CN107267425A - 一种保鲜用活性菌剂的制备及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物保鲜剂技术领域，一种活性菌剂及其制备以及在保鲜领域的应用。所述活性菌剂采用侧孢短芽孢杆菌和喜热溶杆菌混合发酵制得，发酵培养液含虾蟹壳、胶原蛋白、氯化钠、复合氨基酸、碳水化合物、复合肥。菌剂本身和多种有效成分能够起到保鲜、抑制有害菌等作用。本发明实施例对中药材、水果和绿色蔬菜等进行浸涂，结果表明，本发明提供的活性菌剂有良好的保鲜效果，能够显著延长保藏时间。
Description
技术领域
本发明涉及微生物保鲜剂技术领域，尤其涉及一种活性菌剂及其制备方法以及在保鲜领域的应用。
背景技术
新鲜中药是指新鲜植物类中草药，鲜活动物及昆虫类药品。由于有些药物鲜品和干品作用的相差很大，鲜药的品质新鲜且没有经过加工，保持了天然的状态，因此药物的有效成分含量较高，药效好。而有相当一部分中药材，难以在运输和销售的过程中维持鲜药的品质而制成干药，其有效成分含量被大大降低。中药材营养丰富，有害微生物易滋生，受潮湿、自身发汗或生虫后容易引起霉变。中药发霉后，其中的成分和药效会发生变化，不仅没有治病的效果，还会对人的身体造成伤害，严重者可能会导致中毒。中药的霉变在采收后到加工处理的期间发生霉变的几率很大。因此加强中药材保鲜技术的研究和应用，对发展中医药技术具有重要意义。
另外，一些农产品由于易变质，滋生有害微生物，难以长期储藏，造成了较大的经济损失，也限制了产品在不同地域之间的运输，对这些产品的保藏技术也提出了高要求。
目前，常用的保存方法主要有干燥、低温贮藏、气体调节和化学剂熏蒸法等，然而低温贮藏和气体调节成本高、耗能大、质量不稳定；化学剂熏蒸法比如硫磺熏蒸法(用于中药的保藏)具有健康危害和环境污染等问题。其中，可以代替化学杀菌剂的物质主要有三类，分别是微生物菌剂、植物抗性诱导因子、天然植物产物。其中微生物菌剂的使用是最有效的方法然而，虽然理论研究一直在不断的进行，但是到目前为止，已实际应用于生产的拮抗菌种类不多，而我国目前尚没有有效拮抗菌应用于实际生产。主要原因在于，在商业生产条件下，由于环境条件的不确定性，其防效或达不到要求，或不稳定，且与化学剂相比防治成本较高；另外，拮抗菌作为保鲜剂，其使用方式不及化学杀菌剂方便。这些因素都影响了拮抗菌作为保鲜剂在生产中的应用。
因此，寻找更多可用于保鲜的微生物菌种，并且获得它们的有效利用方法对中药和农产品微生物保鲜剂的发展具有很大的意义。另外，如何降低微生物保鲜剂的成本也是我们需要关注的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种活性菌剂及其制备方法与其保鲜应用方法，该活性菌剂能够对引起产品变质的有害微生物、酶促反应、失水等因素起到良好的抑制作用，从而起到对延长保鲜期的作用。
本发明提供的活性菌剂，由菌种、虾蟹壳、胶原蛋白、氯化钠、复合氨基酸、碳水化合物和复合肥制得；所述菌种由侧孢短芽孢杆菌和喜热溶杆菌组成；
菌种、虾蟹壳、胶原蛋白、氯化钠和复合氨基酸、碳水化合物和复合肥的质量比为所述菌种、虾蟹壳、胶原蛋白、氯化钠、复合氨基酸、碳水化合物、复合肥的质量比为(0.1～1)：(0.1～10)：(0.01～1)：(0.01～9)：(1～10)：(1～10)：(1～10)。
本发明选择侧孢短芽孢杆菌与喜热溶杆菌进行复配，配合虾蟹壳、胶原蛋白、氯化钠、复合氨基酸、碳水化合物和复合肥进行发酵，所制得的发酵液中存在大量的活菌。作为优选，本发明提供的活性菌剂中活菌数不低于1×109个/mL～20×109个/mL。优选的，活性菌剂中活菌数为1×1010个/mL。且本发明提供的活性菌剂能够对导致中药材和果蔬变质的微生物起到显著地抑制作用，从而具有良好的保鲜作用，延长贮藏时间。
所述侧孢短芽孢杆菌和喜热溶杆菌的数量比为(1～5)：(1～5)。
所述侧孢短芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌和喜热溶杆菌的数量比为1：5。
所述侧孢短芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌和喜热溶杆菌的数量比为5：1。
所述侧孢短芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌和喜热溶杆菌的数量比为1：1。
侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)，能够分泌几丁质酶，广泛应用于农业生产中，被用于制造各类复合生物菌剂与发酵肥。本发明中采用的侧孢短芽孢杆菌菌株来自中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号为ACCCNo.11079。
喜热溶杆菌(Lysobacter caldus)，本发明中采用的喜热溶杆菌菌株来自中国海洋微生物菌种保藏管理中心，编号为MCCC No.1H00168。
复合氨基酸(amino acid)是重要的营养物质，本发明所用复合氨基酸的主要成分为含甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸等。其来源不限制，可以是动物或者植物酸解、碱解制得，也可以是微生物发酵制得。一些实施例中，复合氨基酸来自菜叶发酵物、大豆发酵物、大豆蛋白提取物或角蛋白提取物。
碳水化合物(carbohydrate)为速效碳源，在本发明中，碳水化合物选自葡萄糖、果糖、蔗糖或糖蜜的一种或几种。
本发明中，复合肥中N、P、K的质量比为(10～20)：(10～20)：(10～20)。
其中N、P、K均为水溶性的组分存在，如：NO3-、NH4 +、PO3-、PO4 3-、HPO4 2-、H2PO4 -、P6O18 6-、P2O7 4-、K+。
一些实施例中，复合肥氮磷钾的存在形式为NH4NO3/K2HPO4/KH2PO4，N/P/K＝15/15/15、N/P/K＝15/15/17或N/P/K＝15/15/20。
本发明对虾蟹壳的来源不限制，可以是江河湖海任意来源的富含几丁质的水生动物外壳，也可包含肉质，本发明中所述虾蟹壳为干燥品经粉碎后过20目～100目筛的细颗粒粉末。优选的是虾壳粉、蟹壳粉或虾蟹粉。
本发明中的胶原蛋白来源于动物皮毛、鱼类下脚料的一种或几种。
一些实施例中，胶原蛋白为猪皮胶原蛋白。另一些实施例中，胶原蛋白为鱼皮胶原蛋白。另一些实施例中，胶原蛋白为牛皮胶原蛋白。
本发明提供的活性菌剂的制备方法，包括：
将菌种、虾蟹壳、胶原蛋白、氯化钠、复合氨基酸、碳水化合物、复合肥与所述培养液混合，进行发酵，制得活性菌剂；
所述发酵的温度为25℃～35℃；时间为3天～5天；条件为鼓泡通气；pH控制在6～8。
本发明中，所述水为生活用水，所述混合后菌种的质量分数为0.1‰～1‰；虾蟹壳的质量分数为0.1‰～10‰；胶原蛋白的质量分数为0.01‰～1‰；氯化钠的质量分数为0.01‰～9‰；氨基酸的质量分数为1‰～10‰；碳水化合物的质量分数为1‰～10‰；复合肥的质量分数为1‰～10‰。本发明提供的活性菌剂作为保鲜剂的应用。
本发明提供了一种保鲜剂，包括本发明所述的活性菌剂1质量份和水1质量份～200质量份。
本发明还提供了一种中药材或果蔬的保鲜的方法，在中药材或果蔬表面浸涂、喷洒本发明提供的保鲜剂。
浸涂、喷洒后，通风干燥或自然晾干。
所述中药材为山药、地黄，所述的果蔬为荔枝、雪桃、柑橘、油菜、青椒、圆茄或黄瓜。
实验表明，在产品表面施用本发明提供的活性菌剂，在不影响产品的口感与外观的条件下，还能够显著延长产品的存储时间(p<0.05)。
本发明提供了一种活性菌剂及其制备方法与应用，该活性菌剂采用侧孢短芽孢杆菌和喜热溶杆菌发酵制得，发酵的培养液中虾蟹壳、胶原蛋白、氯化钠、复合氨基酸、碳水化合物和复合肥，从而使得该制剂能够起到抑制腐败的作用，本发明实施例对部分中药材和果蔬进行浸涂，结果表明，本发明提供的活性菌剂处理产品后，对产品外观和性状无明显影响，且显著延长产品的保藏时间。
具体实施方式
本发明提供了一种活性菌剂及其制备方法及其在保鲜中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
侧孢短芽孢杆菌0.05份、喜热溶杆菌0.05份，虾粉10份、胶原蛋白1份、NaCl1份、复合氨基酸10份、碳水化合物10份和复合肥10份。
其中，胶原蛋白为鱼皮胶原蛋白；氨基酸为大豆蛋白提取复合氨基酸，碳水化合物为蔗糖，复合肥中N/P/K＝15/15/15。
水1000L，加入菌种、虾壳粉、胶原蛋白、NaCl、复合氨基酸、碳水化合物和复合肥鼓泡通气进行培养，培养温度保持在30℃，培养时间为3天，即得活性菌剂。
实施例2
侧孢短芽孢杆菌0.5份、喜热溶杆菌0.5份、虾粉0.6份、蟹粉0.4份、胶原蛋白1份、NaCl5份、复合氨基酸2份、碳水化合物5份和复合肥5份。
其中，胶原蛋白为猪皮胶原蛋白，氨基酸为角蛋白提取复合氨基酸，碳水化合物为葡萄糖，复合肥中N/P/K＝15/15/15。
水1000L，加入菌种、虾粉、蟹粉、胶原蛋白、NaCl、复合氨基酸、碳水化合物和复合肥鼓泡通气进行培养，培养温度保持在28℃，培养时间为4天，即得活性菌剂。
实施例3
侧孢短芽孢杆菌0.1份、喜热溶杆菌0.5份、蟹粉1份、胶原蛋白0.5份、NaCl7份、复合氨基酸5份、碳水化合物10份和复合肥3份。
其中，胶原蛋白为鱼皮胶原蛋白，氨基酸为菜叶发酵物；碳水化合物为蔗糖，复合肥中N/P/K＝15/15/15。
水1000L，加入菌种、蟹粉、胶原蛋白、NaCl、复合氨基酸、碳水化合物和复合肥鼓泡通气进行培养，培养温度保持在30℃，培养时间为3天，即得活性菌剂。
实施例4
侧孢短芽孢杆菌0.5份、喜热溶杆菌0.1份、虾粉1份、胶原蛋白2份、NaCl5份、复合氨基酸6份、碳水化合物6份和复合肥5份。
其中，胶原蛋白为鱼胶原蛋白，氨基酸为菜叶发酵物，碳水化合物为糖蜜，复合肥中N/P/K＝15/15/20。
水1000L，加入菌种、虾粉、胶原蛋白、NaCl、复合氨基酸、碳水化合物和复合肥鼓泡通气进行培养，培养温度保持在32℃，培养时间为5天，即得活性菌剂。
对比例1
侧孢短芽孢杆菌0.5kg、虾粉0.6份、蟹粉0.4份、胶原蛋白1份、NaCl 1份、复合氨基酸2份、碳水化合物10份和复合肥9份。
其中，胶原蛋白为猪皮胶原蛋白，氨基酸为角蛋白提取复合氨基酸，碳水化合物为果糖，复合肥中N/P/K＝15/15/15。
水1000L，加入菌种、虾粉、蟹粉、胶原蛋白、NaCl、复合氨基酸、碳水化合物和复合肥鼓泡通气进行培养，培养温度保持在28℃，培养时间为4天，即得活性菌剂。
对比例2
喜热溶杆菌0.5份、虾粉0.6份、蟹粉0.4份、胶原蛋白1份、NaCl1份、复合氨基酸6份、碳水化合物2份和复合肥9份。
其中，胶原蛋白为猪皮胶原蛋白，氨基酸为角蛋白提取复合氨基酸，碳水化合物为糖蜜，复合肥中N/P/K＝15/15/15。
水1000L，加入菌种、虾粉、蟹粉、胶原蛋白、NaCl、复合氨基酸、碳水化合物和复合肥鼓泡通气进行培养，培养温度保持在28℃，培养时间为4天，即得活性菌剂。
实施例5
各实施例制得生物制剂，经检测，菌种密度如表1：
表1各实施例菌种密度
| 菌种密度(cfu/ml) | |
| 实施例1 | 5.88×1011 |
| 实施例2 | 3.40×1010 |
| 实施例3 | 1.46×1011 |
| 实施例4 | 9.10×1010 |
| 对比例1 | 2.92×1010 |
| 对比例2 | 1.05×1010 |
结果表明，本发明各实施例中提供的活性菌剂具有非常高的菌体密度。
实施例6
实施例1～5得到的活性菌剂稀释50、100、200倍，均匀喷洒到刚采收的山药表面，喷洒过程以雾状喷洒为宜，自然风干后储存。每组随机分为对照组和实验组，实验设置重复3次，其中对照组不做任何处理。
经过试验，不同组活性菌剂稀释液对山药的保存期均有显著的延长作用，在山药外观及形态无明显变化的条件下，保质期延长一周左右。
实施例7
实施例1～5得到的活性菌剂稀释50、100、200倍，将地黄浸入后3s拿出，自然风干后储存。每组随机分为对照组和实验组，实验设置重复3次，其中对照组不做任何处理。
经过试验，不同组活性菌剂稀释液对地黄的保存期均有显著的延长作用，在山药外观及形态无明显变化的条件下，基本延长时间在3～5天左右。
实施例8
实施例1～5得到的活性菌剂稀释50、100、200倍，将荔枝浸入后3s拿出，自然风干后4℃冰箱储存。每组随机分为对照组和实验组，实验设置重复3次，其中对照组不做任何处理。
经过试验，不同组活性菌剂稀释液对荔枝的保存期均有显著的延长作用，在荔枝外观及形态无明显变化的条件下，基本延长时间在3天左右；若是保证果实未变质的条件下，保质期可延长约1周。
实施例9
实施例1～5得到的活性菌剂稀释50、100、200倍，将草莓浸入后3s拿出，自然风干后4℃冰箱储存。每组随机分为对照组和实验组，实验设置重复3次，其中对照组不做任何处理。
经过试验，不同组活性菌剂稀释液对草莓的保存期均有显著的延长作用，在所有草莓外观及形态无明显变化的条件下，基本延长时间在4～6天左右；若是保证果实可食用的条件下，保质期可延长约3天。
实施例10
实施例1～5得到的活性菌剂稀释50、100、200倍，均匀喷洒到刚采收的圆茄表面，喷洒过程以雾状喷洒为宜，自然风干后按照常规储藏方法储存10天。每组随机分为对照组和实验组，实验设置重复3次，其中对照组不做任何处理。
经过试验，在储存10天后，实验组圆茄对照组有光泽、饱满，外观形态基本无变化；而对照组圆茄有一部分软化变质，无光泽。
实施例11
实施例1～5得到的活性菌剂稀释50、100、200倍，均匀喷洒到刚采收的油菜表面，喷洒过程以雾状喷洒为宜，自然风干后按照常规储藏方法储存5天。每组随机分为对照组和实验组，实验设置重复3次，其中对照组不做任何处理，按正常储藏方法储藏。
经过试验，在储存5天后，实验组油菜外观形态基本无变化；而对照组大多数叶片微发黄、萎蔫，少部分叶片腐坏。
实施例12
病原菌分别为尖孢镰刀菌、茄链格孢菌，由ACCC购得。用LB培养基(蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl10g，蒸馏水1000ml)28℃、150rpm震荡培养2d，用无菌水稀释至106cfu/ml，备用。
培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基和大豆酪蛋白琼脂(TSA)培养基。PDA培养基的组成为200g马铃薯、20g葡萄糖、20g琼脂、1L水、pH＝6.5。TSA培养基的组成为15g酪蛋白胰酶消化物，5g大豆粉木瓜蛋白酶消化物，5g氯化钠，15g琼脂，1L水，pH＝7.3。
试验方法为：
将实施例1～5中得到的微生物制剂，用无菌水稀释至其中细菌的含量为1×108cfu/ml，备用。
平板涂布：吸取经稀释的微生物制剂5μL，分别点接在PDA和TSA培养基中央，28℃培养48h后分别用尖孢镰刀菌、茄链格孢菌稀释液喷雾，28℃培养过夜，调查抑菌圈直径。每处理重复3次，取平均值。设点接清水的对照。
观察各皿中致病菌的生长情况，测定致病菌菌落直径，并计算各实施例对致病菌的抑制率。结果如表2：
表2抑菌实验结果(抑菌圈平均直径/mm)
结果显示，对照组均无抑菌圈，实验组所有抑菌圈均大于18mm，说明抑菌效果显著(p<0.05)，各实施例提供的微生物制剂皆表现出高度抑菌作用。其中，实施例1～4所得微生物制剂的抑菌效果显著优于对比例1和对比例2，说明侧孢短芽孢杆菌与喜热溶杆菌配合产生了增效协同作用，从而使对病原菌的抑制作用得到了显著提高(p<0.05)。
实施例13
实施例1～4和对比例1～2得到的微生物菌剂稀释100倍，均匀喷洒到刚采摘的果蔬表面(喷洒过程以雾状喷洒为宜)，或将果蔬浸入后3s拿出，自然风干后储存。每种果蔬随机分为对照组和实验组；实验设置重复3次。观察结果如表3：
表3保鲜天数
| 天数 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 对比例1 | 对比例2 | 对照 |
| 山药 | 40 | 38 | 40 | 40 | 36 | 34 | 28 |
| 地黄 | 12 | 10 | 12 | 11 | 10 | 9 | 7 |
| 荔枝 | 5 | 4 | 5 | 5 | 3 | 3 | 2 |
| 雪桃 | 16 | 14 | 14 | 15 | 13 | 12 | 11 |
| 柑橘 | 25 | 22 | 24 | 22 | 20 | 18 | 15 |
| 油菜 | 7 | 8 | 7 | 6 | 5 | 5 | 3 |
| 青椒 | 11 | 11 | 10 | 11 | 9 | 10 | 7 |
| 圆茄 | 12 | 10 | 12 | 11 | 9 | 9 | 7 |
| 黄瓜 | 8 | 7 | 7 | 7 | 5 | 6 | 3 |
结果表明，各实施例的菌剂皆能够显著延长果蔬和中药材的保藏时间，其中，实施例1～4所得微生物菌剂的延长效果显著优于对比例1～2；说明侧孢短芽孢杆菌与喜热溶杆菌菌配合产生了增效协同作用，从而使对保鲜作用得到了显著提高(p<0.05)。另据感官评价结果表明，在保鲜期内，受试蔬果外观、香气、滋味、质地并未发生明显改变。
对以100倍稀释的菌剂处理后保藏的药材中的有效成分进行检测，对比存储20天后的山药、储存4天后的地黄与未经存储的药材中关键有效成分含量的差异，以给予等量清水处理后存储的药材为对照，结果如表4：
表4对药材品质的影响
结果表明：本发明提供的菌剂对药材品质无明显影响，存储前后药材有效成分差异不显著，p>0.05。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种活性菌剂，其特征在于，由菌种、虾蟹壳、胶原蛋白、氯化钠、复合氨基酸、碳水化合物、复合肥制得；
所述菌种由侧孢短芽孢杆菌和喜热溶杆菌组成；
所述菌种、虾蟹壳、胶原蛋白、氯化钠、复合氨基酸、碳水化合物、复合肥的质量比为(0.1～1)：(0.1～10)：(0.01～1)：(0.01～9)：(1～10)：(1～10)：(1～10)。
2.根据权利要求1所述的活性菌剂，其特征在于，所述侧孢短芽孢杆菌和喜热溶杆菌的数量比为(1～5)：(1～5)。
3.根据权利要求1所述的活性菌剂，其特征在于，所述复合氨基酸选自菜叶发酵物、大豆发酵物、大豆蛋白提取物或角蛋白提取物。
4.根据权利要求1所述的活性菌剂，其特征在于，所述碳水化合物选自葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的活性菌剂，其特征在于，所述复合肥中N、P、K的质量比为(10～20)：(10～20)：(10～20)。
6.权利要求1～5任一项所述活性菌剂的制备方法，其特征在于，包括：
将菌种、虾蟹壳、胶原蛋白、氯化钠、复合氨基酸、碳水化合物、复合肥与水混合，进行发酵，制得活性菌剂；
所述发酵的温度为25℃～35℃；时间为3天～5天；条件为鼓泡通气；pH控制在6～8。
7.权利要求1～5任一项所述的活性菌剂作为保鲜剂的应用。
8.一种保鲜剂，其特征在于，包括权利要求1～5任一项所述的活性菌剂1质量份和水1质量份～200质量份。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述保鲜剂为中药材的保鲜剂或果蔬保鲜剂，所述中药材为山药或地黄，所述的果蔬为荔枝、雪桃、柑橘、油菜、青椒、圆茄或黄瓜。
10.一种中药材或果蔬的保鲜方法，其特征在于，在中药材或果蔬表面浸涂、喷洒权利要求9所述的保鲜剂。
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2017
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