CN107267495B - 一种微生物载体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物固定技术领域，具体涉及一种微生物载体的制备方法。本发明利用多孔棉花秸秆作为模板，以EDTA为导向剂，提高羟基磷酸钙的纯度，制得多孔高负载量羟基磷酸钙载体，并在其表面负载苔藓为微生物生长提供场所和营养，利用羟基磷酸钙的良好机械性能和极佳的生物相容性，最终制得高生物负载量的微生物载体，弥补了常见微生物载体机械性能差，生物相容性低以及生物负载量少的缺陷，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物固定技术领域，具体涉及一种微生物载体的制备方法。
背景技术
固定化微生物技术自问世以来，显示出广阔的发展前景。固定化微生物在乙醇发酵工业上成果较为显著，固定化酵母菌用于发酵酒精与传统发酵工艺相比，具有速度快、周期短、生产能力高、工艺设备简单，易于实现连续化及自动化和产物容易提取等优点，并在一定程度上减少发酵工厂的设备投资和环境污染。
选择适宜的固定化微生物载体是实现工业化的关键，而载体的好坏又取决于载体的机械强度、寿命和包埋微生物细胞的容量和活性。固定载体中应用最广泛的是海藻酸钙，虽易成形、无毒、成本低廉，但强度差，使用寿命短。其它的一些天然高分子化合物，如琼脂，明胶和卡拉胶等，虽强度得到改善，但价格偏高。聚乙烯醇作为包埋载体的优点有机械强度高、化学性能稳定，但是其生物相容性差，对微生物的负载量小。
因此，发明一种既具有良好的生物相容性，又具有较强的机械强度的新型微生物载体对微生物固定技术领域具有积极的意义。
发明内容
本发明主要解决的技术问题，针对目前常见的微生物固定载体存在机械强度低、生物相容性差、微生物负载量低的缺陷，提供了一种微生物载体的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种微生物载体的制备方法，其特征在于具体制备步骤为：
（1）称取牡蛎壳放入水中加热煮沸处理，取出煮沸后的牡蛎壳粉碎得到牡蛎壳粉末，将牡蛎壳粉末和盐酸混合后搅拌反应，再离心处理，分离得到上层液，备用；
（2）称取棉花秸秆切割成小段，得到棉花秸秆段，将棉花秸秆段和沼液混合后静置微腐处理，微腐处理结束后粉碎并过50目筛，得到微腐棉花秸秆粉末；
（3）将微腐棉花秸秆粉末和无水乙醇混合后加热升温，搅拌反应后得到混合悬浮液，将五氧化二磷和混合悬浮液混合后超声分散处理，得到分散液，再用氨水调节分散液pH至9.0～9.5，得到前驱液；
（4）将备用的上层液和乙二胺四乙酸混合均匀得到滴加液，将滴加液滴入上述前驱液中，进行微波辐照处理，处理结束后静置陈化，过滤分离得到滤渣；
（5）将上述滤渣放入马弗炉中，保温煅烧，得到多孔羟基磷灰石支架，将细叶泥炭藓和水按等质量比混合后研磨，得到苔藓浆，将多孔羟基磷灰石支架和苔藓浆混合得到预处理混合物；
（6）将上述预处理混合物放入温室中，静置7～9天，静置结束后得到产物，用水冲洗产物15～20min，自然晾干后即得微生物载体。
根据权利要求1所述的一种微生物载体的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的煮沸处理时间为1～2h，牡蛎壳粉末和盐酸的质量比为1:5，盐酸的浓度为0.1mol/L，搅拌反应时间为1～2h，离心处理转速为2000～3000r/min，离心处理时间为10～15min。
步骤（2）中所述的小段的长度为1～2cm，棉花秸秆段和沼液的质量比为1:3，静置微腐处理的温度为35～45℃，静置微腐处理的时间为3～5天。
步骤（3）中所述的微腐棉花秸秆粉末和无水乙醇的质量比为1：10，加热升温后的温度为40～50℃，搅拌反应时间为1～2h，五氧化二磷和混合悬浮液的质量比为1:15，超声分散处理频率为30～40kHz，超声分散处理时间为30～40min。
步骤（4）中所述的上层液和乙二胺四乙酸的质量比20:1，滴加液和前驱液的质量比为1:3，微波辐照处理温度为40～50℃，微波辐照处理功率为450～550W，微波辐照处理时间为4～5h，静置陈化温度为4～6℃，静置陈化时间为5～8h。
步骤（5）中所述的保温煅烧温度为800～900℃，保温煅烧时间为3～4h，多孔羟基磷灰石支架和苔藓浆的质量比为1:3。
步骤（6）中所述的温室温度为20～25℃，空气相对湿度为60～70%，光照强度为800～900LX。
本发明的有益效果是：
（1）本发明以主要成分为碳酸钙的牡蛎壳作为原料，首先煮沸去除有机杂质，粉碎后和盐酸混合，搅拌反应，离心后得到以氯化钙为主的上层液，再以具有丰富内部孔隙结构的棉花秸秆为原料，将其和沼液混合，利用沼液中丰富的微生物对棉花秸秆进行微腐，进一步增加棉花秸秆的孔隙率和比表面积，得到微腐棉花秸秆，再将微腐棉花秸秆和乙醇混合，利用乙醇对其进行羟基化改性，增加了微腐棉花秸秆表面以及内部孔隙中的羟基数量，之后再加入五氧化二磷，利用五氧化二磷和乙醇反应生成磷脂，在氨水作用下，磷脂逐渐水解，磷脂水解产物上的羟基和微腐棉花表面以及内部孔隙中的羟基产生化学吸附，使得磷脂水解产物附着在微腐棉花秸秆的内部孔隙及表面上，再将以氯化钙为主的上层液和EDTA混合，利用EDTA作为导向剂，首先络合上层液中的金属离子，同时利用上层液中各种金属离子和EDTA之间络合稳定性的差异来去除杂质金属离子，提高钙离子的纯度，由于钙离子和EDTA的络合稳定性最差，使得磷脂水解产物上的磷酸根从EDTA金属离子络合物中最容易夺取钙离子，夺取的钙离子和磷脂水解产物上的羟基缓慢结合，产生晶核，随着时间增长逐渐长大，得到表面负载羟基磷酸钙的微腐棉花秸秆，最后高温煅烧去除微腐棉花秸秆模板即可得到高孔隙率的羟基磷灰石载体，再将载体和苔藓浆混合后在温室中培养，得到表面负载苔藓的高孔隙率羟基磷灰石，从而制得微生物载体，首先本发明的载体骨架为羟基磷灰石，而羟基磷灰石具有极佳的生物相容性，有效解决了常见微生物固定载体生物相容性差的问题，羟基磷酸钙相比于明胶、聚乙烯醇等载体，其机械强度也得到明显提高，又弥补了常见微生物载体机械强度低的缺陷；
（2）本发明将高孔隙率的羟基磷酸钙作为微生物载体骨架，可以为微生物提供更多的附着位点，提高了微生物的负载量，另外在羟基磷酸钙骨架外层还附着了一层苔藓层，苔藓层疏松多孔的结构又进一步增加了微生物附着的空间，再次提高了微生物载体的负载量，并且苔藓降解后的产物还能为微生物提供生长所需的营养物质，提高微生物的存活率，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
称取牡蛎壳放入水中加热煮沸处理1～2h，取出煮沸后的牡蛎壳放入气流粉碎机中粉碎30～40min得到牡蛎壳粉末，再按质量比为1:5将牡蛎壳粉末和浓度为0.1mol/L盐酸混合后搅拌反应1～2h，再用离心机以2000～3000r/min转速离心处理10～15min，分离得到上层液；称取棉花秸秆切割成长度为1～2cm的小段，得到棉花秸秆段，将棉花秸秆段和沼液按质量比为1:3混合后放置在温度为35～45℃的条件下，静置微腐处理3～5天，微腐处理结束后粉碎并过50目筛，得到微腐棉花秸秆粉末；将微腐棉花秸秆粉末和无水乙醇按质量比为1：10混合后加热升温至40～50℃，搅拌反应1～2h后得到混合悬浮液，再按质量比为1:15将五氧化二磷和混合悬浮液加入到超声分散仪中，在频率为30～40kHz的条件下超声分散处理30～40min得到分散液，再用质量分数为20%氨水调节分散液pH至9.0～9.5，得到前驱液；将上层液和乙二胺四乙酸按质量比20:1混合均匀得到滴加液，按质量比为1:3将滴加液滴入上述前驱液中，在40～50℃下以450～550W的功率微波辐照处理4～5h，处理结束后放置在温度为4～6℃的条件下静置陈化5～8h，过滤分离得到滤渣；将滤渣放入马弗炉中，加热升温至800～900℃，保温煅烧3～4h，得到多孔羟基磷灰石支架，将细叶泥炭藓和水按等质量比混合后放入研钵中研磨20～30min，得到苔藓浆，再按质量比为1:3将多孔羟基磷灰石支架和苔藓浆混合得到预处理混合物；将预处理混合物放入温度为20～25℃，空气相对湿度为60～70%，光照强度为800～900LX的温室中，静置7～9天，静置结束后得到产物，用水冲洗产物15～20min，自然晾干后即得微生物载体。
实例1
称取牡蛎壳放入水中加热煮沸处理1h，取出煮沸后的牡蛎壳放入气流粉碎机中粉碎30min得到牡蛎壳粉末，再按质量比为1:5将牡蛎壳粉末和浓度为0.1mol/L盐酸混合后搅拌反应1h，再用离心机以2000r/min转速离心处理10min，分离得到上层液；称取棉花秸秆切割成长度为1cm的小段，得到棉花秸秆段，将棉花秸秆段和沼液按质量比为1:3混合后放置在温度为35℃的条件下，静置微腐处理3天，微腐处理结束后粉碎并过50目筛，得到微腐棉花秸秆粉末；将微腐棉花秸秆粉末和无水乙醇按质量比为1：10混合后加热升温至40℃，搅拌反应1h后得到混合悬浮液，再按质量比为1:15将五氧化二磷和混合悬浮液加入到超声分散仪中，在频率为30kHz的条件下超声分散处理30min得到分散液，再用质量分数为20%氨水调节分散液pH至9.0，得到前驱液；将上层液和乙二胺四乙酸按质量比20:1混合均匀得到滴加液，按质量比为1:3将滴加液滴入上述前驱液中，在40℃下以450W的功率微波辐照处理4h，处理结束后放置在温度为4℃的条件下静置陈化5h，过滤分离得到滤渣；将滤渣放入马弗炉中，加热升温至800℃，保温煅烧3h，得到多孔羟基磷灰石支架，将细叶泥炭藓和水按等质量比混合后放入研钵中研磨20min，得到苔藓浆，再按质量比为1:3将多孔羟基磷灰石支架和苔藓浆混合得到预处理混合物；将预处理混合物放入温度为20℃，空气相对湿度为60%，光照强度为800LX的温室中，静置7天，静置结束后得到产物，用水冲洗产物15min，自然晾干后即得微生物载体。
实例2
称取牡蛎壳放入水中加热煮沸处理2h，取出煮沸后的牡蛎壳放入气流粉碎机中粉碎35min得到牡蛎壳粉末，再按质量比为1:5将牡蛎壳粉末和浓度为0.1mol/L盐酸混合后搅拌反应2h，再用离心机以2500r/min转速离心处理13min，分离得到上层液；称取棉花秸秆切割成长度为1cm的小段，得到棉花秸秆段，将棉花秸秆段和沼液按质量比为1:3混合后放置在温度为40℃的条件下，静置微腐处理4天，微腐处理结束后粉碎并过50目筛，得到微腐棉花秸秆粉末；将微腐棉花秸秆粉末和无水乙醇按质量比为1：10混合后加热升温至45℃，搅拌反应2h后得到混合悬浮液，再按质量比为1:15将五氧化二磷和混合悬浮液加入到超声分散仪中，在频率为35kHz的条件下超声分散处理35min得到分散液，再用质量分数为20%氨水调节分散液pH至9.3，得到前驱液；将上层液和乙二胺四乙酸按质量比20:1混合均匀得到滴加液，按质量比为1:3将滴加液滴入上述前驱液中，在45℃下以500W的功率微波辐照处理4h，处理结束后放置在温度为5℃的条件下静置陈化7h，过滤分离得到滤渣；将滤渣放入马弗炉中，加热升温至850℃，保温煅烧3h，得到多孔羟基磷灰石支架，将细叶泥炭藓和水按等质量比混合后放入研钵中研磨25min，得到苔藓浆，再按质量比为1:3将多孔羟基磷灰石支架和苔藓浆混合得到预处理混合物；将预处理混合物放入温度为23℃，空气相对湿度为65%，光照强度为850LX的温室中，静置8天，静置结束后得到产物，用水冲洗产物18min，自然晾干后即得微生物载体。
实例3
称取牡蛎壳放入水中加热煮沸处理2h，取出煮沸后的牡蛎壳放入气流粉碎机中粉碎40min得到牡蛎壳粉末，再按质量比为1:5将牡蛎壳粉末和浓度为0.1mol/L盐酸混合后搅拌反应2h，再用离心机以3000r/min转速离心处理15min，分离得到上层液；称取棉花秸秆切割成长度为2cm的小段，得到棉花秸秆段，将棉花秸秆段和沼液按质量比为1:3混合后放置在温度为45℃的条件下，静置微腐处理5天，微腐处理结束后粉碎并过50目筛，得到微腐棉花秸秆粉末；将微腐棉花秸秆粉末和无水乙醇按质量比为1：10混合后加热升温至50℃，搅拌反应2h后得到混合悬浮液，再按质量比为1:15将五氧化二磷和混合悬浮液加入到超声分散仪中，在频率为40kHz的条件下超声分散处理40min得到分散液，再用质量分数为20%氨水调节分散液pH至9.5，得到前驱液；将上层液和乙二胺四乙酸按质量比20:1混合均匀得到滴加液，按质量比为1:3将滴加液滴入上述前驱液中，在50℃下以550W的功率微波辐照处理5h，处理结束后放置在温度为6℃的条件下静置陈化8h，过滤分离得到滤渣；将滤渣放入马弗炉中，加热升温至900℃，保温煅烧4h，得到多孔羟基磷灰石支架，将细叶泥炭藓和水按等质量比混合后放入研钵中研磨30min，得到苔藓浆，再按质量比为1:3将多孔羟基磷灰石支架和苔藓浆混合得到预处理混合物；将预处理混合物放入温度为25℃，空气相对湿度为70%，光照强度为900LX的温室中，静置9天，静置结束后得到产物，用水冲洗产物20min，自然晾干后即得微生物载体。
对照例
以广东省某公司生产的聚乙烯醇微生物载体作为对比例
用本发明制得的微生物载体和对照例中的微生物载体同时负载相同的微生物，采用脂磷法测定本发明和对照例的单位质量微生物负载量，并测定本发明和对照例的抗压强度值，测定结果如表1
表1
由上述测试数据可以看出，本发明制得微生物载体具有良好的生物相容性和优异的机械强度，并且生物负载量高，具有广阔的应用前景。
Claims (7)
1.一种微生物载体的制备方法，其特征在于具体制备步骤为：
（1）称取牡蛎壳放入水中加热煮沸处理，取出煮沸后的牡蛎壳粉碎得到牡蛎壳粉末，将牡蛎壳粉末和盐酸混合后搅拌反应，再离心处理，分离得到上层液，备用；
（2）称取棉花秸秆切割成小段，得到棉花秸秆段，将棉花秸秆段和沼液混合后静置微腐处理，微腐处理结束后粉碎并过50目筛，得到微腐棉花秸秆粉末；
（3）将微腐棉花秸秆粉末和无水乙醇混合后加热升温，搅拌反应后得到混合悬浮液，将五氧化二磷和混合悬浮液混合后超声分散处理，得到分散液，再用氨水调节分散液pH至9.0～9.5，得到前驱液；
（4）将备用的上层液和乙二胺四乙酸混合均匀得到滴加液，将滴加液滴入上述前驱液中，进行微波辐照处理，处理结束后静置陈化，过滤分离得到滤渣；
（5）将上述滤渣放入马弗炉中，保温煅烧，得到多孔羟基磷灰石支架，将细叶泥炭藓和水按等质量比混合后研磨，得到苔藓浆，将多孔羟基磷灰石支架和苔藓浆混合得到预处理混合物；
（6）将上述预处理混合物放入温室中，静置7～9天，静置结束后得到产物，用水冲洗产物15～20min，自然晾干后即得微生物载体。
2.根据权利要求1所述的一种微生物载体的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的煮沸处理时间为1～2h，牡蛎壳粉末和盐酸的质量比为1:5，盐酸的浓度为0.1mol/L，搅拌反应时间为1～2h，离心处理转速为2000～3000r/min，离心处理时间为10～15min。
3.根据权利要求1所述的一种微生物载体的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的小段的长度为1～2cm，棉花秸秆段和沼液的质量比为1:3，静置微腐处理的温度为35～45℃，静置微腐处理的时间为3～5天。
4.根据权利要求1所述的一种微生物载体的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的微腐棉花秸秆粉末和无水乙醇的质量比为1：10，加热升温后的温度为40～50℃，搅拌反应时间为1～2h，五氧化二磷和混合悬浮液的质量比为1:15，超声分散处理频率为30～40kHz，超声分散处理时间为30～40min。
5.根据权利要求1所述的一种微生物载体的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述的上层液和乙二胺四乙酸的质量比20:1，滴加液和前驱液的质量比为1:3，微波辐照处理温度为40～50℃，微波辐照处理功率为450～550W，微波辐照处理时间为4～5h，静置陈化温度为4～6℃，静置陈化时间为5～8h。
6.根据权利要求1所述的一种微生物载体的制备方法，其特征在于：步骤（5）中所述的保温煅烧温度为800～900℃，保温煅烧时间为3～4h，多孔羟基磷灰石支架和苔藓浆的质量比为1:3。
7.根据权利要求1所述的一种微生物载体的制备方法，其特征在于：步骤（6）中所述的温室温度为20～25℃，空气相对湿度为60～70%，光照强度为800～900LX。
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