CN105494440B - 一种坚强芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物农药与微生物肥料领域，具体公开的是一种含有芽孢萌发剂的坚强芽孢杆菌的可湿性粉剂及其制备方法，该可湿性粉剂的由下列原料组成：坚强芽孢杆菌发酵液，填料：白炭黑；润湿剂：Morwet EFW；分散剂：Morwet D‑425；芽孢萌发剂：果糖，缬氨酸，赖氨酸；紫外保护剂：卵磷脂，羧甲基纤维素；干燥保护剂：麦芽糖，甘露醇；制备的坚强芽孢杆菌可湿性粉剂芽孢含量为不低于100亿CFU/克，悬浮率不低于80%，润湿时间不高于70S，细度粉碎过400目筛，水份含量不高于5%，制备方法稳定，施入大田后芽孢萌发速度快，萌发效率高，可明显提高其肥效与对植物病害防治效果，减少芽孢的用量，降低成本，效果显著。
Description
技术领域
本发明涉及生物农药与微生物肥料领域，具体涉及一种含芽孢萌发剂的坚强芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法。
背景技术
我国每年使用大量的化学农药制剂与化肥，极易造成农药残留超标，生物富集，不仅污染生态环境，还影响人类的健康。而生物农药副作用小，对人无害，是一种具有广阔前景的绿色农药，日益成为全球农药发展的一种趋势。
芽胞杆菌是目前生物农药中研究最多的一种微生物，它具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力，其营养细胞能在真菌性病原菌丝体表面繁衍定殖，有效抑制病菌生长，因此，在控制病害发生、促进植株生长，提高作物产量等方面显示出了广阔的应用前景。
坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）是1933年Bredemannn &Werner首次发现并命名的，坚强芽孢杆菌是一种营腐生生活的革兰氏阳性细菌，在土壤、水体、植物表面和其它自然环境中广泛存在，易于获取，内生芽孢，抗逆能力强，繁殖速度快、营养要求简单、对农作物和环境安全，可以产生多种抑菌物质，对许多真菌以及线虫均有较强的抑制作用。
目前国内，外关于坚强芽孢杆菌作为生防菌的报道不少。Bayer Cropscience利用坚强芽孢杆菌I-1582作为生物农药已先后在美国和欧盟登记，登记名为PONCHO/VOTiVO，用于防治玉米，大豆害虫和植物线虫，可直接杀死线虫细胞，具有极好的防治效果。国内朱天辉教授利用绿粘帚霉与坚强芽孢杆菌，预先接种生防菌协同控制赤枯病取得一定效果，鹿秀云利用坚强芽孢杆菌XJT-7防治黄瓜白粉病，防治效果达到79%；刘幸红等利用坚强芽孢杆菌对核桃炭疽病进行防治，其防效可达到85%以上。目前，国内已有关生产坚强芽孢杆菌类产品的相关技术，如：廖先清等在专利号：2014104369551中公开了一种坚强芽孢杆菌活菌制剂的制备工艺；牛赡光等在专利号2009102564652中公开了一株坚强芽孢杆菌及其在核桃炭疽病，黄瓜灰霉病，玉米小斑病，棉花枯萎病等多种植物病害上的防治上的应用。
虽然以芽孢杆菌为主制备的微生物农药产品不少，但总体说来，还存在包括研究开发与生产脱节，制剂化困难，产品质量稳定性差、生产工艺落后，产品一致性不高，生产企业规模小，应用推广难度大的问题，除些之外，目前芽孢杆菌以可湿性粉剂为主，这种剂型虽然便于储存和运输，但在生产应用中存在很多制约因子。如施用的可湿性粉剂中大部份以芽孢作为衡量产品中有效成分的惟一标准，若芽孢不能及时萌发，施用效果则不佳，如王倩利用枯草芽孢杆菌TR21防治巴西蕉枯萎病时，前期试验利用TR21菌株NB发酵液灌根和叶腋接种都能有效防治枯萎病，但是利用芽孢制备可湿性粉剂的灌根与叶腋效果却不理想，显示了去掉发酵液后的纯芽孢可能因为萌发困难而使防效下降。但还未有具体的有关坚强芽孢杆菌的可湿性粉剂的制备方法公开。也未有在可湿性粉剂中加入芽孢萌发剂的研究的报道。
另外，由于不同的芽孢杆菌与湿润剂，分散剂等助剂的相容性，载体对各类芽孢杆菌吸附性各不相同，将现有的芽孢杆菌可湿性粉剂的配方或制备工艺无法直接用于制备含芽孢萌发剂的坚强芽孢杆菌可湿性粉剂；可湿性粉剂中有效菌的吸附量，存活率，对有害菌的防治效果及可湿性粉剂量的稳定性差异较大，其整个可湿性粉剂的制备方法必须全盘考虑各载体吸附能力，对坚强芽孢杆菌的干燥过程中保护作用，湿润剂，分散剂对可湿性粉剂的悬浮率，湿润时间的影响，并且对芽孢萌发剂进行全面的筛选才能够得到湿润时间短，悬浮率高，芽孢保存时间久，使用后芽孢能快速萌发的，防效好的坚强芽孢杆菌可湿性粉剂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种加入芽孢萌发剂的坚强芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法，其制备的坚强芽孢杆菌可湿性粉剂芽孢含量为不低于100亿CFU/克，悬浮率不低于80%，润湿时间不高于70S，细度粉碎过400目筛，水份含量不高于5%，制备方法稳定，施入大田后芽孢萌发速度与萌发率远远超过普通可湿性粉剂。
为了达到上述目的，一种坚强芽孢杆菌可湿性粉剂由下列重量分组成：坚强芽孢杆菌发酵液40-70份；填料：白炭黑20-30份；润湿剂：Morwet EFW 1-4份；分散剂：Morwet D-425 0.2-1份；芽孢萌发剂：果糖0.2-1份，缬氨酸0.1-0.5份，赖氨酸0.2-1份；紫外保护剂：卵磷脂1-2份，羧甲基纤维素0.2-1份；干燥保护剂：麦芽糖1-5份，甘露醇0.2-1份。
为了实现上述目的，我们采用的一种坚强芽孢杆菌可湿性粉剂的其制备方法，由以下几步骤组成：
一、坚强芽孢杆菌发酵液的制备
取出菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，37℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至50毫升LB培养基中，在培养箱中37℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至5L大三角瓶中的芽孢杆菌液体培养基，装液量为2L，37℃震荡培养16-28小时，检测其菌液浓度，菌液含量超过60亿/毫升，即可作为坚强芽孢杆菌种子液。将坚强芽孢杆菌种子液接种至1000L的发酵罐中，装液量为600L的发酵培养基，通气量为前16小时为每分钟液气比为1：0.6，其后通气量为1：1；开搅拌，转速为160r/min，培养温度前24小时为37℃，其后，每4小时将温度提高1℃，培养28-36小时，检测其芽孢含量超过100亿CFU/ml，即可结束发酵，作为坚强芽孢杆菌发酵液；
其中，所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%。其中，所述芽孢杆菌液体培养基：葡萄糖10g/L，可溶性淀粉8 g/L， 豆粕粉15 g/L，鱼粉5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，pH7.2；
其中，所述的发酵培养基：葡萄糖10g/L，玉米粉20 g/L， 豆粕粉75 g/L，鱼粉5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，pH7.2；
各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
二、将坚强芽孢杆菌发酵液40-70份；填料：白炭黑20-30份；紫外保护剂：卵磷脂1-2份，羧甲基纤维素0.2-1份；干燥保护剂：麦芽糖1-5份，甘露醇0.2-1份，混匀后喷雾干燥，得到坚强芽孢杆菌粉剂；
三、将润湿剂：Morwet EFW 1-4份；分散剂：Morwet D-425 0.2-1份；芽孢萌发剂：果糖0.2-1份，缬氨酸0.1-0.5份，赖氨酸0.2-1份混匀得到坚强芽孢杆菌的助剂；
四、将步骤二与步骤三所得到的坚强芽孢杆菌粉剂与助剂混匀并过通过气流粉碎机粉碎过400目筛，检测其芽孢含量不低于100亿cfu/g，悬浮率不低于80%，润湿时间不高于70s，水份含量不高于5%，真空包装，即可得到坚强芽孢杆菌可湿性粉剂。
其中，所述的坚强芽孢杆菌可湿性粉剂的最佳重量份组成为：坚强芽孢杆菌发酵液60份；填料：白炭黑25份；润湿剂：Morwet EFW 3份；分散剂：Morwet D-425 0.8份；芽孢萌发剂：果糖0.6份，缬氨酸0.3份，赖氨酸0.6份；紫外保护剂：卵磷脂1.2份，羧甲基纤维素0.6份；干燥保护剂：麦芽糖3份，甘露醇0.8份。
自然界中芽孢萌发受外源营养物质的影响，这类营养物质被称之为“萌发剂”，通常情况下，芽孢和促进萌发的芽孢萌发剂混合后数秒钟之内，萌发剂快速跨过芽孢衣和皮层到达芽孢内膜的表面，与位于芽孢内膜上的受体蛋白相互作用，激发芽孢进入萌发状态，接着启动一连串萌发事件，之后的萌发过程不会因移走萌发剂而停止。本发明可湿性粉剂中含有芽孢萌发剂是从苷氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，蛋氨酸，胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，精氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，组氨酸，脯氨酸，肌苷，2，6吡啶二羧钙，果糖中进行单因素试验，通过单因素结果筛选出效果较好的果糖，缬氨酸，赖氨酸，最后通过正交试验将三种芽孢萌发剂进行复配得到较佳的效果。经过试验，本发明的坚强芽孢杆菌可湿性粉剂与水按1：100的比例进行润湿混合均匀，此时的芽孢萌发剂能充分与芽孢接触后，从而促使其快速萌发，经过试验，30分钟后，芽孢萌发率已经达到75%以上，而未加芽孢萌发剂的坚强芽孢在4小时后，其芽孢萌发率只达到了50%左右。
本发明人通过对载体（如膨润土，滑石粉，高岭土，硅藻土，白炭黑，磷矿粉，轻质碳酸钙）、助剂（润湿剂和分散剂）（聚乙烯醇，聚乙二醇，CMC-Na,吐温-60，十二烷基苯磺酸钠，T型木质素，十二烷基硫酸钠，茶皂素，Morwet EFW，Morwet D425，My100，D110，阿拉伯权胶，2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐，辛基酚聚氧乙烯醚，二异辛基琥珀酸酯磺酸钠，甲基纤维素，木质素磺酸钠）填料（硅藻土，高岭土，膨润土，白炭黑，轻质碳酸钙，滑石粉）、紫外线保护剂（抗坏血酸，糊精，十二烷基苯磺酸钠，刚果红，羧甲基纤维素，卵磷脂），干燥保护剂（脱脂奶粉，蔗糖，谷氨酸钠，麦芽糖，甘露糖，甲基纤维素等）进行筛选，其每种助剂对坚强芽孢杆菌的芽孢存活，悬浮性，湿润性进行试验，最后通过多轮单因素与正交试验确定坚强芽孢杆菌可湿性粉剂的配方。通过验证，本发明的坚强芽孢杆菌可湿性粉剂在20-25℃下保存一年，其芽孢存活率还可达到90%。
本发明的可湿性粉剂采有真空包装，减少芽孢与空气的接触，降低了其萌发的机率。
本发明的可湿性粉剂的水分含量低于6%，低水份含量的可湿性粉剂中即使含有芽孢萌发剂（果糖，缬氨酸，赖氨酸），对其贮存过程中的芽孢活性也没有明显的影响，没有减少其在贮存过程中的芽孢。
本发明中的可湿性粉中含有缬氨酸，赖氨酸等单分子氨基酸，不仅在使用初期作为萌发剂，而施入大田后则作为氨基酸肥可起到肥效的作用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
这是国内首次将坚强芽孢杆菌的芽孢萌发剂加入坚强芽孢杆菌可湿性粉剂进行工业化生产，大大提升了使用至大田后芽孢萌发速率与萌发率，解决了因为芽孢萌发慢，萌发率低而导致的防治效果差，效果不稳定的问题；
提供了一种制备的坚强芽孢杆菌可湿性粉剂芽孢含量为不低于100亿CFU/克，悬浮率不低于80%，润湿时间不高于70S，细度粉碎过400目筛，水分含量不高于5%的制备方法，制备方法稳定。
具体实施方式
本发明实质性特点可从下述实施例中得以体现，但这些实施例仅作为说明，而不是对本发明进行限制。
实施例1
一种坚强芽孢杆菌可湿性粉剂由下列重量分组成：坚强芽孢杆菌发酵液60份；填料：白炭黑25份；润湿剂：Morwet EFW 3份；分散剂：Morwet D-425 0.8份；芽孢萌发剂：果糖0.6份，缬氨酸0.3份，赖氨酸0.6份；紫外保护剂：卵磷脂1.2份，羧甲基纤维素0.6份；干燥保护剂：麦芽糖3份，甘露醇0.8份。
为了实现上述目的，我们采用的一种坚强芽孢杆菌可湿性粉剂的其制备方法由以下几步骤组成：
一、坚强芽孢杆菌发酵液的制备
取出菌种ACCC03123保藏管（坚强芽孢杆菌Bacillus firmus可从中国农业微生物菌种保藏管理中心购买），用LB固体培养基划平板进行复苏，37℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至50毫升LB培养基中，在培养箱中37℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至5L大三角瓶中的芽孢杆菌液体培养基，装液量为2L，37℃震荡培养24小时，检测其菌液浓度，菌液含量为61亿/毫升，即可作为坚强芽孢杆菌种子液。将坚强芽孢杆菌种子液接种至1000L的发酵罐中，装液量为600L的发酵培养基，通气量为前16小时为每分钟液气比为1：0.6，其后通气量为1：1；开搅拌，转速为160r/min，培养温度前24小时为37℃，其后，每4小时将温度提高1℃，培养32小时，检测其芽孢含量为105亿CFU/ml，即可结束发酵，作为坚强芽孢杆菌发酵液；
其中所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%。其中所述芽孢杆菌液体培养基：葡萄糖10g/L，可溶性淀粉8 g/L， 豆粕粉15g/L，鱼粉5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，pH7.2；
其中所述的发酵培养基：葡萄糖10g/L，玉米粉20 g/L， 豆粕粉75 g/L，鱼粉5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，pH7.2；
各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
二、将坚强芽孢杆菌发酵液60份；填料：白炭黑25份；紫外保护剂：卵磷脂1.2份，羧甲基纤维素0.6份；干燥保护剂：麦芽糖3份，甘露醇0.8份，混匀后喷雾干燥，得到坚强芽孢杆菌粉剂；
三、将润湿剂：Morwet EFW 3份；分散剂：Morwet D-425 0.8份；芽孢萌发剂：果糖0.6份，缬氨酸0.3份，赖氨酸0.6份混匀得到坚强芽孢杆菌的助剂；
四、将步骤二与步骤三所得到的坚强芽孢杆菌粉剂与助剂混匀并过通过气流粉碎机粉碎过400目筛，检测其芽孢含量为110亿cfu/g，悬浮率为90%，润湿时间为55s，水分含量为3.5%，真空包装，即可得到坚强芽孢杆菌可湿性粉剂。
实施例2
对比加芽孢萌发剂与未加芽孢萌发剂其在黄瓜大田的效果
1试验分组：
试验组可湿性粉剂：坚强芽孢杆菌可湿性粉剂制备方法与实施例1相同
对照组可湿性粉剂：与实施例1相比即只减少了芽孢萌发剂，其坚强芽孢杆菌可湿性粉剂的组成为：坚强芽孢杆菌发酵液60份；填料：白炭黑25份；润湿剂：Morwet EFW 3份；分散剂：Morwet D-425 0.8份；紫外保护剂：卵磷脂1.2份，羧甲基纤维素0.6份；干燥保护剂：麦芽糖3份，甘露醇0.8份；
空白组可湿性粉剂：不加坚强芽孢杆菌组，其他的与试验组相同，可湿性粉剂组成为：填料：白炭黑25份；润湿剂：Morwet EFW 3份；分散剂：Morwet D-425 0.8份；芽孢萌发剂：果糖0.6份，缬氨酸0.3份，赖氨酸0.6份；紫外保护剂：卵磷脂1.2份，羧甲基纤维素0.6份；干燥保护剂：麦芽糖3份，甘露醇0.8份；
2试验方法：移植时将幼苗用200倍可湿性粉剂稀释液沾根20分种，在定植后10天后，用可湿性粉剂1000倍稀释液灌根1次，在黄瓜生长期间，叶面喷施1：500倍可湿性粉剂，20天1次，连喷3次；
3试验结果：本坚强芽孢杆菌具有固氮与作物根际促生能力，有一定的防治黄瓜白粉病的防治能力。黄瓜移植后，发现沾根的试验组植株叶片比较新鲜，而且生长势好，没有打蔫的；试验组的植株比对照组提前三天现花，比空白组提前一周现花。在大部分的都开过花后观察发现，发现试验组的花开的比对照组的多，而且花的质量很好，色艳，花大，花看上去就比较“壮”，而且从整个植株的生长来看，生长势明显好于对照组与空白组，期间试验组的黄瓜表现为叶色翠绿、植株整齐且土壤表现为疏松，从口感上黄瓜要清脆、香甜。而空白组的则叶色黄绿、植株参差不齐。 在整个生长过程中，对黄瓜的白粉病也有明显的防治效果，实际测产时，试验组比对照组的增产26.9%，比空白组的增产38.2%,结果如表1。这就明显显示了加入了芽孢萌发剂的坚强芽孢杆菌可湿性粉剂在施入大田时，大部分已经萌发，进入大田后能够快速起到对植物病害的防治与肥料的效果，然而没有加入芽孢萌发剂则由于施入大田后的坚强芽孢不能及时萌发或者施入的芽孢由于萌发率过低而导致效果不佳，尽管较空白组有一定的效果，但效果没有那么显著。
表1坚强芽孢杆菌可湿性粉剂中芽孢萌发剂在黄瓜大田中的作用效果
| 组别 | 折算亩产（kg） | 增产率(%) | 白粉病发病率或病指（%） | 防效（%） |
| 试验组 | 14373 | 38.2 | 5.6 | 83.13 |
| 对照组 | 11325 | 8.9 | 26.8 | 19.3 |
| 空白组 | 10400 | 33.2 |
实施例3
一种坚强芽孢杆菌可湿性粉剂由下列重量分组成：坚强芽孢杆菌发酵液50份；填料：白炭黑22份；润湿剂：Morwet EFW 2份；分散剂：Morwet D-425 0.8份；芽孢萌发剂：果糖0.4份，缬氨酸0.4份，赖氨酸0.8份；紫外保护剂：卵磷脂1.5份，羧甲基纤维素0.6份；干燥保护剂：麦芽糖2份，甘露醇0.4份。
为了实现上述目的，我们采用的一种坚强芽孢杆菌可湿性粉剂的其制备方法，由以下几步骤组成：
一、坚强芽孢杆菌发酵液的制备
取出菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，37℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至50毫升LB培养基中，在培养箱中37℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至5L大三角瓶中的芽孢杆菌液体培养基，装液量为2L，37℃震荡培养18小时，检测其菌液浓度，菌液含量为62亿/毫升，即可作为坚强芽孢杆菌种子液。将坚强芽孢杆菌种子液接种至1000L的发酵罐中，装液量为600L的发酵培养基，通气量为前16小时为每分钟液气比为1：0.6，其后通气量为1：1；开搅拌，转速为160r/min，培养温度前24小时为37℃，其后，每4小时将温度提高1℃，培养32小时，检测其芽孢含量为108亿CFU/ml，结束发酵，作为坚强芽孢杆菌发酵液；
其中，所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%。其中，所述芽孢杆菌液体培养基：葡萄糖10g/L，可溶性淀粉8 g/L， 豆粕粉15 g/L，鱼粉5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，pH7.2；
其中，所述的发酵培养基：葡萄糖10g/L，玉米粉20 g/L， 豆粕粉75 g/L，鱼粉5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，pH7.2；
各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
二、将坚强芽孢杆菌发酵液50份；填料：白炭黑22份；紫外保护剂：卵磷脂1.5份，羧甲基纤维素0.6份；干燥保护剂：麦芽糖2份，甘露醇0.4份，混匀后喷雾干燥，得到坚强芽孢杆菌粉剂；
三、将润湿剂：Morwet EFW 2份；分散剂：Morwet D-425 0.8份；芽孢萌发剂：果糖0.4份，缬氨酸0.4份，赖氨酸0.8份混匀得到坚强芽孢杆菌的助剂；
四、将步骤二与步骤三所得到的坚强芽孢杆菌粉剂与助剂混匀并过通过气流粉碎机粉碎过400目筛，检测其芽孢含量为105亿cfu/g，悬浮率为85%，润湿时间为63s，水份含量为4.25%，真空包装，即可得到坚强芽孢杆菌可湿性粉剂。
Claims (2)
1.一种坚强芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于，由下列重量分组成：坚强芽孢杆菌发酵液40-70份；填料：白炭黑20-30份；润湿剂：Morwet EFW 1-4份；分散剂：Morwet D-425 0.2-1份；芽孢萌发剂：果糖0.2-1份，缬氨酸0.1-0.5份，赖氨酸0.2-1份；紫外保护剂：卵磷脂1-2份，羧甲基纤维素0.2-1份；干燥保护剂：麦芽糖1-5份，甘露醇0.2-1份；
所述坚强芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法由以下几步骤组成：
一、坚强芽孢杆菌发酵液的制备
取出菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，37℃培养48小时，在平板下挑取单个菌落接种至50毫升LB培养基中，在培养箱中37℃震荡培养24小时，种子采用5%的接种量，接种至5L大三角瓶中的芽孢杆菌液体培养基，装液量为2L，37℃震荡培养16-28小时，检测其菌液浓度，菌液含量超过60亿/毫升，即可作为坚强芽孢杆菌种子液，将坚强芽孢杆菌种子液接种至1000L的发酵罐中，装液量为600L的发酵培养基，通气量为前16小时为每分钟液气比为1：0.6，其后通气量为1：1；开搅拌，转速为160r/min，培养温度前24小时为37℃，其后，每4小时将温度提高1℃，培养28-36小时，检测其芽孢含量超过100亿CFU/ml，即可结束发酵，作为坚强芽孢杆菌发酵液；
其中，所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；其中，所述的芽孢杆菌液体培养基：葡萄糖10g/L，可溶性淀粉8 g/L， 豆粕粉15 g/L，鱼粉5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，pH7.2；
其中，所述的发酵培养基：葡萄糖10g/L，玉米粉20 g/L， 豆粕粉75 g/L，鱼粉5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，pH7.2；
各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
二、将坚强芽孢杆菌发酵液40-70份；填料：白炭黑20-30份；紫外保护剂：卵磷脂1-2份，羧甲基纤维素0.2-1份；干燥保护剂：麦芽糖1-5份，甘露醇0.2-1份，混匀后喷雾干燥，得到坚强芽孢杆菌粉剂；
三、将润湿剂：Morwet EFW 1-4份；分散剂：Morwet D-425 0.2-1份；芽孢萌发剂：果糖0.2-1份，缬氨酸0.1-0.5份，赖氨酸0.2-1份混匀得到坚强芽孢杆菌的助剂；
四、将步骤二与步骤三所得到的坚强芽孢杆菌粉剂与助剂混匀并过通过气流粉碎机粉碎过400目筛，检测其芽孢含量不低于100亿cfu/g，悬浮率不低于80%，润湿时间不高于70s，水分含量不高于5%，真空包装，即可得到坚强芽孢杆菌可湿性粉剂；
所述坚强芽孢杆菌菌种是从中国农业微生物菌种保藏管理中心购买，编号为ACCC03123。
2.根据权利要求1所述的一种坚强芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于，其重量份组成为：坚强芽孢杆菌发酵液60份；填料：白炭黑25份；润湿剂：Morwet EFW 3份；分散剂：MorwetD-425 0.8份；芽孢萌发剂：果糖0.6份，缬氨酸0.3份，赖氨酸0.6份；紫外保护剂：卵磷脂1.2份，羧甲基纤维素0.6份；干燥保护剂：麦芽糖3份，甘露醇0.8份。
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