前期的糖尿病患者(以下，也被称为“受试者”)作为诊断的对象。肾病前期是糖尿病性肾病的病期之一，也被称为第1期。现在，糖尿病性肾病的病期分类参照慢性肾脏病(CKD)的重症度分类，如下述的表1所示。
【表1】
Figure BDA0001258288990000041
在本说明书中，肾病前期及第1期是指，在KDIGO(Kidney Disease：ImprovingGlobal Outcomes)2012 Clinical Practice Guideline for the Evaluation andManagement of Chronic Kidney Disease中记载的CKD重症度分类中的白蛋白尿区分是A1，并且GFR区分是G1、G2、G3a或G3b的病期(参照表1)。在本实施方式中，肾病前期的糖尿病患者是被诊断为糖尿病的患者，也可为尿白蛋白/肌酸酐(Cr)比低于30mg/gCr，并且推算GFR在30mL/min/1.73m2以上的患者。糖尿病的诊断法不特别限定，只要用公知的方法诊断即可。尿白蛋白及肌酸酐的测定法和推算GFR的算出法是在现有技术中公知的。
在本实施方式中，作为试样，使用从受试者采集的尿。从受试者采集的尿不受受试者的体调、就餐及服药的有无等特别限定。另外，尿的采集时期也不特别限定，使用早晨尿、随时尿及蓄尿的任一种均可。在本实施方式的方法中，尿的量有100～500μL左右就充分。
根据需要，也可对从受试者采集的尿进行预处理至使适宜于ApoA1浓度的测定。作为这样的预处理，可举出稀释、pH的调整、不溶性固体成分的除去等。例如，通过将尿和指定的pH的缓冲液混合，可进行尿的稀释和pH的调整。另外，可由离心分离将不溶性固体成分从尿除去。缓冲液只要在适宜于ApoA1浓度的测定的pH范围有缓冲作用，就不特别限定。例如，可举出Tris、MES、PIPES、TES、HEPES等的Good的缓冲液、磷酸缓冲生理盐水(PBS)等。当尿中存在无晶性盐类时，为了将其除去，也可向尿添加EDTA盐等的鳌合剂。以下，从受试者采集的尿及预处理的尿也称为“尿试样”。
ApoA1被知在血液中作为高比重脂蛋白质(HDL)的构成成分存在，但由肾功能的异常而ApoA1被排泄而在尿中也存在。在尿中ApoA1有在被巨噬细胞等的吞食细胞摄取的状态下存在的情况。或者，巨噬细胞自身也被报告产生载脂蛋白。在本实施方式中，作为尿的预处理，也可从摄取ApoA1的吞食细胞使ApoA1游离到尿中。从细胞使ApoA1游离的方法不特别限定，例如，可举出由表面活性剂的增溶、超声波破碎等。由表面活性剂的细胞的增溶，例如，可通过将从受试者采集的尿和含表面活性剂的缓冲液混合进行。含表面活性剂的缓冲液的添加量可适宜设定，但例如，也可添加尿量的1倍以上50倍以下的量、优选为尿量的1倍以上10倍以下的量。表面活性剂的种类只要不妨碍ApoA1的测定，就不特别限定。例如，可举出Triton X-100、Tween 20、辛基葡萄糖苷等。尿试样中的表面活性剂的终浓度可根据表面活性剂的种类适宜设定。例如，使用Triton X-100时，尿试样中的终浓度是0.001％(v/v)以上10％(v/v)以下，优选为0.01％(v/v)以上1％(v/v)以下。
尿中ApoA1浓度可由可取得反映尿试样中所含的ApoA1的浓度或量的值(以下，也称为“ApoA1的测定值”)的方法测定。作为这样的方法，优选使用与ApoA1特异性地结合的捕获体捕获ApoA1的方法。通过将由捕获体捕获的ApoA1用公知的方法检测，可取得ApoA1的测定值。作为与ApoA1特异性地结合的捕获体，例如，可举出抗体、适体等。在它们之中也特别优选抗体。抗体也可为单克隆抗体、多克隆抗体、及它们的片段(例如，Fab、F(ab')2等)的任一种。与ApoA1特异性地结合的抗体(以下，也称为“抗ApoA1抗体”)本身是在现有技术中公知的，一般是可得到的。
在本实施方式中，优选由使用抗ApoA1抗体的免疫学测定法测定尿中ApoA1浓度。作为免疫学测定法，例如，可举出酶联免疫吸附法(ELISA法)、免疫复合物转移测定方法(参照特开平1-254868号公报)、免疫比浊法、免疫层析法、乳胶凝集法等。也可使用ELISA试剂盒等的市售的测定用试剂盒。当作为测定工序的一例，对于由夹心ELISA法测定尿中ApoA1浓度时，接下来进行说明。
首先，在固相上形成含尿中的ApoA1、用于捕获ApoA1的抗体(以下，也称为“捕获用抗体”)和用于检测ApoA1的抗体(以下，也称为“检测用抗体”)的复合物。此复合物可通过将尿试样、捕获用抗体和检测用抗体混合形成。进而，通过使含复合物的溶液与可对捕获用抗体进行捕获的固相接触，可在固相上形成上述的复合物。或者，也可使用预先固定捕获用抗体的固相。即，通过使固定了捕获用抗体的固相和尿试样和检测用抗体接触，可在固相上形成上述的复合物。其中，当捕获用抗体及检测用抗体均为单克隆抗体时，优选表位互不同。
向固相固定捕获用抗体的实施方式不特别限定。例如，可使捕获用抗体和固相直接键合，也可使捕获用抗体和固相经别的物质间接结合。作为直接的结合，例如，可举出物理性的吸附等。作为间接的结合，例如，可举出经生物素和亲和素或链霉亲和素(以下也被称为“亲和素类”)的组合结合。此时，将捕获用抗体预先用生物素修饰，通过使亲和素类预先结合于固相，可经生物素和亲和素类的结合，使捕获用抗体和固相间接结合。
固相的原料不特别限定，例如，可从有机高分子化合物、无机化合物、生物体高分子等选择。作为有机高分子化合物，可举出乳胶、聚苯乙烯、聚丙烯等。作为无机化合物，可举出磁性体(氧化铁、氧化铬及铁素体等)、氧化硅、氧化铝、玻璃等。作为生物体高分子，可举出不溶性琼脂糖、不溶性葡聚糖、明胶、纤维素等。也可将这些中的2种以上组合使用。固相的形状不特别限定，例如，可举出粒子、膜、微平板、微管、试管等。
通过将在固相上形成的复合物用在现有技术中公知的方法检测，可取得在尿中的ApoA1的测定值。例如，当作为检测用抗体，使用用标记物质标记的抗体时，通过由该标记物质检测发生的信号，可取得ApoA1的测定值。或者，当使用对于检测用抗体的标记第二抗体时，也可同样地取得ApoA1的测定值。
在本实施方式中，在复合物的形成工序和复合物的检测工序之间，也可进行除去未形成复合物的未反应的游离成分的B/F(Bound/Free)分离。未反应的游离成分是指不构成复合物的成分。例如，可举出不与ApoA1结合的捕获用抗体及检测用抗体等。B/F分离的手段不特别限定，但如果固相是粒子，则可通过由离心分离仅回收捕获复合物的固相来进行B/F分离。如果固相是微平板或微管等的容器，则可通过除去含未反应的游离成分的液来进行B/F分离。另外，当固相是磁性粒子时，可通过在将磁性粒子用磁铁磁性约束的状态下由喷嘴吸除含未反应的游离成分的液来进行B/F分离。除去未反应的游离成分之后，也可将捕获复合物的固相用PBS等的适宜的水性介质清洗。
在本说明书中，“检测信号”包括定性检测信号的有无、对信号强度进行定量及半定量地检测信号的强度。半定量的检测是指，将信号的强度如“信号不发生”、“弱”、“中”、“强”等一样阶段性地表示。在本实施方式中，优选定量或半定量检测信号的强度。
标记物质只要发生能检测的信号，就不特别限定。例如，可为其本身发生信号的物质(以下，也称为“信号发生物质”)，也可为催化其他物质的反应而使信号发生的物质。作为信号发生物质，例如，可举出荧光物质、放射性同位元素等。作为催化其他物质的反应而发生检测可能的信号的物质，例如，可举出酶等。作为酶，可举出碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶等。作为荧光物质，可举出异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明、AlexaFluor(注册商标)等的荧光染料、GFP等的荧光蛋白质等。作为放射性同位元素，可举出125I、14C、32P等。在它们之中，作为标记物质，也优选酶，特别优选碱性磷酸酶及过氧化物酶。
检测信号的方法本身是在现有技术中公知的。在本实施方式中，只要适宜选择根据来源于上述的标记物质的信号的种类的测定方法即可。例如，标记物质是酶时，可通过使用分光光度计等的公知的装置测定通过使该酶的底物反应而发生的光、色等的信号进行。
酶的底物可根据该酶的种类从公知的底物适宜选择。例如，作为酶使用碱性磷酸酶时，作为底物，可举出CDP-Star(注册商标)(4-氯-3-(甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸2钠)、CSPD(注册商标)(3-(4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸2钠)等的化学发光底物、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)、5-溴-6-氯-吲哚基磷酸2钠、p-硝基苯基磷酸等的显色基质。另外，作为酶使用过氧化物酶时，作为底物，可举出亮氨醇及其衍生物等的化学发光基质、2,2'-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸铵)(ABTS)、1,2-亚苯基二胺(OPD)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)等的显色基质。
当标记物质是放射性同位素时，可使用闪烁计数器等的公知的装置测定作为信号的放射线。另外，当标记物质是荧光物质时，可使用荧光酶标仪等的公知的装置测定作为信号的荧光。再者，激发波长及荧光波长可根据使用的荧光物质的种类适宜决定。
信号的检测结果也可作为ApoA1的测定值使用。例如，当定量检测信号的强度时，可将信号强度的测定值本身或从该测定值取得的值作为ApoA1的测定值使用。作为从信号强度的测定值取得的值，例如，可举出从ApoA1的测定值减去阴性对照试样的测定值或背景的值的值等。阴性对照试样可适宜选择，例如，可举出从健康者得到的尿等。
在本实施方式中，也可制成显示对于ApoA1浓度已知的多个标准试样取得ApoA1的测定值，ApoA1浓度和ApoA1的测定值的关系的标准曲线。将从尿试样取得的ApoA1的测定值适用于此标准曲线，可取得尿中ApoA1浓度的值。另外，为了回避由尿量的误差，优选将取得的尿中ApoA1浓度的值由受试者的尿中肌酸酐浓度的值修正。具体而言，优选将尿中ApoA1浓度的值换算为肌酸酐每1g的ApoA1浓度(μg/gCr)。由此，可在待测样品间比较尿中ApoA1浓度的值。
在本实施方式中，也可由使用固定在磁性粒子上的捕获用抗体和经标记物质标记的检测用抗体的夹心ELISA法测定尿中ApoA1浓度。此时，测定也可使用HISCL系列(Sysmex株式会社制)等的市售的全自动免疫测定装置进行。
接下来，在本实施方式的方法中，基于尿中ApoA1浓度的值，判断作为受试者的肾病前期的糖尿病患者发展成肾病的风险高或低与否。具体而言，当尿中ApoA1浓度的值在指定的阈值以上时，受试者可被判断为发展成肾病的风险高。另外，当尿中ApoA1浓度的值低于指定的阈值时，受试者可被判断为发展成肾病的风险低。
由本实施方式的方法被判断为糖尿病性肾病的发展风险高时也可为如果受试者不接受治疗，则被预测为在指定的期间内病期向早期肾病期(第2期)往后发展。另外，当被判断为糖尿病性肾病的发展风险低时，也可为即使受试者未受治疗，也被预测为在指定的期间内无病期向早期肾病期(第2期)往后发展。作为指定的期间，例如可举出12个月、优选为6个月的期间。这样，本实施方式的方法使对于医师等，辅助糖尿病性肾病的发展风险的诊断的信息的提供成为可能。再者，在“基于科学根据的糖尿病诊疗指南2013”(日本糖尿病学会)中，作为肾病的发症预防指导严格的血糖管理和血压管理。如果迁移到表示微量白蛋白尿的早期肾病期，则指导由血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体拮抗药的治疗投药。在由本发明在肾病前期的阶段被诊断为发展风险高的糖尿病患者中，可早期投药ACE抑制剂、血管紧张素II受体拮抗药而预防肾病的发展。
上述的指定的阈值不特别限定，可适宜设定。例如，也可通过对于肾病前期的糖尿病患者蓄积包括尿中ApoA1浓度的值的关于肾功能的数据，依经验设定指定的阈值。或者，也可如以下一样设定指定的阈值。首先，从多个肾病前期的糖尿病患者采集尿，测定尿中ApoA1浓度。从尿的采集起经过指定的期间后，对于这些患者进行关于肾功能的检查，确认糖尿病性肾病的病期。将测定的尿中ApoA1浓度的数据分类为糖尿病性肾病向早期肾病期(第2期)往后发展的患者组的数据和未发展成糖尿病性肾病的患者组的数据。进而，求出能最精确区别发展成糖尿病性肾病的患者组的尿中ApoA1浓度和未发展成糖尿病性肾病的患者组的尿中ApoA1浓度的值，以该值作为指定的阈值设定。在阈值的设定中，优选考虑灵敏度、特异性、阳性的中率、阴性的中率等。
在本发明的范围中，也包括在上述的肾病的发展风险的诊断方法中使用的试剂盒。即，本发明提供含用于捕获ApoA1的与ApoA1特异性地结合的第1捕获体和用于检测ApoA1的与ApoA1特异性地结合的第2捕获体和标记物质的，在肾病前期的糖尿病患者中的诊断肾病发展风险用试剂盒(以下，也称为“试剂盒”)。当标记物质是酶时，本实施方式的试剂盒也可还含该酶的底物。
在本实施方式中，第1捕获体、第2捕获体、标记物质及底物的形态不特别限定，可为固体(例如，粉末、结晶、冷冻干燥品等)，也可为液体(例如，溶液、悬浮液、乳浊液等)。在本实施方式中，第1捕获体、第2捕获体、标记物质及基质优选各自保存在不同的容器中或个别地包装。再者，对于尿试样、第1捕获体、第2捕获体、标记物质及基质的详细内容与在上述的诊断方法的说明中所述的同样。在本实施方式中，优选第1捕获体及第2捕获体均为抗ApoA1抗体。当第1捕获体及第2捕获体均为单克隆抗体时，优选表位互不同。
在本实施方式中，也可将收容上述的各种试剂的容器捆包到箱中，向使用者提供。在此箱中，也可同装试剂盒的附带文书。在此附带文书中，例如，优选记载了试剂盒的构成、尿中ApoA1浓度的测定流程等。图5A显示本实施方式的试剂盒的外观的一例。图中，10表示试剂盒，11表示收容第1捕获体的第1容器，12表示收容第2捕获体的第2容器，13表示收容作为标记物质的酶的第3容器，14表示收容酶的底物的第4容器，15表示附带文书，16表示捆包箱。
本实施方式的试剂盒也可还含用于对从受试者采集的尿进行预处理的预处理液。作为预处理液优选上述的缓冲液。预处理液也可含用于使摄取ApoA1的细胞增溶的表面活性剂。对于缓冲液及表面活性剂的详细内容与在上述的诊断方法的说明中所述的同样。在本实施方式中，第1捕获体、第2捕获体、标记物质、底物及预处理液优选各自储存在不同的容器中或个别地包装。图5B显示还含预处理液的试剂盒的外观的一例。再者，对于预处理液的详细内容与在上述的诊断方法的说明中所述的同样。图中，20表示试剂盒，21表示收容第1捕获体的第1容器，22表示收容第2捕获体的第2容器，23表示收容作为标记物质的酶的第3容器，24表示收容酶的底物的第4容器，25表示收容预处理液的第5容器，26表示附带文书，27表示捆包箱。
本实施方式的试剂盒也可还含用于使第1捕获体固定化的固相。此时，第1捕获体、第2捕获体、标记物质、底物及固相优选各自储存在不同的容器中或个别地包装。图5C显示还含固相的试剂盒的外观的一例。对于固相的详细详细内容与在上述的诊断方法的说明中所述的同样。图中，30表示试剂盒，31表示收容第1捕获体的第1容器，32表示收容第2捕获体的第2容器，33表示收容作为标记物质的酶的第3容器，34表示收容酶的底物的第4容器，35表示固相(96孔微平板)，36表示附带文书，37表示捆包箱。图5D显示还含预处理液的试剂盒的外观的一例。图中，40表示试剂盒，41表示收容第1捕获体的第1容器，42表示收容第2捕获体的第2容器，43表示收容作为标记物质的酶的第3容器，44表示收容酶的底物的第4容器，45表示收容预处理液的第5容器，46表示固相(96孔微平板)，47表示附带文书，48表示捆包箱。
在进一步的实施方式中，第1捕获体也可预先固定化到固相。再者，标记物质也可预先与第2捕获体结合。此时，试剂盒含使第1捕获体固定化的固相、使标记物质结合的第2捕获体、及底物。图5E显示所述试剂盒的外观的一例。图中，50表示试剂盒，51表示收容使作为标记物质的酶结合的第2捕获体的第1容器，52表示收容酶的底物的第2容器，53表示使第1捕获体固定化的固相(96孔微平板)，54表示附带文书，55表示捆包箱。图5F显示还含预处理液的试剂盒的外观的一例。图中，60表示试剂盒，61表示收容使作为标记物质的酶结合的第2捕获体的第1容器，62表示收容酶的底物的第2容器，63表示收容预处理液的第3容器，64表示使第1捕获体固定化的固相(96孔微平板)，65表示附带文书，66表示捆包箱。
本实施方式的试剂盒，除了上述的各种试剂之外，也可适宜含固相的清洗液、酶反应的停止剂、校准品等。
在本发明的范围中，也包括上述试剂用于制造肾病的发展风险的诊断用试剂盒的用途。即，本发明也涉及用于捕获ApoA1的与ApoA1特异性地结合的第1捕获体、用于检测ApoA1的与ApoA1特异性地结合的第2捕获体、及标记物质用于制造肾病的发展风险的诊断用试剂盒的用途。
接下来，将本发明由实施例详细地进行说明，但本发明不限于这些实施例。
【实施例】
【实施例1】
从作为肾病前期(第1期)的糖尿病患者的受试者采集血液及尿，在6个月后，将这些受试者分为发展成肾病的组和未发展成肾病的组。对各组的受试者的血中及尿中的ApoA1及ApoB浓度进行比较。再者，ApoB作为肾脏病的生物标志物被知。
(1)来自受试者的试样的采集
从尿白蛋白/Cr比低于30mg/gCr，并且GFR区分在30mL/min/1.73m2以上的糖尿病患者(n＝14)采集血液及尿作为试样。
(2)生物标志物的测定
(2.1)血清中的ApoA1、ApoB及肌酸酐的浓度的测定
使用ApoA-IAUT·N“第一”及ApoBAUT·N“第一”(均获自积水Medical株式会社)，从在上述(1)中得到的各受试者的血液测定血清中的ApoA1及ApoB的浓度。具体的操作根据试剂盒的附带文书。使用L系统·CRE(Sysmex株式会社)及CRE标准液(Sysmex株式会社)，从受试者的血液测定血清肌酸酐(sCR)的浓度。具体的操作根据试剂的附带文书。
(2.2)尿中的ApoA1、ApoB及肌酸酐的浓度的测定
将在上述(1)中得到的各受试者的尿和后述的试剂盒附带的Triton-X100/PBS等量混合之后，用待测样品稀释液稀释25倍。使用Human Apolipoprotein A1 ELISA Pro Kit(MABTECH AB公司)及Human Apolipoprotein B ELISA Pro Kit(MABTECH AB公司)，从稀释的尿测定尿中的ApoA1及ApoB的浓度。具体的操作，除了代替血清而使用稀释的尿之外，根据试剂盒的附带文书。使用L系统·CRE(Sysmex株式会社)及CRE标准液(Sysmex株式会社)，从受试者的尿测定尿中肌酸酐的浓度。具体的操作根据试剂的附带文书。为了修正由尿量的误差，使用尿中肌酸酐的浓度，将测定的尿中ApoA1及ApoB浓度换算为肌酸酐每1g的浓度(μg/gCr)。
(3)受试者的分类
从上述(1)的试样采集起6个月后，从受试者采集血液。使用L系统·CRE(Sysmex株式会社)及CRE标准液(Sysmex株式会社)，从得到的血液测定sCR浓度。根据下述的式从试样采集时的sCR的测定值和6个月后的sCR的测定值各自算出推算肾小球过滤量(eGFR)。式中，“Age”是受试者的年龄。
eGFR(mL/min/1.73m2)＝194×sCr-1.094×Age-0.287
(当受试者是女性时，eGFR＝194×sCr-0.739×Age-0.287)
根据下述的式从试样采集时的eGFR和6个月后的eGFR算出每1年间的eGFR的变化率(％)。以得到的变化率的值作为肾病的发展性指标(％)。将发展性指标在0以上的受试者分类为未发展成肾病的组(以下，也称为“非发展组”，n＝7)，将发展性指标低于0的受试者分类为发展成肾病的组(以下，也称为“发展组”，n＝7)。
变化率(％)＝[(6个月后的eGFR-试样采集时的eGFR)/(试样采集时的eGFR)]×测定日间间隔(日)×100/365
(4)结果
在非发展组及发展组中的尿中的ApoA1及ApoB浓度示于图1。如图1所示，发展组的尿中ApoA1浓度显著地高于非发展组的尿中ApoA1浓度。一方面，对于尿中ApoB浓度在发展组和非发展组之间未确认统计学显著差异。在非发展组及发展组中的血清中的ApoA1及ApoB浓度示于图2。如图2所示，对于血清中的ApoA1及ApoB浓度在发展组和非发展组之间未确认统计学显著差异。另外，对于血清ApoB/ApoA1比也在发展组和非发展组之间未确认了统计学显著差异。其中，Patel ML.等人,Clinical Correlation between ApoB/Apo-A1Ratio in Type 2 Diabetic Nephropathy-A Tertiary Centre Experience,Int.J.Sci.Res.Pub,Vol.2,Issue 9,1-8(2012)记载了血清ApoA1/ApoB比说不定会成为糖尿病性肾病的初期指标。但是，本实施例的结果显示，血清ApoB/ApoA1比无法在肾病前期(第1期)的糖尿病患者向肾病发展风险的判断中利用。
以上提示，可基于尿中ApoA1浓度，预测肾病前期(第1期)的糖尿病患者的向肾病发展风险。
【实施例2】
对于作为早期肾病期(第2期)及显性肾病期(第3期)的糖尿病患者的受试者，也探讨是否可由尿中ApoA1浓度预测肾病的发展风险。
(1)来自受试者的试样的采集
从尿白蛋白/Cr比低于30mg/gCr以上300mg/gCr，并且GFR区分在30mL/min/1.73m2以上的糖尿病患者(第2期，n＝6)及尿白蛋白/Cr比在300mg/gCr以上、并且GFR区分在30mL/min/1.73m2以上的糖尿病患者(第3期，n＝8)采集血液及尿作为试样。
(2)生物标志物的测定
与实施例1同样地测定尿中ApoA1浓度、血清及尿中肌酸酐浓度。另外，从尿中ApoA1浓度及尿中肌酸酐浓度算出肌酸酐每1g的尿中ApoA1浓度。
(3)受试者的分类及ROC解析
从上述(1)的试样采集起6个月后，从受试者采集血液，测定sCR浓度。与实施例1同样地，从试样采集时及6个月后的sCR浓度算出肾病的发展性指标(％)，将受试者分类为肾病的发展组和非发展组。由ROC(接受者操作特征)曲线解析研究对于第2期及第3期的受试者用尿中ApoA1浓度判断肾病的发展风险时的判断精度。为了比较，对于实施例1的肾病前期的受试者也同样地进行ROC解析。
(4)结果
ROC解析的结果由AUC(曲线下面积)的值评价。对于各病期的受试者的ROC曲线示于图3A(第1期)、图3B(第2期)及图3C(第3期)。各ROC曲线的AUC示于表2。另外，各病期的受试者的发展组及非发展组的尿中ApoA1浓度示于图4。
【表2】
病期 AUC
肾病前期(第1期) 0.968
早期肾病期(第2期) 0.444
显性肾病期(第3期) 0.500
如图3B、图3C及图4所示，对于早期肾病期(第2期)及显性肾病期(第3期)的糖尿病患者在基于尿中ApoA1浓度的肾病的发展风险的判断结果中无显著差异。一方面，如图3A及图4所示，对于肾病前期(第1期)的糖尿病患者，基于尿中ApoA1浓度判断发展成肾病的风险时，在其判断结果中有显著差异。
如上所述，Gomo ZA.等人,High-Density Lipoprotein Apolipoproteins inUrine：II.Enzyme-Linked Immunoassay of Apolipoprotein A-I,Clinical Chemistry,Vol.34,No.9,1781-1786(1988)报告在有肾功能障碍的患者和健康的受试者之间在尿中ApoA1浓度上有1000倍以上的差异。结果，Gomo ZA.等人提示，可由尿中ApoA1的测定区别无症状的肾病患者和健康的受试者的可能性。基于Gomo ZA.等人的议论，通常认为也可将作为在第2期往后的肾病患者和健康者的判别中使用的生物标志物的尿中ApoA1作为用于判别肾病前期的患者和健康者的标志物利用。但是，在本实施例中，得到了与这样的Gomo ZA.等人的教示相反的结果。本发明人令人惊讶地发现，作为无法在作为第2期往后的肾病的糖尿病患者的发展风险判断中利用的生物标志物的尿中ApoA1是在肾病前期的糖尿病患者的发展风险判断中极其有用的标志物。
【实施例3】
探讨是否由尿中ApoA1以外的肾脏病的生物标志物的尿中浓度也可判断向肾病前期(第1期)的糖尿病患者的肾病发展的风险。
(1)来自受试者的试样的采集
从尿白蛋白/Cr比低于30mg/gCr，并且GFR区分在30mL/min/1.73m2以上的糖尿病患者(n＝14)采集血液及尿作为试样。
(2)生物标志物的测定
作为尿中生物标志物，测定α1-微球蛋白(α1M)、Kidney injury molecule-1(KIM-1)、N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)、IV型胶原、尿白蛋白(uALB)、尿蛋白(uTP)、脂质运载蛋白-2(NGAL)及L型脂肪酸结合蛋白(LFABP)的尿中浓度。α1M浓度使用LZ测试‘荣研'α-1M(荣研化学株式会社)及尿中α-1M测定用LZ-α1-M标准‘荣研'(荣研化学株式会社)而根据附带文书进行测定。KIM-1浓度使用KIM-1(human)Elisa Kit(Enzo life sciences Inc.)而根据附带文书进行测定。NAG浓度使用L类型WAKONAG(和光纯药株式会社)及NAG校准品(和光纯药株式会社)而根据附带文书进行测定。IV型胶原使用CL-IV Plate Kit(协和PharmaChemical株式会社)而根据附带文书进行测定。uALB浓度使用LZ测试‘荣研'U-ALB(荣研化学株式会社)及LZ-U-ALB校准品‘荣研'(荣研化学株式会社)而根据附带文书进行测定。uTP使用微TP-AR(和光纯药株式会社)及蛋白标准液(蛋白100mg/dL、和光纯药株式会社)而根据附带文书进行测定。NGAL浓度，除了将尿用试剂盒附带的待测样品稀释液稀释50倍以外，使用NGAL(human)Elisa Kit(Enzo life sciences Inc.)而根据附带文书进行测定。LFABP浓度使用Nordia(注册商标)L-FABP(积水Medical株式会社)及L-FABP校准品(积水Medical株式会社)而根据附带文书进行测定。为了比较，尿中ApoA1及血清中ApoB的浓度也与实施例1同样地进行测定。尿中肌酸酐浓度使用L系统·CRE(Sysmex株式会社)及CRE标准液(Sysmex株式会社)而根据附带文书进行测定。为了修正由尿量的误差，使用尿中肌酸酐的浓度，将测定的各生物标志物的浓度换算为肌酸酐每1g的浓度(μg/gCr)。另外，与实施例1同样地，从受试者的血液测定sCr浓度。
(3)受试者的分类
从上述(1)的试样采集起6个月后，从受试者采集血液，测定sCR浓度。与实施例1同样地，从试样采集时及6个月后的sCR浓度算出肾病的发展性指标(％)，将受试者分类为肾病的发展组和非发展组。
(4)统计学解析
对于各生物标志物的浓度，研究在发展组和非发展组之间有统计学显著差异与否。具体而言，对于各生物标志物，确认数据的正规性，确认在发展组及非发展组中的分布是否相等。而且，检验发展组和非发展组的平均值的差是否相等。对于各生物标志物，将判断发展与否时的判断精度由ROC曲线解析研究，用AUC的值进行评价。另外，将可从尿中生物标志物的测定值预测6个月后的发展指标的值(血清肌酸酐值或eGFR值)与否用单次归分析评价。
(5)结果
解析结果示于表3。在表3中，在危险率P值低于0.05时有显著差异。另外，AUC的值越接近1，判断精度越高。再者，对于L-FABP，由于在肾病前期的全部试样中测定值是0(检测界限以下)，从而无法评价。
【表3】
Figure BDA0001258288990000181
如表3所示，尿中ApoA1的浓度的平均值在发展组和非发展组之间变化8倍以上，得知在两组之间有统计学显著差异。另外，AUC也超0.9，可从尿中ApoA1的浓度预测6个月后的eGFR的变化量。与此相比，ApoA1以外的生物标志物均在发展组和非发展组之间未确认统计学显著差异。这些生物标志物作为肾病的尿中标志物被知，但在这些之中，没有能判断肾病前期(第1期)的糖尿病患者向肾病的发展风险的标志物。
【工业实用性】
10、20、30、40、50、60 试剂盒
11、21、31、41、51、61 第1容器
12、22、32、42、52、62 第2容器
13、23、33、43、63 第3容器
14、24、34、44 第4容器
25、45 第5容器
15、26、36、47、54、65 附带文书
16、27、37、48、55、66 捆包箱
35、46、53、64 固相
本说明书还包括下列内容：
1.诊断肾病发展风险用试剂盒，其包含：
·与肾病前期的糖尿病患者的尿中ApoA1特异性地结合的第1捕获体；
·与肾病前期的糖尿病患者的尿中ApoA1特异性地结合的第2捕获体；及
·标记物质，
其中
上述第1捕获体、上述第2捕获体及上述标记物质用于肾病前期的糖尿病患者的尿中ApoA1浓度测定，
当上述尿中ApoA1浓度的值在指定的阈值以上时，上述患者被判断为发展成肾病的风险高，
当上述尿中ApoA1浓度的值低于上述指定的阈值时，上述患者被判断为发展成肾病的风险低。
2.实施方式1所述的试剂盒，其中上述第1捕获体是抗ApoA1抗体。
3.实施方式1所述的试剂盒，其中上述第2捕获体是抗ApoA1抗体。
4.实施方式1所述的试剂盒，其中肾病前期的糖尿病患者是尿白蛋白/肌酸酐比低于30mg/gCr、并且推算GFR在30mL/min/1.73m2以上的糖尿病患者。
5.实施方式1～4之任一项所述的试剂盒，其中尿中ApoA1浓度的值是由上述患者的尿中肌酸酐浓度的值修正的值。
6.辅助诊断肾病发展风险的设备，其包括：
测定肾病前期的糖尿病患者的尿中载脂蛋白A1(ApoA1)浓度的装置，及
当上述尿中ApoA1浓度的值在指定的阈值以上时，将上述患者判断为发展成肾病的风险高，当上述尿中ApoA1浓度的值低于上述指定的阈值时，将上述患者判断为发展成肾病的风险低的装置。
7.实施方式6所述的设备，其中上述尿中ApoA1浓度使用与ApoA1特异性地结合的捕获体进行测定。
8.实施方式7所述的设备，其中上述与ApoA1特异性地结合的捕获体是抗ApoA1抗体。
9.实施方式6所述的设备，其中肾病前期的糖尿病患者是尿白蛋白/肌酸酐比低于30mg/gCr、并且推算GFR在30mL/min/1.73m2以上的糖尿病患者。
10.实施方式6～9之任一项所述的设备，其中尿中ApoA1浓度的值是由上述患者的尿中肌酸酐浓度的值修正的值。

Claims (5)

1.辅助诊断肾病发展风险的装置，其包括：
测定部，其测定肾病前期的糖尿病患者的尿中载脂蛋白A1(ApoA1)浓度，及
判断部，其
当上述尿中ApoA1浓度的值在指定的阈值以上时，上述患者被判断为发展成肾病的风险高，
当上述尿中ApoA1浓度的值低于上述指定的阈值时，上述患者被判断为发展成肾病的风险低。
2.权利要求1所述的装置，其中上述尿中ApoA1浓度使用与ApoA1特异性地结合的捕获体进行测定。
3.权利要求2所述的装置，其中上述与ApoA1特异性地结合的捕获体是抗ApoA1抗体。
4.权利要求1所述的装置，其中肾病前期的糖尿病患者是尿白蛋白/肌酸酐比低于30mg/gCr、并且推算GFR在30mL/min/1.73m2以上的糖尿病患者。
5.权利要求1～4之任一项所述的装置，其中尿中ApoA1浓度的值是由上述患者的尿中肌酸酐浓度的值修正的值。
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