CN107267393A - 乳酸乳球菌的冷冻保藏方法 - Google Patents

乳酸乳球菌的冷冻保藏方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乳酸乳球菌的冷冻保藏方法，其特征在于：在预定冷冻保藏条件下，采用预定保护剂对乳酸乳球菌进行冷冻保藏，并在使用乳酸乳球菌时采用预定解冻条件进行解冻，其中，预定保护剂由质量体积百分比为20％～30％的海藻糖溶液、质量体积百分比为20％～30％的蔗糖溶液、质量体积百分比为20％～30％的脱脂乳溶液以及体积百分比为10％～30％的甘油溶液等体积混合制备而成，采用这样的冷冻保藏方法，可最大程度上降低乳酸乳球菌的低温冷冻的损伤和死亡，提高乳酸乳球菌存活率和活力，从而大大提高发酵效率、节约成本以及缩短发酵周期。

Description

乳酸乳球菌的冷冻保藏方法
技术领域
本发明涉及一种乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的冷冻保藏方法，属于微生物技术领域。
背景技术
乳酸乳球菌是乳球菌属中最具代表性的菌种，也是乳酸菌中的一种重要模式菌。由于具有生长迅速、易于操作、发酵技术成熟等优点，乳酸乳球菌被广泛应用于科学研究和工业化生产中。
但乳酸乳球菌在科研和工业化生产中遇到的一大难题是难于保存其活性，尤其是在冷冻保藏过程中。冷冻保藏或超低温冷冻保藏把需要保存的菌种离心重悬后加入合适的保护剂混匀后分装到冻藏管中，然后放入低温中保藏。而在冷冻保藏过程中，即使加了保护剂，存活率也很低，保藏一段时间后，存活率也会降低很多。因此，对乳酸乳球菌的最佳冷冻保藏方法进行研究是非常有必要的。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种乳酸乳球菌的冷冻保藏方法。
本发明提供了一种乳酸乳球菌的冷冻保藏方法，具有这样的特征，包括：在预定冷冻保藏条件下，采用预定保护剂对乳酸乳球菌进行冷冻保藏，并在需要使用时采用预定解冻条件进行解冻，其中，预定保护剂由等体积的海藻糖溶液、蔗糖溶液、脱脂乳溶液以及甘油溶液混合制备而成，海藻糖溶液的质量体积百分比为20％～30％，蔗糖溶液的质量体积百分比为20％～30％，脱脂乳溶液的体积百分比为20％～30％，甘油溶液的体积百分比为10％～30％。
在本发明提供的乳酸乳球菌的冷冻保藏方法中，还可以具有这样的特征：其中，在本发明提供的乳酸乳球菌的冷冻保藏方法中，还可以具有这样的特征：其中，海藻糖溶液的质量体积百分比为30％。
在本发明提供的乳酸乳球菌的冷冻保藏方法中，还可以具有这样的特征：其中，脱脂乳溶液的体积百分比为30％。
在本发明提供的乳酸乳球菌的冷冻保藏方法中，还可以具有这样的特征：其中，蔗糖溶液的质量体积百分比为20％。
在本发明提供的乳酸乳球菌的冷冻保藏方法中，还可以具有这样的特征：其中，甘油溶液的体积百分比为10％～20％。
在本发明提供的乳酸乳球菌的冷冻保藏方法中，还可以具有这样的特征：其中，甘油溶液的体积百分比为10％。
在本发明提供的乳酸乳球菌的冷冻保藏方法中，还可以具有这样的特征：其中，预定冷冻保藏条件为以-10～-20℃/min的降温速率从4℃降温至-80℃，并在-80℃下冷冻保藏，预定解冻条件为解冻温度是0～40℃。
在本发明提供的乳酸乳球菌的冷冻保藏方法中，还可以具有这样的特征：其中，降温速率为-20℃/min，解冻温度为0℃。
发明的作用与效果
本发明所涉及的乳酸乳球菌的冷冻保藏方法中，将质量体积百分比为20％～30％的海藻糖溶液、质量体积百分比为20％～30％的蔗糖溶液、体积百分比为20％～30％的脱脂乳溶液以及体积百分比为10％～30％的甘油溶液等体积混合制备成预定保护剂对乳酸乳球菌进行冷冻保藏，并在使用乳酸乳球菌时采用预定解冻条件进行解冻。采用这样的冷冻保藏方法，可最大程度上降低乳酸乳球菌的低温冷冻的损伤和死亡，提高乳酸乳球菌存活率和活力，从而大大提高发酵效率、节约成本以及缩短发酵周期。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例对本发明的乳酸乳球菌的冷冻保藏方法作具体阐述。
<实施例>
本实施例提供了一种乳酸乳球菌的冷冻保藏方法，该冷冻保藏方法为在预定冷冻保藏条件下，采用预定保护剂对乳酸乳球菌NZ9000进行冷冻保藏，并在使用乳酸乳球菌时采用预定解冻条件进行解冻。
在本实施例中，对预定保护剂的配方、冷冻保藏时的降温速率、解冻时的解冻温度进行了探索研究。
在进行最佳冷冻保藏方法中各因素考查实验之前，先利用分光光度仪测得乳酸乳球菌NZ9000的生长曲线，在0～2小时处于调整期，2小时后快速生长，10小时达到稳定期，此时菌体数量最多，菌体特性稳定，以下实验选用此时的菌株进行实验。
一、对预定保护剂的配方进行研究
(1)配制保护剂
配制海藻糖溶液:用电子天平分别称量5g、10g、15g海藻糖置于100ml烧杯中，再分别加入30ml去离子水，用玻璃棒搅拌溶解，然后定容于50ml容量瓶中，分别配制得到质量体积百分比为10％、20％、30％的海藻糖溶液，然后在115℃温度下灭菌20min。
配制蔗糖溶液:用电子天平称分别称量5g、10g、15g蔗糖置于100ml烧杯中，再分别加入30ml去离子水，用玻璃棒搅拌溶解，然后定容于50ml容量瓶中，分别配制得到质量体积百分比为10％、20％、30％的蔗糖溶液，然后在115℃温度下灭菌20min。
配制脱脂乳溶液:用电子天平称分别称量5g、10g、15g脱脂乳置于100ml烧杯中，再分别加入30ml去离子水，用玻璃棒搅拌溶解，然后定容于50ml容量瓶中，分别配制得到质量体积百分比为10％、20％、30％的脱脂乳溶液，然后在115℃温度下灭菌20min。
配制甘油溶液:用移液枪吸取5ml、10ml、15ml甘油置于100ml烧杯中，再分别加入30ml去离子水，用玻璃棒搅拌溶解，然后定容于50ml容量瓶中，分别配制得到体积百分比为10％、20％、30％的甘油溶液，然后在115℃温度下灭菌20min。
配制复合保护剂：取等体积的上述海藻糖溶液、蔗糖溶液、脱脂乳溶液以及甘油溶液，混合得到复合保护剂，然后将复合保护剂在115℃温度下灭菌20min。
(2)单保护剂的实验考查
采用单保护剂对乳酸乳球菌的样品菌液进行冷冻保藏，其存活率如下表所示：
表1单保护剂对乳酸乳球菌的存活率的影响表
由表1中可知，采用不同的单保护剂，乳酸乳球菌的存活率不同。其中，在最适单保护剂(即质量体积百分比为10％的海藻糖溶液)作用下，乳酸乳球菌的存活率为70.83％。此外，采用体积百分比为30％的甘油溶液和质量体积百分比为20％的蔗糖溶液，乳酸乳球菌的菌体存活率比较高，但与质量体积百分比为10％的海藻糖溶液相比，还存在不少差异。
(3)复合保护剂的正交实验考查
按照表2进行正交实验，采用复合保护剂对乳酸乳球菌的样品菌液进行冷冻保藏。
表2复合保护剂对乳酸乳球菌的存活率的影响
在表2中，A为海藻糖溶液，B为蔗糖溶液，C为脱脂乳溶液，D为甘油溶液。因素A下面的1，2，3分别表示质量体积分数为10％、20％、30％的海藻糖溶液；因素B下面的1，2，3分别代表质量体积分数为10％、20％、30％的蔗糖溶液；因素C下面的1，2，3分别代表体积分数为10％、20％、30％的脱脂乳溶液；因素D下面的1，2，3则分别代表质量体积分数为10％、20％、30％的甘油溶液。例如在正交实验表中，试验号3采用的复合保护剂是由质量体积百分比为10％的海藻糖溶液、质量体积百分比为30％的蔗糖溶液、质量体积百分比为30％的脱脂乳溶液、体积百分比为30％的甘油溶液等体积混合制备而成。
由表2可知，用于配制复合保护剂的这四种组分对存活率的影响是不同的，在复合保护剂中对乳酸乳球菌的存活率因素主次顺序依次为海藻糖溶液、脱脂乳溶液、蔗糖溶液、甘油溶液。
由表2可知，当海藻糖溶液质量体积百分比为10％且质量体积百分比为10％的蔗糖溶液(即试验号1)时，乳酸乳球菌的存活率较高，数值为91.55％。从表2计算得出：最优组合为A3B2C3D1，即最优复合保护剂是由质量体积百分比为10％的海藻糖溶液、质量体积百分比为10％的蔗糖溶液、体积百分比为30％的甘油溶液、质量体积百分比为20％的脱脂乳溶液等体积混合制备而成。
(4)最优复合保护剂的配方验证
对最优组合A3B2C3D1进行验证，经实验证明乳酸乳球菌的存活率高达92％。
二、对冷冻、解冻条件进行研究
(1)冷冻保藏及解冻操作
乳酸乳球菌的样品菌液和保护剂按1:1添加，加好保护剂后使用程序冷冻仪(Kryo360-1.7型号)控制降温速率，具体操作步骤如下：
a.安装低温低压瓶。
b.安装泵和液氮罐。
c.设置MVR控制器，编辑相应降温程序：以不同的降温速率从4℃降温至-80℃。
d.加载样品，样品加载完毕后，等待5min，使冷冻室温度稳定至4℃，然后再在MVR控制器上按回车键，启动运行。
e.每个程序降温结束，带手套立即取出样品，放到-80℃低温冰箱冷冻冻藏。
解冻操作为：取出低温冷冻的样品分别放在不同温度的水浴中解冻。
(2)降温速率的实验考查
按照表3对乳酸乳球菌冷冻保藏时的降温速率进行研究。
表3降温速率对乳酸乳球菌存活率的影响
降温速率 -1℃/min -10℃/min -20℃/min -40℃/min
存活率％ 44.00 89.14 93.14 73.14
由表3可知，降温速率为-20℃/min时，乳酸乳球菌的存活率最大，高达93.14％；降温速率为-1℃/min，存活率仅有44％，在此降温速率下，可能形成较大的冰晶，对细胞的危害较大；但当降温速率降低到-40℃/min，存活率也明显降低。因此对于乳酸乳球菌，最佳的降温速率是-20℃/min。
(3)对解冻温度的实验考查
按照表4对乳酸乳球菌冷冻保藏时的降温速率以及解冻时的解冻温度进行研究。
表4降温速率和解冻温度对乳酸乳球菌存活率的影响
由表4可知，在0℃解冻时，在不同的降温速率下，存活率都是最高的；而在20℃解冻时，存活率普遍降低，在降温速率为-1℃/min，存活率降低到8％，0℃为最佳解冻温度。进一步可知，当降温速率为-20℃/min且解冻温度为0℃时，乳酸乳球菌的存活率最高，其值为93.14％。
实施例的作用与效果
本发明所涉及的乳酸乳球菌的冷冻保藏方法中，将质量体积百分比为20％～30％的海藻糖溶液、质量体积百分比为20％～30％的蔗糖溶液、体积百分比为20％～30％的脱脂乳溶液以及体积百分比为10％～30％的甘油溶液等体积混合制备成预定保护剂对乳酸乳球菌进行冷冻保藏，并在使用乳酸乳球菌时采用预定解冻条件进行解冻。采用这样的冷冻保藏方法，可最大程度上降低乳酸乳球菌的低温冷冻的损伤和死亡，提高乳酸乳球菌存活率和活力，从而大大提高发酵效率、节约成本以及缩短发酵周期。
由上述实施例可知，采用由质量体积百分比为30％的海藻糖溶液、质量体积百分比为20％的蔗糖溶液、体积百分比为10％的甘油溶液、质量体积百分比为30％的脱脂乳溶液等体积混合制备而成的最优复合保护剂对乳酸乳球菌进行冷冻保藏，乳酸乳球菌的存活率平高达92％。
采用-20℃/min的降温速率进行降温并在0℃的解冻温度下进行解冻，可使得乳酸乳杆菌保持更高的存活率，其存活率平均值为93.14％。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种乳酸乳球菌的冷冻保藏方法，其特征在于：
在预定冷冻保藏条件下，采用预定保护剂对乳酸乳球菌进行冷冻保藏，并在需要使用时采用预定解冻条件进行解冻，
其中，所述预定保护剂由等体积的海藻糖溶液、蔗糖溶液、脱脂乳溶液以及甘油溶液混合制备而成，
所述海藻糖溶液的质量体积百分比为20％～30％，
所述蔗糖溶液的质量体积百分比为20％～30％，
所述脱脂乳溶液的体积百分比为20％～30％，
所述甘油溶液的体积百分比为10％～30％。
2.根据权利要求1所述的乳酸乳球菌的冷冻保藏方法，其特征在于：
其中，所述海藻糖溶液的质量体积百分比为30％。
3.根据权利要求2所述的乳酸乳球菌的冷冻保藏方法，其特征在于：
其中，所述脱脂乳溶液的体积百分比为30％。
4.根据权利要求3所述的乳酸乳球菌的冷冻保藏方法，其特征在于：
其中，所述蔗糖溶液的质量体积百分比为20％。
5.根据权利要求4所述的乳酸乳球菌的冷冻保藏方法，其特征在于：
其中，所述甘油溶液的体积百分比为10％～20％。
6.根据权利要求5所述的乳酸乳球菌的冷冻保藏方法，其特征在于：
其中，所述甘油溶液的体积百分比为10％。
7.根据权利要求1所述的乳酸乳球菌的冷冻保藏方法，其特征在于：
其中，所述预定冷冻保藏条件为以-10～-20℃/min的降温速率从4℃降温至-80℃，并在-80℃下冷冻保藏，
所述预定解冻条件为解冻温度是0～40℃。
8.根据权利要求7所述的乳酸乳球菌的冷冻保藏方法，其特征在于：
其中，所述降温速率为-20℃/min，所述解冻温度为0℃。
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