CN107250798A - 用于检测患者样品中的生物制品的间接均相迁移率变动试验 - Google Patents

用于检测患者样品中的生物制品的间接均相迁移率变动试验 Download PDF

Info

Publication number
CN107250798A
CN107250798A CN201580075470.7A CN201580075470A CN107250798A CN 107250798 A CN107250798 A CN 107250798A CN 201580075470 A CN201580075470 A CN 201580075470A CN 107250798 A CN107250798 A CN 107250798A
Authority
CN
China
Prior art keywords
soluble
biological products
integrin
separation
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201580075470.7A
Other languages
English (en)
Inventor
J·萨巴托
S·威斯汀
N·驰-关凌
A·贾因
S·辛格
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Societe des Produits Nestle SA
Original Assignee
Societe dAssistance Technique pour Produits Nestle SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Societe dAssistance Technique pour Produits Nestle SA filed Critical Societe dAssistance Technique pour Produits Nestle SA
Publication of CN107250798A publication Critical patent/CN107250798A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5434—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70546—Integrin superfamily
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • G01N2333/5434—IL-12
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70546—Integrin superfamily, e.g. VLAs, leuCAM, GPIIb/GPIIIa, LPAM
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases
    • G01N2800/065—Bowel diseases, e.g. Crohn, ulcerative colitis, IBS
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供一种灵敏特异的间接均相迁移率变动试验，其使用大小排阻色谱来测量患者样品中的生物制品，如维多珠单抗和优斯它单抗。本发明的试验对于检测靶向复杂抗原或大抗原的生物制品的存在或水平特别有利，所述抗原包括细胞表面蛋白、跨膜蛋白、高度糖基化的蛋白、和多聚体蛋白，以及不能纯化的抗原、不纯的抗原、和部分或基本上纯化的抗原。本发明还提供，适用于本文所述的间接试验的分离的可溶性α4β7整联蛋白异源二聚体和分离的可溶性IL‑12p40单体。

Description

用于检测患者样品中的生物制品的间接均相迁移率变动试验
相关申请的交叉参考
本申请要求2014年12月5日提交的美国临时申请No.62/088,465,2015 年2月6日提交的美国临时申请No.62/113,317和2015年5月8日提交的美国临时申请No.62/158,791的优先权，将其公开内容以其整体按引用并入本文中用于所有目的。
发明背景
炎性肠病(IBD)发生于全世界并且影响数百万人，是用于描述未知病因的胃肠道失调的集合术语：克罗恩病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)和未定型结肠炎(IC)。IBD与肠易激综合征(IBS)合在一起，全部美国人的一半在生命过程中受到其影响，对于IBD，支出超过$26亿美元，而对于IBS，超过$80亿美元。导致这些高医疗成本的一个主要决定因素是难于诊断消化系统疾病和这些疾病的进展。生产力的丧失会加剧IBD和 IBS的成本支出，患有这些病症的人每年比国家平均数多丢失至少8天的工作日。
尽管抗-TNFα疗法在IBD治疗中获得成功，但仍有患者亚群难以治疗，凸显了未能满足的对新疗法的医疗需求。维多珠单抗(Vedolizumab)是消化道特异性的，α4β7整联蛋白中和性单克隆抗体，其不影响外周血细胞计数并且看起来缺乏全身性效应。维多珠单抗是一种用于管理难治性患者的新的抗炎治疗可选方案。此外，优斯它单抗(ustekinumab)是IL12p40 单克隆抗体，其是另一种新的IBD治疗剂。然而，对于在IBD患者中有效使用这些新的治疗剂，需要有可用的能准确测量生物制品(如维多珠单抗和优斯它单抗)水平的诊断试验。
因此，本领域需要检测试验用于检测患者样品中的生物制品(如维多珠单抗和优斯它单抗)的存在或水平，以监控药物治疗和指导治疗决定。这样的检测试验特别可以用于监控药物功效和相应地优化疗法从而通过个性化方案对疾病(如，溃疡性结肠炎和克罗恩病)实现治疗管理，这样的检测试验可以包括评价疾病过程和临床参数，如药效动力学、疾病活动指数、疾病负荷和炎症生物标志物。本发明满足了这种需求并且还提供了相关的优势。
发明简述
本发明提供了新的用于检测和测量样品中生物制品的存在或水平的间接均相迁移率变动试验(indirect homogeneous mobility shift assay)。本发明的试验尤其可以用于检测和测量靶向复杂抗原的生物制品的存在或水平，所述抗原包括细胞表面蛋白、跨膜蛋白、高度糖基化蛋白、多聚体蛋白等。由此，本发明可以提供信息用于指导针对接受生物制品治疗的受试者作出的治疗决定、以及在优化治疗、降低毒性和/或监控生物疗法的治疗功效方面改善准确度。本发明还提供，适用于本文所述试验的分离的可溶性α4β7整联蛋白杂二聚体和分离的可溶性IL-12p40单体。
在某些方面中，本发明提供，用于测定样品中生物制品的存在或水平的方法，该方法包括：
(a)将样品接触可以结合生物制品的未标记的可溶性抗原，以在抗原和样品中的生物制品之间形成未标记的复合物；
(b)将来自步骤(a)的样品接触标记形式的生物制品，以在抗原和标记的生物制品之间形成标记的复合物；
(c)将未标记和标记的复合物进行大小排阻色谱，以将未标记和标记的复合物与游离的标记生物制品分离，并检测游离的标记生物制品的量；和
(d)将步骤(c)中检测到的游离的标记生物制品的量与已知量的生物制品的标准曲线进行比较，由此确定样品中生物制品的存在或水平。
在一些实施方案中，生物制品包括抗体、抗体片段、蛋白、多肽、肽、融合蛋白、多价结合蛋白、抗体-药物缀合物、疫苗、核酸、糖、其重组形式、其工程化形式及其组合。
在某些实施方案中，抗原是膜结合蛋白、糖基化蛋白、多聚体蛋白、不溶性蛋白、难以表达或纯化的蛋白和/或大蛋白的可溶形式(例如，可溶性片段、变体，或单体形式)。在某些情况中，抗原是膜结合蛋白的可溶性胞外结构域(例如，可溶性细胞因子受体胞外结构域)。在某些其他情况中，抗原是可溶性同源二聚体或异源二聚体，其包含两个膜结合蛋白的胞外结构域(例如，可溶性整联蛋白异源二聚体)。在再其他情况中，抗原是在分离和/或纯化后不发生多聚化并且保持单体形式的可溶性蛋白(例如，具有一个或多个半胱氨酸残基被突变以最小化或消除多聚体形成的可溶性细胞因子变体)。
在其他实施方案中，样品是全血、血清或血浆样品，例如，来自接受生物制品治疗的受试者。在优选实施方案中，样品是血清。在特定实施方案中，受试者患有疾病或病症，例如自身免疫疾病(例如，类风湿性关节炎)、炎性疾病(例如，炎性肠病(IBD)，如克罗恩病(CD)或溃疡性结肠炎(UC)，或癌症。
在特定实施方案中，通过将(例如，两倍)连续稀释的已知量的生物制品与抗原和标记的生物制品一起孵育来产生标准曲线。在某些实施方案中，将游离的标记生物制品的曲线下面积(AUC)相对于自标准曲线获得的生物制品的已知量(例如，已知量的对数)进行作图，通过内推(例如，基于游离的标记生物制品的峰面积大小)计算样品中的生物制品的水平。在其他实施方案中，将加入标记生物制品的储液中的游离标记物用作标记的生物制品的上样对照。将游离的标记生物制品与游离标记物的比值相对于生物制品的已知量进行作图。
在一个特定实施方案中，按照本文中所述的，使用大小排阻色谱，用间接均相迁移率变动试验，测定抗-α4β7整联蛋白药物(例如，维多珠单抗)的存在和/或水平。
在另一个特定实施方案中，按照本文中所述的，使用大小排阻色谱，用间接均相迁移率变动试验，测定抗-IL12p40药物(例如，优斯它单抗) 的存在和/或水平。
在其他实施方案中，使用例如美国专利No.8,574,855和8,865,417以及美国专利公开No.2014/0051184和2014/0141983中所述的均相迁移率变动试验，测定对抗抗-α4β7整联蛋白药物和抗-IL12p40药物以及其他生物制品产生的抗-药物抗体(ADA)(例如，包括HACA、HAHA等的自身抗体)的存在和/或水平，上述专利申请的公开内容以其整体按引用并入用于所有目的。
在其他方面中，本发明提供分离的可溶性α4整联蛋白多肽，其包含与 SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有至少80％同一性的氨基酸序列。再在其他方面中，本发明提供分离的可溶性β7整联蛋白多肽，其包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在特定实施方案中，本发明提供分离的可溶性α4β7整联蛋白异源二聚体，其包含：
(a)具有与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的氨基酸序列的α4 整联蛋白多肽，其中该α4整联蛋白多肽连接结合对的第一成员(例如， SEQ ID NO:3)，和
(b)具有与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的氨基酸序列的β7 整联蛋白多肽，其中β7整联蛋白多肽连接结合对的第二成员(例如，SEQ ID NO:4)。
在某些其他方面中，本发明提供分离的可溶性IL-12p40多肽，其包含与SEQ IDNO:6、7、11、12或13具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在特定实施方案中，用于本发明的间接均相迁移率变动试验中的未标记可溶性抗原包括本文中所述的分离的可溶性α4β7整联蛋白异源二聚体或分离的可溶性IL-12p40多肽。
在进一步的方面中，本发明提供编码本文中所述的可溶性多肽的表达载体，包含所述表达载体的宿主细胞和用于产生本文中所述的可溶性多肽的方法。
从以下详述和附图，本领域技术人员将清楚本发明的其他目的、特征和优点。
附图简述
图1显示本发明的间接均相迁移率变动试验(HMSA)的原理。使用维多珠单抗(“VLM”或“Vedo”)作为非限制性实例，在第一步中，将血清连同整联蛋白α4β7和稀释缓冲液一起加入96孔平板中。在第二步中，加入标记的VLM(例如，Vedo Alexa 488)。然后将样品按序注射到HPLC 大小排阻柱上。
图2显示在本发明一个实施方案中Vedo Alexa48(左)和Vedo Alexa488+整联蛋白α4β7(右)的色谱图，其中显示保留时间(x-轴)和光单位(y-轴)。两者都在4％标准人血清中。注意，抗原结合大部分标记的VLM。
图3显示在本发明一个实施方案中来自标准曲线的色谱图叠加，其中显示VLM试验的各组分的保留时间(x-轴)和光单位(y-轴)。“Vedo Alexa 488/α4β7”＝结合可溶性α4β7异源二聚体的Alexa488-标记的VLM。“Alexa 488”＝封闭的(例如，灭活的)Alexa488上样对照。注意，当存在越多治疗性VLM时，游离Vedo Alexa488峰面积越大。
图4显示在本发明一个实施方案中VLM标准曲线。使用浓度范围在 0.15625μg/ml至80μg/ml的VLM连续稀释物，产生该标准曲线。
图5显示在本发明一个实施方案中VLM药物试验的验证。使用以 0.15625μg/ml至80μg/ml浓度范围的VLM连续稀释物产生的标准曲线，计算空白限(LOB)、检出限(LOD)、定量下限(LLQQ)和定量上限 (ULQQ)。
图6显示在本发明一个实施方案中VLM药物试验的试验内精确度和准确度。
图7显示在本发明一个实施方案中抗-维多珠单抗自身抗体(ATV)试验的保留时间(x-轴)和光单位(y-轴)。
图8显示在本发明一个实施方案中ATV试验的验证。
图9显示在本发明一个实施方案中ATV试验的验证。
图10显示在本发明一个实施方案中ATV试验的试验间精确度。
图11显示在本发明一个实施方案中优斯它单抗(UTK)药物试验验证。使用以0.078μg/ml至40μg/ml浓度范围的UTK连续稀释物产生的标准曲线，计算空白限(LOB)、检出限(LOD)、定量下限(LLQQ)和定量上限(ULQQ)。
图12显示在本发明一个实施方案中针对优斯它单抗的自身抗体(ATU) 的试验的验证。
图13显示本发明的可溶性α4整联蛋白抗原和可溶性β7整联蛋白抗原的示例性实施方案的示意图。左：全长蛋白。右：具有ACID-BASE肽的半胱氨酸桥的截短α4β7整联蛋白异源二聚体。
图14显示，对于(A)(VLM)和(B)维多珠单抗自身抗体(ATV)，人血清中药物稀释的线性。
图15显示血清中常见干扰因素的分析：(A)溶血的血清干扰；(B) 脂血(lipemic)的血清干扰；和(C)RF血清干扰。
图16显示优斯它单抗(UTK)均相迁移率变动试验(HMSA)的原理。
图17显示，对于(A)UTK和(B)优斯它单抗的自身抗体(ATU)，正常人血清中稀释的线性。
图18显示血清中常见干扰因素的分析：(A)溶血的血清干扰；(B) 脂血(lipemic)的血清干扰；和(C)RF血清干扰。
图19显示在本发明VLM试验的一个实施方案中整联蛋白α4β7底物干扰。
图20显示使用固定量的标记维多珠单抗(“Vedo488”)和整联蛋白α4β7 抗原(左上)以及2-倍提高(右上)或4-倍提高(左下)量的两种试剂的标准曲线。注意，曲线的顶端在较高的VLM浓度下饱和。类似地，底端在稍高一些的VLM水平上变平。
发明详述
I.引言
本发明部分地基于如下发现：使用大小排阻色谱，间接均相迁移率变动试验(HMSA)对于测量靶向具有以下一个或多个特征的抗原的生物制品的存在或水平特别有利：细胞表面或膜结合的、(高度)糖基化的、多聚体的(例如，形成异源二聚体、同源二聚体等)、不溶的、难以表达的、难以纯化的、尺寸大的、及其组合。在某些方面中，使用抗原的可溶形式 (例如，可溶性片段、变体或单体)可以克服与具有以上一个或多个特征的抗原相关的困难和局限性，使得能够精确和准确测量来自接受生物制品治疗的患者的样品中的任何目标生物制品。
本发明的间接试验背后的原理是，获自接受生物制品治疗的患者的样品(例如，血清)中(未标记)生物制品的量决定了有多少未标记抗原可以保持游离以结合标记形式的生物制品。通过追踪游离的(未结合的)标记生物制品的面积变化，可以确定患者样品中(未标记)生物制品的存在或水平。更具体地，标记和未标记生物制品的相对量(例如，比值)决定了有多少抗原可以与之结合并决定了在大小排阻色谱后游离的标记生物制品的量(例如，峰面积)。然后可以将该游离的标记生物制品的量(例如，峰面积)与已知量的生物制品的标准曲线进行比较，以高灵敏度和动态范围来提供患者样品中生物制品水平的准确测量。在某些实施方案中，计算大小排阻色谱后游离的标记生物制品的峰面积大小，并与标准曲线比较，以内推患者样品中生物制品的浓度。
FDA要求在临床试验过程中进行药物动力学和耐受性(例如，免疫应答)研究，借由这一事实可以说明测量生物制品的血清浓度的重要性。本发明还可以用于监控接受这些药物的患者，以确保患者获得正确的剂量、药物不会太快从身体清除、以及患者不产生对抗所述药物的免疫应答。此外，本发明还可以用于指导由于初始药物失败而在不同药物之间进行的转换。
II.定义
如本文中使用的，除非另外指出，以下术语具有归属于它们的含义。
如本文中使用的术语“一个(a)”、“一个(an)”或“该(the)”不仅包括具有一个成员的方面，而且还包括具有超过一个成员的方面。例如，除非文中另有清楚指明，否则单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代物。
术语“竞争”、“基于竞争的”和“间接”在本文中可互换使用，是指用于测定样品中(未标记)生物制品的存在或水平的本发明试验，依赖于检测在将未标记抗原和标记的生物制品(按序)加入样品中后留在样品中的游离(未结合的)标记生物制品的量。
术语“VLM”、“VDZ”和“Vedo”在本文中可互换使用，是指维多珠单抗。
如本文中使用的术语“生物制品”或“生物制剂”或“生物药物”包括从生物系统(例如，活的生物体)生产或提取的产品和物质。生物制品的非限制性实例包括抗体、抗体片段、蛋白、多肽、肽、融合蛋白(例如，Ig融合蛋白或Fc融合蛋白)、多价结合蛋白(例如，DVD Ig)、抗体-药物缀合物、疫苗、核酸、糖、其重组形式、其工程化形式，及其组合。
术语“抗体”包括，通过共价(二硫化物)和非共价相互作用结合在一起的两个相同轻链(～220个氨基酸)和两个相同重链(～440个氨基酸) 组成的“Y-形”大分子(150kDa)。每个轻链和重链由含有一个链内二硫键的恒定区或可变区的重复区段组成。可变区位于轻链和重链的N-端，而恒定区位于轻链和重链的C-端。轻链和重链的N-端一起形成抗原结合位点。轻链由一个可变结构域和一个恒定结构域组成，而重链由一个可变结构域和三个恒定结构域组成。位于“Y”的两个末端的是两个相同(二价) 抗原结合位点。由于柔性铰链区，两个抗原结合位点之间的距离可以变化，并且因此，可以极大地提高抗原结合效率。通过重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的配对，引起抗原结合区的形成。可变区氨基酸序列的变化导致抗原结合位点的巨大多样性，而最大的变化发生在三个超变区中，称为互补决定区(CDR)。抗体的尾区，称为Fc区，对于每个重链，由两个恒定结构域(CH2和CH3)组成。Fc区通过结合嗜中性粒细胞和巨噬细胞上的Fc受体，负责募集效应子功能。
术语“抗原”包括与生物制品(例如，特异性地)结合或相互作用的任何分子、试剂或物质。作为一个非限制性实例，抗原包括膜结合蛋白、糖基化蛋白、多聚体蛋白、不溶性蛋白、难以表达或纯化的蛋白和/或大蛋白的可溶性片段、变体或单体。作为另一个非限制性实例，抗原包括细胞表面分子(如整联蛋白受体(例如，α4β7整联蛋白))的可溶性片段，其中可溶性片段含有相应全长分子的一个或多个胞外结构域(例如，包含来自相应全长α4和β7蛋白的胞外结构域序列的可溶性α4β7抗原异源二聚体)。作为再另一个非限制实例，抗原包括细胞因子，如TNFα或其亚基，如不形成同源二聚体或异源二聚体的IL-12p40。
术语“大小排阻色谱”或“SEC”包括，基于分子的大小和/或流体力学体积分离溶液中的分子的色谱方法。其适用于大的分子或大分子复合物，如蛋白及其缀合物。通常，当使用水性溶液将样品运输通过柱子时，该技术称为凝胶过滤色谱。
术语“复合物”包括，结合(例如，通过非共价方式)生物制品(例如，未标记或标记的生物制品)的抗原、和结合(例如，通过非共价方式)对抗生物制品的自身抗体的生物制品(例如，标记的生物制品)。
如本文中使用的，通过术语“标记”修饰的实体包括，与按经验可检测的另一个分子或化学实体缀合的任何抗原、分子、蛋白、酶、抗体、抗体片段、细胞因子或相关物质。适合作为标记的化学物质包括，但不限于，荧光染料，例如，Alexa染料，如Alexa488、量子点、光学染料、发光染料和放射性核素，例如，125I。
短语“荧光标记检测”包括用于检测荧光标记的手段。用于检测的手段包括，但不限于，分光计、荧光计、光度计和通常与色谱仪器合并的检测装置，如但不限于，大小排阻-高效液相色谱，例如，但不限于，Agilent-1200 HPLC系统。
术语“受试者”、“患者”或“个体”通常包括人，但也包括其他动物，例如，其他灵长类、啮齿动物、犬、猫、马、绵羊、猪等。
术语“样品”包括获自个体的任何生物样本。样品包括，不限于，全血、血浆、血清、红细胞、白细胞(例如，外周血单核细胞(PBMC)、多形核(PMN)细胞)、导管灌洗液、乳头抽吸物、淋巴(例如，淋巴结中散布的肿瘤细胞)、骨髓抽吸取、唾液、尿液、粪(即，粪便)、痰液、支气管灌洗液、泪液、细针抽吸物(例如，通过随机乳晕外围细针吸引收集)、任何其他体液、组织样品(如炎症部位的活检物(例如，针吸活检物))、其细胞提取物、和源自这些体液或组织中的一种或多种的免疫球蛋白富集级分。在一些实施方案中，样品是全血、其分级组分，如血浆、血清或细胞沉淀物，或其免疫球蛋白富集级分。本领域技术人员将明了，在分析前，可以稀释样品，如血清样品。在某些实施方案中，通过使用本领域已知的任何技术分离PBMC和/或PMN来获得样品。在某些其他实施方案中，样品是组织活检物，例如，来自炎症部位，如胃肠道或滑膜组织的一部分。
应用于核酸或多肽时，术语“分离的”表示，核酸或多肽基本上不含自然状态下与其相关的其他细胞组分。优选是均质状态，但也可以是干的或水溶液。通常使用分析化学技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱，来测定纯度和均质度。当多肽是制备物中存在的主要物质时，该多肽是基本上纯化的。特别地，分离的基因与位于基因侧翼的编码目标基因之外的其他蛋白的开放阅读框分离。术语“纯化的”表示核酸或多肽在电泳凝胶中产生基本上一个条带。特别地，这意味着核酸或多肽为至少约80％纯、至少约85％纯、至少约90％纯、至少约95％纯或至少约99％纯。
对于多肽，术语“可溶性”是指，可以使用宿主细胞或无细胞蛋白合成系统以可溶的功能形式制备的多肽。例如，可溶性蛋白不形成包括错误折叠和/或功能上无活性多肽的不溶性聚集物。
术语“核酸”或“多肽”包括单-或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非另有限制，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其与参照核酸具有相似的结合特性并且以天然产生的核苷酸相似的方式代谢。除非另外指出，一个具体的核酸序列还隐含包括其保守性修饰的变体(例如，简并密码子置换)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明示的该序列。具体地，可以通过产生其中一个或多个选定(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列来实现简并密码子置换(Batzer等，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等， J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等，(1992)；Rossolini等， Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。术语核酸可以与基因、cDNA和基因编码的mRNA互换使用。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，包括氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物、以及天然氨基酸的聚合物和非天然氨基酸的聚合物。如本文中使用的，该术语包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白、其截短形式或片段，其中氨基酸残基由共价肽键连接。
术语“氨基酸”是指天然产生的和非天然的氨基酸，以及以与天然氨基酸相似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。
氨基酸在本文中可以通过其名称、其通常已知的三字母符号、或 IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的其单字母符号来提及。另外，核苷酸可以通过其通常公认的单字母代码来提及。
本发明方法的步骤无需一定以呈现它们的特定顺序来实施。本领域普通技术人员将理解，本发明方法步骤的其他顺序也涵盖在本发明的范围内。
括号，“[]”表示括号内的物质通过其浓度来提及。
III.实施方案的描述
本发明提供新的用于检测和测量样品中生物制品的存在或水平的间接均相迁移率变动试验。本发明的试验对于检测靶向复杂抗原或大抗原的生物制品的存在或水平特别有利，所述抗原包括细胞表面蛋白、跨膜蛋白、高度糖基化的蛋白和多聚体蛋白、以及不能纯化的抗原、不纯的抗原和部分或基本上纯化的抗原。本发明还提供，适用于本文中所述试验的分离的可溶性α4β7整联蛋白异源二聚体和分离的可溶性IL-12p40单体。
在一个方面中，本发明提供用于测定样品中生物制品的存在或水平的方法，该方法包括：
(a)将样品接触结合生物制品的未标记的可溶性抗原，在抗原和样品中的生物制品之间形成未标记的复合物(例如，多个未标记的复合物)；
(b)将来自步骤(a)的样品接触标记形式的生物制品(“标记的生物制品”)，在抗原和标记的生物制品之间形成标记的复合物(例如，多个标记的复合物)；
(c)将(例如，多个)未标记和标记的复合物进行大小排阻色谱，以将(例如，多个)未标记和标记的复合物与游离的标记生物制品分离，并检测游离的标记生物制品的量；和
(d)将步骤(c)中检测的游离标记生物制品的量与已知量的生物制品的标准曲线进行比较，由此确定样品中生物制品的存在或水平。
在一些实施方案中，生物制品包括抗体、抗体片段、蛋白、多肽、肽、融合蛋白、多价结合蛋白、抗体-药物缀合物、疫苗、核酸、糖、其重组形式、其工程化形式及其组合。在特定实施方案中，生物制品包括抗体(例如，单克隆抗体)或其片段(例如，单克隆抗体的抗原结合片段)或其缀合物(例如，抗体-药物缀合物)。基于抗体的生物制品的非限制性实例显示于表1中。
在特定实施方案中，本发明的方法检测样品中未结合(游离)的生物制品的存在和/或测量样品中未结合(游离)的生物制品的含量，例如，样品中未结合其(内源性)靶抗原或其片段的生物制品的群。
在某些实施方案中，抗原是膜结合蛋白、(高度)糖基化蛋白、多聚蛋白、不溶性蛋白、难以表达或纯化的蛋白和/或大蛋白的可溶形式(例如，可溶性片段、变体，或单体形式)。在某些情况中，抗原是膜结合蛋白的可溶性胞外结构域(例如，可溶性细胞因子受体胞外结构域)。在某些其他情况中，抗原是可溶性同源二聚体或异源二聚体，其包含两个膜结合蛋白的胞外结构域(例如，可溶性整联蛋白异源二聚体)。再在其他情况中，抗原是一旦分离和/或纯化后不发生多聚化并且保持单体形式的可溶性蛋白(例如，具有一个或多个半胱氨酸残基被突变以最小化或消除多聚体形成的可溶性细胞因子变体)。
在一些实施方案中，抗原是细胞表面分子(例如，细胞粘附分子(CAM)) 的可溶性片段(例如，胞外结构域)。CAM的非限制性实例包括免疫球蛋白超家族(IgSF)CAM、整联蛋白、钙粘蛋白和选择蛋白。
IgSF CAM是位于细胞表面上的各种多肽或蛋白中的任何一种，其具有一个或多个免疫球蛋白样折叠结构域并且其在胞间粘着和/或信号传导中起作用。在许多情况中，IgSFCAM是跨膜蛋白。IgSF CAM的非限制性实例包括粘膜地址素细胞粘附分子1(MADCAM1)、神经细胞粘附分子(NCAM；例如，NCAM-120、NCAM-125、NCAM-140、NCAM-145、 NCAM-180、NCAM-185等)、胞间粘附分子(ICAM，例如，ICAM-1、 ICAM-2、ICAM-3、ICAM-4和ICAM-5)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)、血小板-内皮细胞粘附分子-1(PECAM-1)、L1细胞粘附分子(L1CAM)、与L1CAM同源的细胞粘附分子(L1的近同源物)(CHL1)、唾液酸结合Ig-样凝集素(SIGLEC；例如，SIGLEC-1、SIGLEC-2、SIGLEC-3、 SIGLEC-4等)、连接素(nectin)(例如，连接素-1、连接素-2、连接素 -3等)和连接素样分子(例如，Necl-1、Necl-2、Necl-3、Necl-4和Necl-5)。
整联蛋白是跨膜αβ异源二聚体，并且在人类中已知有至少18个α和8 个β亚基，产生24个异源二聚体。α和β亚基具有截然不同的结构域结构，来自各亚基的胞外结构域促成异源二聚体的配体-结合位点。整联蛋白的非限制性实例包括α1β1、α2β1、α3β1、α4β1、α5β1、α6β1、α7β1、α8β1、α9β1、α10β1、α11β1、αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、αIIbβ3、α4β7、αEβ7、α6β4、αLβ2、αMβ2、αXβ2和αDβ2。
在特定实施方案中，抗原是α4β7整联蛋白并且生物制品是抗-α4β7整联蛋白药物，如维多珠单抗(VLM)。在某些情况中，结合抗-α4β7整联蛋白药物的可溶性α4β7整联蛋白片段包括α4片段和/或β7片段，α4片段包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有至少80％同一性的氨基酸序列，β7片段包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在其他实施方案中，抗原是α4β1整联蛋白并且生物制品是抗-α4β1整联蛋白药物，如那他珠单抗(natalizumab)。在某些情况中，结合抗-α4β1 整联蛋白药物的可溶性α4β1整联蛋白片段包含α4和β1亚基的胞外结构域的异源二聚体。
钙粘着蛋白是在细胞粘附中起着重要作用的钙依赖性跨膜蛋白，形成粘着连接以将组织内的细胞结合在一起。钙粘着蛋白的非限制性实例包括 E-钙粘着蛋白、N-钙粘着蛋白、N-钙粘着蛋白2和P-钙粘着蛋白。
选择蛋白是结合岩藻糖基化的碳水化合物的异嗜性CAM(例如，粘蛋白)。三个家族成员是E-选择蛋白(内皮)、L-选择蛋白(白细胞)和 P-选择蛋白(血小板)。
在其他实施方案中，抗原是细胞表面分子(例如，细胞因子受体)的可溶性片段(例如，胞外结构域)。
细胞因子受体的非限制性实例包括I型细胞因子受体、II型细胞因子受体、免疫球蛋白(Ig)超家族的成员、肿瘤坏死因子受体、趋化因子受体和TGFβ受体。I型细胞因子受体的实例包括，但不限于，白介素受体 (例如，IL-2受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-5受体、IL-6受体、IL-7 受体、IL-9受体、IL-11受体、IL-12受体、IL-13受体、IL-15受体、IL-21 受体、IL-23受体、IL-27受体等)、集落刺激因子受体(例如，促红细胞生成素受体、GM-SF受体、G-CSF受体等)、激素受体或神经肽受体(例如，生长激素受体、催乳素受体等)和其他细胞因子受体，如制瘤素M受体和白血病抑制因子受体。II型细胞因子受体的实例包括，但不限于，干扰素受体(例如，干扰素α/β受体、干扰素γ受体等)和白介素受体(例如， IL-10受体、IL-20受体、IL-22受体、IL-28受体等)。免疫球蛋白(Ig) 超家族受体的实例包括，但不限于，IL-1受体、CSF1、c-kit受体和IL-18 受体。肿瘤坏死因子受体的实例包括，但不限于，TNF受体(CD120)、淋巴毒素β受体、CD134、CD40、FAS、TNFRSF6B、CD27、CD30、CD137、 TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF10C、TNFRSF10D、RANK、骨保护素、TNFRSF12A、TNFRSF13B、TNFRSF13C、TNFRSF14、神经生长因子受体、TNFRSF17、TNFRSF18、TNFRSF19、TNFRSF21、TNFRSF25 和外胚层发育异常蛋白A2受体。趋化因子受体的实例包括，但不限于， CXC趋化因子受体、CC趋化因子受体、C趋化因子受体和CX3C趋化因子受体。TGFβ受体的实例包括，但不限于，TGFβ受体1、TGFβ受体2 和TGFβ受体3。
在某些实施方案中，抗原是IL-6受体并且生物制品是抗-IL-6受体药物，如塔西单抗(tocilizumab)。在某些情况中，结合抗IL-6受体药物的可溶性IL-6受体片段包含IL-6受体的胞外结构域。
再在其他实施方案中，抗原是分化簇(CD)分子的可溶性片段(例如，胞外结构域)。CD分子的非限制性实例包括CD3、CD4、CD8、CD11a、 CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、 CD30、CD31、CD34、CD38、CD45、CD56、CD61、CD91、CD114、 CD117、CD182等。在某些情况中，结合CD分子的可溶性片段的生物制品是选自visilizumab、普立昔单抗(priliximab)、利妥昔单抗(rituximab)、奥法木单抗(ofatumumab)、obinutuzumab、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、托西莫单抗(tositumomab)、ocrelizumab、维妥珠单抗(veltuzumab)、达克珠单抗(daclizumab)的成员及其组合。
在一些实施方案中，抗原是细胞因子或其单体(例如，具有一个或多个半胱氨酸残基被突变以最小化或消除多聚体形成的可溶性细胞因子变体)。
细胞因子的非限制性实例包括TNFα、TNF-相关的凋亡弱诱导剂 (TWEAK)、骨保护素(OPG)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白介素(例如，IL-1α、IL-1β、IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、可溶性IL-6受体(sIL-6R)、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、 IL-15、IL-17、IL-23和IL-27)、脂肪细胞因子(例如，瘦素、脂联素、抵抗素、活性或总的纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、内脏脂肪素 (visfatin)和视黄醇结合蛋白4(RBP4)等。
在特定的实施方案中，细胞因子是IL-12或IL-23的p40亚基并且生物制品是抗-IL-12p40药物，如优斯它单抗(UTK)。在某些情况中，细胞因子是p40变体，其包含被突变的一个或多个半胱氨酸残基以最小化或消除多聚体的形成。在一些情况中，p40变体包含与SEQ ID NO:6、7、11、 12或13具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在其他实施方案中，细胞因子是TNFα并且生物制品是抗-TNFα药物。抗-TNFα药物的非限制性实例包括(英夫利昔单抗 (infliximab))、(阿达木单抗(adalimumab))、 (依那西普(etanercept))、(赛妥珠单抗(certolizumab pegol))、(戈利木单抗(golimumab))，及其组合。
本文中可溶性抗原可以通过本领域普通技术人员已知的任一种方法来生产，所述方法如但不限于，合成方法，如固相和液相合成，或重组生物学方法。
在一些实施方案中，样品是全血、血清或血浆样品，例如，获自接受生物制品治疗的受试者。在优选的实施方案中，样品是血清。在特定实施方案中，受试者患有疾病或病症，例如，自身免疫疾病(例如，类风湿性关节炎)、炎性疾病(例如，炎性肠病(IBD)，如克罗恩病(CD)或溃疡性结肠炎(UC))，或癌症。
在特定实施方案中，通过用(例如，两倍)连续稀释的已知量的生物制品孵育抗原和标记的生物制品来产生标准曲线。在某些实施方案中，将游离的标记生物制品的曲线下面积(AUC)相对于获自标准曲线的生物制品已知量(例如，已知量的对数)进行作图，并且通过内推(例如，基于游离的标记生物制品的峰面积大小)计算样品中的生物制品的水平。在其他实施方案中，确定游离标记生物制品与上样对照(例如，游离标记)的比值，并用于标化自标准曲线获得的样品中生物制品的水平。
在某些实施方案中，大小排阻色谱(SEC)是大小排阻-高效液相色谱(SE-HPLC)。在特定实施方案中，(例如，多个)未标记和标记的复合物首先被洗脱通过固定相，之后是游离的标记生物制品。SEC的基本原理是，不同大小的分子或复合物将以不同的速率通过固定相洗脱(过滤)。这导致分子或复合物基于大小的溶液分离。只要所有分子或复合物同时或接近同时上样，则相同大小的分子或复合物将一起洗脱。每个大小排阻柱具有一个可以分离的分子量范围。排阻限规定了在该范围上端的分子量，在该分子量处，分子或复合物太大以致不会被捕获在固定相中。透过限规定在该分离范围下端的分子量，在该分子量处，足够小尺寸的分子或复合物可以完全穿透进入固定相的孔中，并且低于这个分子量的所有分子或复合物是如此小以致它们作为单个条带被洗脱。
在一些情况中，在恒定的体积或级分中收集洗脱液。分子或复合物的大小越相似，它们越可能在同一级分中，越不可能被分开检测。优选，通过光谱技术来检查收集的级分，以测定洗脱的分子或复合物的浓度。通常，本发明中有用的光谱检测技术包括，但不限于，荧光计、折射率(RI)和紫外线(UV)。在某些情况中，洗脱体积随着分子流体力学体积的对数而大致线性地降低(即，较重的分子或复合物首先洗脱出来)。
可以用各种可检测基团中的任一种来标记生物制品(例如，治疗性抗体)。在某些实施方案中，生物制品用荧光团或荧光染料标记。在其它实施方案中，生物制品用发光标签、金属、放射性核素等标记。可以直接或间接检测抗原与标记的生物制品的特异性免疫结合或游离的标记生物制品的量。可以分析来自直接或间接标记的信号，例如，使用分光光度计检测来自显色底物的颜色，使用辐射计数器检测辐射，如用于检测125I的γ计数器，或使用荧光计在特定波长的光存在下检测荧光。
荧光团或荧光染料的非限制性实例包括Molecular Probes Catalogue (分子探针目录)中所列的那些，将其按引用并入本文中(参见，R. Haugland,The Handbook-AGuide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies，第10版，Molecularprobes,Inc.(2005))。这样的示例性荧光团或荧光染料包括，但不限于，Alexa染料，如Alexa 350、Alexa405、Alexa430、Alexa488、Alexa 514、Alexa532、Alexa546、Alexa555、Alexa568、Alexa594、Alexa610、Alexa633、Alexa 635、Alexa647、Alexa660、Alexa680、Alexa 700、Alexa750和/或Alexa790，以及其他荧光团，包括，但不限于，丹磺酰氯(DNS-Cl)、5-(碘代乙磺胺)荧光素(5-IAF)、荧光素5-异硫氰酸盐(FITC)、四甲基若丹明5-(和6-)异硫氰酸盐(TRITC)、 6-丙烯酰-2-二甲基氨基萘(acrylodan)、7-硝基苯并-2-氧杂-1,3,-二唑-4- 基氯(NBD-Cl)、溴化乙锭、萤光黄、盐酸5-羧基若丹明6G、丽丝胺若丹明B磺酰氯、Texas RedTM磺酰氯、BODIPYTM、萘胺磺酸(例如，1-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)、6-(对甲苯胺基)萘-2-磺酸(TNS)等)、Anthroyl 脂肪酸、DPH、十八碳四烯酸、TMA-DPH、芴基脂肪酸、荧光素-磷脂酰乙醇胺、Texas Red-磷脂酰乙醇胺、芘基-磷脂酰胆碱、芴基-磷脂酰胆碱、部花青540、1-(3-磺酸丙基)-4-[β-[2[(二-正丁基氨基)-6-萘基]乙烯基]吡啶甜菜碱(Naphtyl Styryl)、3,3’二丙基硫杂二羰花青(di S-C3-(5))、4-(对二戊基氨基苯乙烯基)-l-甲基吡啶(di-5-ASP)、Cy-3碘代乙酰胺、Cy-5-N- 羟基琥珀酰亚胺、Cy-7-异硫氰酸盐、若丹800、IR-125、噻唑橙、天青B、尼罗蓝、铝酞菁、Oxaxine 1、4’,6-二脒-2-苯基吲哚(DAPI)、Hoechst 33342、TOTO、吖啶橙、乙锭同型二聚物、N(乙氧基羰基甲基)-6-甲氧基喹啉鎓 (MQAE)、Fura-2、钙绿、羧基SNARF-6,BAPTA、香豆素、phytofluors、晕苯、金属配体复合物、700DX、700、800RS、800CW、800、Cy5、Cy5.5、Cy7、DY 676、DY680、DY682、 DY780及其混合物。其他合适的荧光团包括酶-辅因子；镧系元素、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、或其突变体和衍生物。
通常，荧光基团是选自染料类别的荧光团，包括多甲川染料(polymethines)、酞菁染料(pthalocyanines)、菁染料(cyanines)、呫吨染料(xanthenes)、芴(fluorenes)、若丹明(rhodamines)、香豆素(coumarins)、荧光素和BODIPYTM。
在某些实施方案中，荧光基团是在约650至约900nm范围发射的近红外(NIR)荧光团。近红外荧光技术的使用在生物试验中是有利的，因为其基本上消除或降低了来自生物底物自身荧光的背景。近-IR荧光技术的另一个益处在于，很大程度上减少了来自激发源的散射光，这是因为散射光强度与波长的四次方成反比。低背景荧光和低散射导致高信噪比，这对于高灵敏检测是重要的。此外，生物组织中近红外区域(650nm至900nm) 的光透射窗口使NIR荧光成为有价值的用于体内成像和亚细胞检测应用的技术，这些应用要求光透射通过生物组分。在这个实施方案的各个方面，荧光基团优选选自700DX、700、800RS、 800CW、800、Alexa660、Alexa680、Alexa 700、Alexa750、Alexa790、Cy5、Cy5.5、Cy7、DY 676、DY680、DY682和DY780。在某些实施方案中，近红外基团是 800CW、800、700DX、700或Dynomic DY676。
可以使用荧光团的化学反应性衍生物来完成荧光标记。常用的反应基团包括胺反应性异硫氰酸盐衍生物，如FITC和TRITC(荧光素和若丹明的衍生物)、胺反应性琥珀酰亚胺酯(如NHS-荧光素)和巯基反应性马来酰亚胺活化的荧光(如荧光素-5-马来酰亚胺)，其中许多是商业上可购得的。这些反应性染料中的任何一种与生物制品的反应导致荧光团和生物制品之间形成稳定的共价键。
在某些情况中，荧光标记反应后，常常需要从标记的靶分子中除去未反应的荧光团。这常常通过大小排阻色谱，利用荧光团和标记的蛋白之间的大小差异，来完成。
反应性荧光染料可以从许多来源获得。可以获得带有不同的反应基团的染料，所述反应基团用于连接靶分子内的各种功能性基团。也可以在标记试剂盒中获得这些染料，所述试剂盒含有进行标记反应的所有成分。在某些情况中，使用来自Life Technologies(目录号No.A-10235)的Alexa 488 NHS。
IV.间接均相迁移率变动试验
本发明提供，新的使用大小排阻色谱检测和测量样品中生物制品(“药物”)的存在或水平的间接试验。本发明的试验对于检测靶向复杂抗原或大抗原的药物的存在或水平特别有利，所述抗原包括细胞表面蛋白、跨膜蛋白、高度糖基化的蛋白和多聚蛋白，以及不能纯化的抗原、不纯的抗原、和部分或基本上纯化的抗原。抗原没有标记，并且因此患者药物/抗原复合物不出现在色谱图中。间接试验背后的原理在于，患者药物的量决定了有多少未标记抗原可以保持游离以结合标记形式的药物。通过追踪游离(未结合的)标记药物的面积变化，可以确定存在多少患者药物。
在某些方面中，本文中所述的间接试验的第一步包括，含有治疗性药物(例如，维多珠单抗(VDZ))的样品(例如，血清)用固定量的所述药物的抗原(例如，可溶性α4β7)孵育。在第二步中，加入固定量的标记药物(例如，与Alexa488偶联的VDZ)。样品中的治疗药物的量决定了有多少抗原保持游离并且可用于结合标记的药物。这转而决定了有多少标记的药物是游离的。由于游离的标记药物的峰面积与样品中的治疗药物的量成比例，因此可以通过从含有已知量药物的标准曲线进行内推来定量治疗药物的量。
以下对本发明间接试验原理的描述使用维多珠单抗(VDZ)作为治疗药物，该描述只是为了举例说明性的目的(参见图1)，并且不旨在限制用于检测或测量患者样品中其他生物制品的存在或水平的试验方法的范围：
1.向每个患者样品(例如，血清)中，加入固定量的抗原(例如，可溶性α4β7)和标记的VDZ。可以以受控的比例向每个样品中加入抗原和标记VDZ的量。例如，加入将结合高达约75-80％的标记VDZ的抗原量，可以提供最佳的灵敏度，且不限制试验的动态范围。通过用固定量的标记 VDZ滴定抗原来测定抗原与标记VDZ的比例，以便当将抗原加入标记 VDZ中时，游离的标记VDZ的峰降低约75-80％(参见，图2)。
2.可以通过追踪标记VDZ的峰面积增加(Rt＝7.5-8.5min)来进行定量。这个面积与存在的治疗药物的量成比例。可以将Tris-阻断的Alexa488 加入标记VDZ的储液中作为上样对照。可以在Agilent ChemStation收集原始色谱图，并随后传输至程序“R”用于自动化分析。可以通过将标记VDZ 的峰面积作为已知VDZ样品浓度log的函数作图，产生标准曲线。可以使用10-点标准曲线并用5-参数logistic(5-PL)模型拟合来说明不对称性。可以通过内推法从标准曲线测定未知量。
在某些实施方案中，加入样品中的抗原与标记药物的比例是这样的，在该比例下各试剂的量在所需的下限灵敏度以及动态范围(使得能够测量患者样品中的药物而不需要稀释)之间提供最佳的折衷。作为非限制性实例，加入样品中的抗原与标记药物的比例为，抗原量结合约75％至约80％(例如，约75％、76％、77％、78％、79％或80％)的标记药物。在一些情况中，加入样品中的抗原与标记药物的比例为，抗原量结合至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的标记药物。在其他情况中，加入样品中的抗原与标记药物的比例为，抗原量结合约50％至约 90％、约60％至约90％、约70％至约90％、约80％至约90％、约50％至约80％、约60％至约80％、约70％至约80％、约50％至约70％、约 60％至约70％，或约50％至约60％的标记药物。可以通过用固定量的标记药物滴定抗原来测定抗原与标记药物的比例，以便当将抗原加入标记药物时，游离的标记药物的峰降低所需的百分比(例如，约75-80％)。
在某些其他实施方案中，可以通过按比例地提高加入样品中的抗原和标记药物两者的量来提高本文中所述的间接试验的动态范围。在一些情况中，抗原和标记药物两者的量，比抗原和标记药物的参照量，高约1.5倍、 1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、 5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍或10 倍。作为非限制性实例，标记VDZ的参照量可以为约75ng，而标记VDZ 的提高量可以为约120ng(即，比参照量高1.6倍)。
在一些实施方案中，本文中所述的间接试验的定量下限(LLOQ)为约 0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.375μg/mL、0.5μg/mL、0.625μg/mL、0.75 μg/mL、0.875μg/mL、1μg/mL、1.25μg/mL、1.5μg/mL、1.75μg/mL、2 μg/mL、3μg/mL、4μg/mL或5μg/mL。在其他实施方案中，本文中所述的间接试验的定量上限(ULOQ)为约8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、11 μg/mL、12μg/mL、13μg/mL、14μg/mL、15μg/mL、16μg/mL、17μg/mL、 18μg/mL、19μg/mL、20μg/mL、21μg/mL、22μg/mL、23μg/mL、24μg/mL、 25μg/mL、26μg/mL、27μg/mL、28μg/mL、29μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、 40μg/mL、45μg/mL或50μg/mL。在特定实施方案中，LLOQ为约1μg/mL，而ULOQ为约25μg/mL。
V.可溶性α4β7整联蛋白多肽抗原
在一个方面中，本发明提供，包含与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、 88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％序列同一性的氨基酸序列的分离的可溶性α4整联蛋白多肽。在一些实施方案中，分离的可溶性α4整联蛋白多肽包含人α4整联蛋白胞外域的β-螺旋桨重复(即，重复1-7)和thigh结构域(参见，图13；“α4Δ620”)，或其片段。在另一个实施方案中，分离的可溶性α4整联蛋白多肽包含人α4 整联蛋白胞外域的β-螺旋桨重复、thigh结构域和一个或两个Calf结构域 (即，Calf-1和/或Calf-2)，或其片段。再在其他实施方案中，分离的可溶性α4整联蛋白多肽是包含完整的人α4整联蛋白胞外域的截短受体。本文中描述的分离的可溶性α4整联蛋白多肽包括配体结合结构域或其一部分。
在一些实施方案中，分离的可溶性α4整联蛋白多肽还包括ACID肽。该肽可以具有与SEQ ID NO:08具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、 89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。ACID肽可以与BASE肽形成α-螺旋卷曲螺旋构象。在一些实施方案中，ACID肽包括可以与BASE肽上的半胱氨酸残基形成二硫桥的半胱氨酸残基。酸性卷曲螺旋区域肽(ACID肽)和碱性卷曲螺旋区域肽(BASE肽)描述于例如O’Shea等，CurrBiol,1993,3:658-667, Jun等，Proc Natl Acad Sci U.S.A.,2001,98(12):6830-6835,Takagi等，Nat Struct.Biol.,2001,8:412-416,Nishida等，Immunity,2006,25:583-594和Dong等，Biochemistry,2012,51(44):8814-8828。
在一些实施方案中，分离的可溶性α4整联蛋白多肽包括接头，如一个或多个氨基酸残基，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸残基。接头可以位于胞外域的末端和ACID肽之间。
在一些实施方案中，分离的可溶性α4整联蛋白多肽包含与SEQ ID NO: 3具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、 85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
可溶性α4整联蛋白多肽还可以包括亲和性标签或表位标签，如组氨酸标签、亲和素标签、V5标签、FLAG标签、HA标签、Myc标签、可断裂标签等。在一些情况中，可溶性α4整联蛋白多肽可以包括荧光标签，如 GFP、DsRed、CFP、YFP、RFP等，或其他可检测标签，如辣根过氧化物酶、氯霉素乙酰转移酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶等。
在另一个方面中，本发明提供分离的可溶性β7整联蛋白多肽，其包含与SEQ IDNO:2具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的可溶性β7整联蛋白多肽包含人β7整联蛋白胞外域的PSI结构域、I-样结构域、杂合结构域和I-EGF 1结构域(参见，图13；“β7Δ527”)，或其片段。在其他实施方案中，分离的可溶性β7整联蛋白多肽包含人β7整联蛋白胞外域的PSI结构域、I-样结构域和一个或两个杂合结构域中的一个或多个，或其片段。再在其他实施方案中，分离的可溶性β7整联蛋白多肽包含人β7整联蛋白胞外域的PSI结构域、I-样结构域、杂合结构域、I-EGF结构域(即，结构域1-4)和任选的β-尾，或其片段。在进一步的实施方案中，分离的可溶性β7整联蛋白多肽是包含完整人β7整联蛋白胞外域的截短受体。本文中描述的可溶性β7整联蛋白多肽包括配体结合结构域或其部分。
在一些实施方案中，分离的可溶性β7整联蛋白多肽还包括BASE肽。该肽可以具有与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、 81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。BASE肽可以与ACID肽形成α-螺旋卷曲螺旋构象。
在一些实施方案中，分离的可溶性β7整联蛋白多肽包括蛋白酶断裂位点。在一些情况中，断裂位点是烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶断裂位点。 TEV位点可以包括氨基酸序列EXXYXQ/S，其中X是任何氨基酸残基 (SEQ ID NO:10)。TEV位点可以位于BASE肽上游。
在一些实施方案中，分离的可溶性β7整联蛋白多肽包括接头，如一个或多个氨基酸残基，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸残基。接头可以位于β7整联蛋白胞外域的EGF-I结构域末端和断裂位点之间。
在一些实施方案中，分离的可溶性β7整联蛋白多肽进一步包含亲和标签或表位标签。有用的亲和或表位标签包括，但不限于，组氨酸标签、亲和素标签、V5标签、FLAG标签、HA标签、Myc标签、可断裂标签等。在一些情况中，可溶性β整联蛋白多肽可以包括荧光标签，如GFP、DsRed、 CFP、YFP、RFP等，或其他可检测标签，如辣根过氧化物酶、氯霉素乙酰转移酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶等。
在一些实施方案中，分离的可溶性β7整联蛋白多肽包含与SEQ ID NO: 4具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、 85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
分离的可溶性β7整联蛋白多肽可以结合本文中所述的可溶性α4整联蛋白多肽，形成复合物，如共价连接的异源二聚体。在一些情况中，α4β7 整联蛋白复合物可以结合α4β7配体，如但不限于VCAM-1和MAdCAM-1，以及结合抗α4β7整联蛋白的抗体，如，但不限于，维多珠单抗、那他珠单抗和etrolizumab。
在一些方面中，本发明提供分离的可溶性α4β7整联蛋白多肽，其包含可溶性α4整联蛋白多肽和可溶性β7整联蛋白多肽，所述可溶性α4整联蛋白多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、 81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其中α4整联蛋白多肽与结合对的第一成员连接，所述可溶性β7整联蛋白多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其中β7整联蛋白多肽与所述结合对的第二成员连接。
在一些实施方案中，结合对可以是能够允许α4亚基和β7亚基形成异源二聚体(如共价连接的异源二聚体)的任何肽、分子、基序和化合物。α4β7异源二聚体能够结合α4β7配体，如，但不限于，VCAM-1和 MAdCAM-1，以及结合抗α4β7整联蛋白抗体，如，但不限于，维多珠单抗、那他珠单抗和etrolizumab。可溶性α4整联蛋白多肽和可溶性β7整联蛋白多肽可以通过半胱氨酸桥或其衍生物异源二聚体化(参见，图13)。在一些实施方案中，结合对选自由卷曲-螺旋肽、亮氨酸拉链肽、对接锁定 (dock-and-lock)肽、亲和素-生物素，及其衍生物。在一些情况中，卷曲 -螺旋肽是ACID-BASE肽。
本文中描述的多肽可以通过本领域普通技术人员已知的任一种方法来产生，如但不限于，合成方法，如固相和液相合成，或重组生物方法，如本文中描述的那些。
在其他方面中，本发明提供编码可溶性α4β7整联蛋白多肽的表达载体，其包含第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列包含编码可溶性α4整联蛋白多肽的核酸序列和编码结合对的第一成员的核酸序列，其中所述可溶性α4整联蛋白多肽具有与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、 87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，所述第二多核苷酸序列包含编码可溶性β7整联蛋白多肽的核酸序列和编码结合对的第二成员的核酸序列，其中所述可溶性β7整联蛋白多肽具有与SEQ ID NO:2具有至少 80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、 87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合对的第一成员是ACID肽。在一些实施方案中，结合对的第一成员是BASE 肽。在一些情况中，第二多核苷酸序列还包含编码亲和标签(如组氨酸标签)的核酸序列。在一些情况中，第二多核苷酸序列还包含编码蛋白酶断裂位点(如TEV位点)的核酸序列。
在一些实施方案中，第一多核苷酸序列包含编码多肽的核酸序列，所述多肽具有与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、 81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二多核苷酸序列包含编码多肽的核酸序列，所述多肽具有与SEQ ID NO:4具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，表达载体能够指引多核苷酸序列在特定细胞类型中优先表达。表达载体可以是质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、噬菌体、杆状病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、酵母质粒等。表达载体还可以包含启动子。有用的启动子包括组成型启动子和诱导型启动子。表达载体的第一多核苷酸序列和/或第二多核苷酸序列可以可操作地连接启动子。可以根据含有表达载体的宿主细胞或用于产生或生产由本文中所述的表达载体编码的可溶性α4β7整联蛋白多肽的宿主细胞，选择启动子。表达载体可以包括调控元件、选择标记盒、抗生素抗性盒，或任何其他有助于宿主细胞表达多肽的组分。
在一些实施方案中，第一和第二多核苷酸序列存在于单个表达载体中。这样的多核苷酸序列可以位于双顺反子表达载体中，使得IRES序列位于载体中第一和第二多核苷酸序列之间。单个启动子可以驱动两个多核苷酸序列的表达。在一些实施方案中，第一多核苷酸序列可操作地连接启动子并且位于编码核糖体跳跃(skip)(如病毒2A肽)的核酸序列紧上游，而编码核糖体跳跃的核酸序列就位于第二多核苷酸序列紧上游。在其他实施方案中，第二多核苷酸序列可操作地连接启动子并且位于编码核糖体跳跃的核酸序列紧上游，而编码核糖体跳跃的核酸序列就位于第一多核苷酸序列紧上游。可溶性α4整联蛋白多肽和可溶性β7整联蛋白多肽可以从一个表达载体产生。
用于构建表达载体的方法是本领域普通技术人员已知的。实验方案和方法的详细描述可以见于例如Green,M.R.和Sambrook,J.编辑， Molecular Cloning:A LaboratoryManual，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012)，Ausubel,F.M.等， Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 99),John Wiley& Sons,New York(2012)；Berger和Kimmel,Guide to Molecular CloningTechniques,Methods in Enzymology:第152卷，Academic Press,Inc.,San Diego,CA,(1987)；和PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press,SanDiego,CA,(1990)。
在其他方面中，本发明提供包含任一个编码本文中所述的可溶性α4β7 整联蛋白多肽的表达载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是稳定的细胞系，如，但不限于，HEK293细胞、CHO细胞、COS细胞、Jurkat细胞、NIH3T3 细胞及其衍生物。宿主细胞可以是细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞、哺乳动物细胞、非人细胞、或人细胞。合适的宿主细胞描述于Goeddel,Gene Expression Technology: Methods inEnzymology,185,Academic Press,San Diego,CA,(1990)。
可以通过方法，包括但不限于转化、转染、脂质转染、核转染、微注射、电穿孔、生物轰击、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质: 多核苷酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒、和试剂增强的DNA吸收，将表达载体引入宿主细胞中。
再在另一个方面中，本发明提供产生由本文中所述的任一个表达载体编码的可溶性α4β7整联蛋白多肽的方法。所述方法包括(a)将编码可溶性α4β7整联蛋白多肽的表达载体引入宿主细胞中，(b)在产生可溶性α4β7 整联蛋白多肽的条件下培养所得到的宿主细胞，和(c)分离可溶性α4β7 整联蛋白多肽。
可以在允许、促进或诱导可溶性α4β7整联蛋白多肽产生的条件下培养含有表达载体的细胞。
可溶性α4整联蛋白多肽、可溶性β7整联蛋白多肽和可溶性α4β7整联蛋白多肽可以从例如细胞培养物上清液或细胞提取物的可溶性级分纯化，纯化可以根据本领域已知的标准方法进行，包括但不限于，色谱(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备性等电聚焦)、差异溶解性(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取 (参见，例如，Protein Purification,J.C.Janson和Lars Ryden编辑，VCH Publishers，纽约，(1989))，以获得基本上纯的多肽。用于蛋白纯化、色谱、电泳、离心和结晶的方法描述于例如Coligan等，Current Protocols in Protein Science，第1卷，John Wiley and Sons,Inc.，纽约，(2000)。
可溶性重组α4β7整联蛋白多肽可以与其关连配体(cognate ligand)复合，如特异性地结合野生型、全长α4β7整联蛋白的配体。可溶性重组α4β7整联蛋白多肽可以是针对抗-α4β7整联蛋白抗体的抗原。
VI.可溶性IL-12p40多肽抗原
在一个方面中，本发明提供分离的可溶性IL-12p40多肽，其包含与SEQ ID NO:6、11、12或13具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该多肽进一步包含亲和标签。在其他实施方案中，分离的可溶性IL-12p40多肽包含与SEQ ID NO:7具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、 88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该多肽进一步包含亲和标签。在特定实施方案中，可溶性IL-12p40多肽是单体，并且不能二聚化或形成多聚体。
在另一个方面中，本发明提供包含多核苷酸序列的编码可溶性 IL-12p40多肽的表达载体，所述多核苷酸序列包含编码IL-12p40多肽的核酸序列，其中所述多肽具有与SEQID NO:6、11、12或13具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、 87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。该多核苷酸序列可以进一步包含编码亲和标签的核酸序列。这样的亲和标签可以是组氨酸标签，如六组氨酸。亲和标签的其他非限制性实例包括亲和素标签、V5标签、FLAG 标签、HA标签、Myc标签、可断裂标签等。在一些实施方案中，多核苷酸包含编码IL-12p40多肽的核酸序列，其中所述多肽具有与SEQ ID NO: 7具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、 85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，表达载体能够指引多核苷酸序列在特定细胞类型中优先表达。表达载体可以是质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、细菌噬菌体、杆状病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、酵母质粒等。表达载体还可以包含启动子。有用的启动子包括组成型启动子和诱导型启动子。表达载体的多核苷酸序列可以可操作地连接启动子。可以根据选择来产生或生产由本文中所述的表达载体编码的可溶性IL-12p40多肽的宿主细胞来选择启动子。表达载体可以包括调控元件、选择标记盒、抗生素抗性盒，或任何其他有助于多肽表达的组分。
用于构建表达载体的方法是本领域普通技术人员已知的。实验方案和方法的详细描述参见例如Green,M.R.和Sambrook,J.编辑，Molecular Cloning:A LaboratoryManual，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012)，Ausubel,F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 99),John Wiley&Sons,New York(2012)；Berger和Kimmel,Guide to Molecular CloningTechniques, Methods in Enzymology:第152卷，Academic Press,Inc.,San Diego,CA,(1987)；和PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press,SanDiego,CA,(1990)。
在其他方面中，本发明提供包含编码本文中所述的可溶性IL-12p40多肽的任一个表达载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是稳定的细胞系，如，但不限于，HEK293细胞、CHO细胞、COS细胞、Jurkat细胞、NIH3T3 细胞及其衍生物。宿主细胞可以是细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞、哺乳动物细胞、非人细胞、或人细胞。合适的宿主细胞描述于Goeddel,Gene Expression Technology: Methods inEnzymology,185,Academic Press,San Diego,CA,(1990)。
可以通过方法，包括但不限于转化、转染、脂质转染、核转染、微注射、电穿孔、生物轰击、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质: 多核苷酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒、和试剂增强的DNA吸收，将表达载体引入宿主细胞中。
再在另一个方面中，本发明提供产生由本文中所述的任一个表达载体编码的可溶性IL-12p40多肽的方法。所述方法包括(a)将编码可溶性 IL-12p40多肽的表达载体引入宿主细胞中，(b)在产生可溶性IL-12p40 多肽的条件下培养所得到的宿主细胞，和(c)分离可溶性IL-12p40多肽。
可以在允许、促进或诱导可溶性IL-12p40多肽产生的条件下培养含有表达载体的细胞。
可溶性IL-12p40多肽可以从例如细胞培养物上清液或细胞提取物的可溶性级分纯化，其中纯化可以根据本领域已知的标准方法进行，包括但不限于，色谱(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备性等电聚焦)、差异溶解性(例如，硫酸铵沉淀)、 SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,J.C.Janson和Lars Ryden编辑，VCH Publishers，纽约，(1989))，以获得基本上纯的多肽。用于蛋白纯化、色谱、电泳、离心和结晶的方法描述于例如Coligan 等，Current Protocols in ProteinScience，第1卷，John Wiley and Sons,Inc.，纽约，(2000)。
与野生型IL-12p40不同，本文中所述的可溶性重组IL-12p40多肽不能形成二聚体、三聚体或寡聚体。在特定实施方案中，野生型IL-12p40多肽中两个半胱氨酸置换为丙氨酸(SEQ ID NO:6)或两个半胱氨酸置换为丝氨酸(SEQ ID NO:11)，以防止IL-12p40抗原寡聚化。在其他实施方案中，可溶性IL-12p40多肽单体具有野生型IL-12p40多肽序列，其中一个半胱氨酸置换为丙氨酸和一个半胱氨酸置换为丙氨酸(SEQ ID NO:12或 13)。抗IL-12p40抗体，如优斯它单抗，可以特异性地结合可溶性重组 IL-12p40多肽。
VII.生物制品治疗
本发明的间接均相迁移率变动试验适用于检测和/或测量来自受试者 (例如，正接受生物制品治疗的受试者)的样品中生物制品的存在或水平。生物制品的非限制性实例包括抗体、抗体片段、蛋白、多肽、融合蛋白(例如，Ig融合蛋白或Fc融合蛋白)、多价结合蛋白(例如，DVD Ig)、抗体-药物缀合物、疫苗、核酸、糖、其重组形式、其工程化形式，及其组合。
基于抗体的生物制品的实例包括，但不限于，诊断或治疗性单克隆抗体及其抗原结合片段或缀合物。在某些实施方案中，抗体包括抗-整联蛋白药物，如抗-α4β7整联蛋白药物(例如，维多珠单抗(ENTYVIOTM)、 etrolizumab)和/或抗-α4β1整联蛋白药物(例如，那他珠单抗)。在其他实施方案中，抗体包括抗-细胞因子药物，如抗-IL12p40药物(例如，优斯它单抗)。再在其他实施方案中，抗体包括抗细胞因子受体药物，如抗-IL6受体药物(例如，塔西单抗)。在进一步的实施方案中，抗体包括抗-CD受体药物，如抗-CD3受体药物 (例如，visilizumab)、抗-CD4受体药物(例如，普立昔单抗)、抗-CD20 受体药物(例如，利妥昔单抗奥法木单抗 obinutuzumab替伊莫单抗托西莫单抗ocrelizumab、维妥珠单抗)、抗-CD25受体药物(例如，达克珠单抗)，或其组合。在其他实施方案中，抗体包括抗-TNFα药物，如英夫利昔单抗阿达木单抗依那西普戈利木单抗赛妥珠单抗或其组合。基于抗体的生物制品的其他实例包括抗体-药物缀合物，如brentuximab vedotin
表1提供了已经获得批准或目前在研发中的诊断和治疗性单克隆抗体的示例性和非穷举性列表。在题为“418Biotechnology Medicines in Testing Promise to Bolsterthe Arsenal Against Disease”的2006PhRMA报告和题为“Medicines in Development–Biologics”的2013PhRMA报告中，提供了生物制品药物的全面列表，包括在临床研发和获批产品中的、基于单克隆抗体的治疗剂和诊断剂，在此将上述文献的公开内容全部按引用并入本文中用于所有目的。
基于蛋白或基于多肽的生物制品的非限制性实例包括细胞因子(例如，白介素)、趋化因子、生长激素、血液产生刺激蛋白(例如，红细胞生成素)、激素(例如，(促卵泡激素)、生长激素)、酶(例如，(阿法链道酶))、凝血因子、胰岛素、白蛋白、其片段、其保守性修饰变体、其类似物，及其组合。
细胞因子的实例包括，但不限于，TNFα、凋亡的TNF-相关弱诱导剂 (TWEAK)、骨保护素(OPG)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白介素(例如，IL-1α、IL-1β、IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、可溶性IL-6受体(sIL-6R)、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-23和IL-27)、脂肪细胞因子(例如，瘦素、脂联素、抵抗素、活性或总的纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、内脏脂肪素和视黄醇结合蛋白4(RBP4))，及其组合。在特定实施方案中，白介素包括 IL-2，如(阿地白介素；重组IL-2)。
趋化因子的实例包括，但不限于，CXCL1/GRO1/GROα、CXCL2/GRO2、 CXCL3/GRO3、CXCL4/PF-4、CXCL5/ENA-78、CXCL6/GCP-2、 CXCL7/NAP-2、CXCL9/MIG、CXCL10/IP-10、CXCL11/I-TAC、 CXCL12/SDF-1、CXCL13/BCA-1、CXCL14/BRAK、CXCL15、CXCL16、 CXCL17/DMC、CCL1、CCL2/MCP-1、CCL3/MIP-1α、CCL4/MIP-1β、 CCL5/RANTES、CCL6/C10、CCL7/MCP-3、CCL8/MCP-2、CCL9/CCL10、 CCL11/Eotaxin、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14/HCC-1、CCL15/MIP-5、CCL16/LEC、CCL17/TARC、CCL18/MIP-4、 CCL19/MIP-3β、CCL20/MIP-3α、CCL21/SLC、CCL22/MDC、 CCL23/MPIF1、CCL24/Eotaxin-2、CCL25/TECK、CCL26/Eotaxin-3、CCL27/CTACK、CCL28/MEC、CL1、CL2、CX3CL1，及其组合。
生长因子的非限制性实例包括表皮生长因子(EGF)、肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、色素上皮衍生因子(PEDF；也称为SERPINF1)、双调蛋白(AREG；也称为神经鞘瘤衍生的生长因子(SDGF))、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3等)、内皮缩血管肽(ET-1)、角质细胞生长因子(KGF；也称为FGF7)、骨形态生成蛋白(例如，BMP1-BMP15)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、神经生长因子(NGF)、β-神经生长因子(β-NGF)、神经营养因子(例如，脑衍生的神经营养因子(BDNF)、神经营养因子3 (NT3)、神经营养因子4(NT4)等)、生长分化因子-9(GDF-9)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、 myostatin(GDF-8)、红细胞生成素(EPO)、促血小板生成素(TPO)，及其组合。
基于受体构建体或基于融合蛋白的生物制品的实例包括，但不限于，连接免疫球蛋白框架的天然受体(例如，(阿巴西普(abatacept)；免疫球蛋白CTLA-4融合蛋白)、(alefacept；IgG1融合蛋白)、(依那西普；重组人TNF-受体融合蛋白)、结合两个不同多肽物质的工程化蛋白(例如，(地尼白介素(denileukin diftitox)；包含白介素-2和白喉毒素的工程化蛋白)，及其组合。
本发明因此可以用于检测和测量来自正接受生物制品治疗的受试者的样品中生物制品的存在或水平的方法中，所述生物制品治疗本文和表1中提及的一种或多种疾病或病症，包括以下的一种或多种：
炎症疾病，如炎性肠炎(IBD)(例如，克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC))、葡萄膜炎、结节病、韦格纳肉芽肿和其他具有炎症作为中心特征的疾病；
自身免疫疾病，如类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、全身性红斑狼疮(SLE)、强直性脊柱炎(Bechterew’s病)、狼疮、牛皮癣关节炎、青少年特发性关节炎、牛皮癣、全身性红斑狼疮和乳糜泻；
癌症，如消化道和胃肠道癌(例如，结直肠癌、小肠(small intestine) (小肠(small bowel)癌)；胃肠间质瘤、胃肠类癌瘤、结肠癌、肾癌、肛门癌、胆道癌、胃(gastric)(胃(stomach))癌；食道癌；盲肠癌；等)；胆囊癌；肝癌；胰腺癌；乳癌；肺癌(例如，非小细胞肺癌)；前列腺癌；卵巢癌；肾癌(例如，肾细胞癌)；中枢神经系统的癌症；皮肤癌；绒毛膜癌；头颈癌；恶性血液病(例如，白血病、淋巴瘤，如B-细胞非霍奇金淋巴瘤)；成骨性肉瘤(例如，Ewing肉瘤)；软组织肉瘤(例如，隆凸性皮肤纤维肉瘤(DFSP)、横纹肌肉瘤)；其他软组织恶性疾病，和甲状腺乳头状癌；
感染性疾病，如艰难梭菌(C.difficile)病、呼吸道合胞病毒(RSV)、 HIV、炭疽病、念珠菌病、葡萄球菌感染和丙肝；
血液疾病，如脓毒病、脓毒性休克、阵发性睡眠性血红蛋白尿和溶血性尿毒综合征；
心血管疾病，如动脉粥样硬化、急性心肌梗死、心肺分流术和心绞痛；
代谢病症，如糖尿病，例如，1型糖尿病和2型糖尿病；
遗传病症，如阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)；
神经学病症，如骨关节炎疼痛和阿尔茨海默病；
呼吸病症，如哮喘、慢性梗阻性肺病(COPD)、鼻息肉和小儿哮喘；
皮肤病，如牛皮癣，包括慢性中度至重度斑块状牛皮癣；
移植排斥，如急性肾移植排斥、心脏和肝移植排斥的逆转、肾移植排斥的预防、急性肾移植排斥的预防、和肾移植排斥；和/或
其他疾病，如肾脏炎症、绝经期后骨质疏松(骨病)、嗜酸细胞增多综合征、嗜酸细胞食管炎和花生过敏。
在特定实施方案中，受试者患有炎性疾病(例如，炎性肠病(IBD)，如克罗恩病(CD)或溃疡性结肠炎(UC))或自身免疫疾病(例如，类风湿性关节炎)。
VIII.实施例
提供以下实施例用于举例说明目的，不旨在以任何方式来限制本发明。本领域技术人员将容易地认识到各种非关键性参数，其可以变化或改变来产生实质上相同的结果。
实施例1
本实施例举例说明，用于测量炎性肠病(IBD)患者血清中的维多珠单抗(VLM)和抗-VLM抗体(ATV)的均相迁移率变动试验(HMSA)的验证。
维多珠单抗(VLM)，α4β7整联蛋白拮抗剂，是最近批准的治疗性单克隆抗体，用于不能充分响应常规治疗或TNFα拮抗剂的中度至重度溃疡性结肠炎或克罗恩病患者。α4β7整联蛋白是肠道特异性异源二聚体糖蛋白，其对于肠内白细胞归巢至炎症部位是重要的，所述归巢经由α4β7整联蛋白与肠血管内皮上表达的粘膜地址素细胞细胞粘附分子-1(MadCam-1) 的相互作用实行。对于在IBD患者中有效使用这种新的治疗剂，获得可以准确测量VLM药物水平和抗-VLM抗体的诊断试验是必需的。继我们的抗-TNFα治疗药物监控试验之后，我们现在已经研发并验证了测量患者血清中的VLM和抗-VLM水平的试验。
方法
从哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)表达和纯化可溶性α4β7蛋白异源二聚体。特别地，在thigh结构域后截短整联蛋白α4亚基(α4Δ620)，在I-EGF 1结构域后截短整联蛋白β7(β7Δ527)(参见，图13)。将含有一个二硫桥形成Cys残基的酸性/碱性α-螺旋卷曲螺旋肽连接至这些亚基的C-末端，以稳定异源二聚体(Takagi等，Embo J.,18:4607-4615(2003)； O’Shea等，Curr.Biol.,3:658-667(1993))。将六组氨酸标签与碱性肽的C-末端融合，以促进纯化。将这种重组的异源二聚体用于基于“竞争”的均相迁移率变动试验(HMSA)形式中，以测量接受VLM治疗的患者血清中的VLM水平。将患者血清与α4β7组合，以允许治疗性VLM结合α4β7。随后，荧光标记的VLM与患者血清中的未标记VLM竞争结合其靶标α4β7，接着在HPLC大小排阻色谱上分离。“游离的”VLM-alexa fluor 的量确定了患者血清中的VLM水平。对于该抗-VLM试验，通过如下形成标准曲线：用荧光标记的VLM孵育含有已知量的兔抗-VLM抗体的正常人血清；然后通过SEC-HPLC分离结合的和游离的VLM。根据行业建议确定方法验证。
结果
VLM的灵敏度为0.35μg/mL。确定了定量的上限和下限(LLOQ和 ULOQ)分别为0.625μg/mL和14μg/mL。对于抗-VLM，LLOQ和ULOQ 分别为3.13U/ml和150U/ml。针对每个试验产生的标准曲线显示出了高重复性和灵敏性。试验间和试验内的精确度显示出低于10％CV且准确度在20％内。不存在来自脂血(lipemic)、溶血或类风湿因子(Rf)血清的明显干扰。参见，图4-10。
结论
已经研发并验证了灵敏且特异性的试验来测量正接受IBD治疗的患者中的VLM和抗-VLM水平。由于大异源二聚体的、高度糖基化的、膜结合的抗原作为药物靶标的复杂性，所述试验形式需要独特的方法。药物试验和抗药物试验都显示出高准确性和精确性，并具有高灵敏度，对已知的干扰因素具有高容忍性。所述试验对于个体患者的临床监控和药物优化是有用的。
实施例2
本实施例举例说明均相迁移率变动试验(HMSA)的验证，该试验用于测量炎性肠病(IBD)患者血清中的优斯它单抗(UTK)和抗优斯它单抗抗体(ATU)。
优斯它单抗是在不能响应常规治疗或TNFα拮抗剂的IBD患者的治疗中具有潜在实用性的治疗性单克隆抗体。优斯它单抗是对白介素12和白介素23(经由其共有的p40亚基)具有特异性的单克隆抗体，并且通过这些途径阻断炎症。我们在此描述了对用于测量UTK以及抗优斯它单抗抗体的基于HPLC的高迁移率变动试验的分析验证。
方法
从哺乳动物细胞表达和纯化重组的可溶性IL12p40亚基(例如，SEQ ID NO:7)。该试验利用了荧光标记的UTK与患者血清中未标记的UTK对 IL12p40的竞争结合。用重组IL12p40孵育患者血清后，添加UTK-alexa fluor 488，之后在HPLC大小排阻柱上运行样品，从而将“游离”UTK-alexa fluor 488与结合IL12p40的UTK-alexa fluor 488分开。“游离”UTK-alexa fluor 488的量是患者血清中治疗性UTK量的量度。将“游离”UTK-alexa fluor488的曲线下面积(AUC)相对于已知标准样品中的UTK浓度的对数作图，通过内推法计算患者血清中的UTK浓度。对于ATU试验，通过如下形成标准曲线：用荧光标记的UTK孵育含有已知量的兔ATU的正常人血清；然后通过SEC-HPLC分离结合的和游离的GLM。根据行业建议确认方法验证。
结果
UTK的灵敏度为0.15μg/ml。确定定量的上限(ULOQ)为8μg/mL，而确定定量的下限(LLOQ)为0.625μg/mL。对于ATU，LLOQ和ULOQ 分别为3.13U/ml和150U/ml。针对每个试验产生的标准曲线显示出高的可重复性和灵敏度。试验间和试验内精确性显示了低于10％CV，并且准确性在20％内。不存在来自脂血(lipemic)、溶血或类风湿因子(Rf)血清的明显干扰。参见，图11-12。
结论
本研究描述了对新的基于“竞争”的试验的验证，所述试验用于测量正接受IBD治疗的患者中优斯它单抗的水平。由于抗原在血清中形成同源二聚体和异源二聚体的趋势，造成难以使用常规HMSA测定，因此考虑到操作该抗原的复杂性，该试验形式需要独特的方法进行。
基于竞争的HMSA试验显示出高准确性和精确性，并具有高灵敏度。此外，所述试验对已知干扰因素具有高容忍性。这些试验对于个体患者的临床监控和药物优化是有用的。
实施例3
本实施例描述了本发明的示例性维多珠单抗(VLM)竞争试验方法。本领域普通技术人员将认识到本实施例中描述的试验方法适用于在如下情形中确定样品中优斯它单抗(UTK)以及其他生物制品的存在或水平，在所述情形下，操作与生物制品结合的抗原(例如，抗原是膜结合的蛋白、糖基化蛋白、多聚蛋白、不溶性蛋白、难以表达或纯化的蛋白，和/或大蛋白)的复杂性使得必须使用抗原的可溶形式(例如，可溶性片段、变体或单体)。
将掺入了已知量的维多珠单抗(VLM)的正常人血清(NHS)连续稀释。从80μg/mlVLM开始在NHS中两倍连续稀释来制备10-点曲线(即， 80μg/ml至0.15625μg/ml)。将掺入了12、4和1μg/ml VLM的NHS用作阳性对照。将标准血清样品、阳性对照和患者样品加入96孔平板中。加入未稀释的或在NHS中4×或8×稀释的患者样品，以增加试验的动态范围。加入可溶性α4β7抗原和试验稀释剂。将平板置于摇床上并且允许在室温孵育1小时。1小时后，加入标记的VLM(例如，VLM-Alexa488)。将平板再次置于摇床上，孵育1小时。使用0.2μm过滤板将样品过滤。将样品上样于HPLC自动取样机上并按序通过大小排阻色谱柱(例如，Phenomenex BioSep-SEC-s3000柱)运行，其将分离游离的标记的VLM(例如，VLM-Alexa488)与结合可溶性α4β7整联蛋白的标记的VLM。
以R编程语言书写的软件用于鉴别代表游离的标记的VLM(例如， VLM-Alexa488)的峰并确定峰面积。当患者血清中存在VLM时，这个峰的面积会变大。通过将该峰的大小与标准曲线相比较，可以内推患者的VLM水平。
使用Prism(例如，GraphPad Prism 6)，通过将游离的标记VLM(例如，VLM-Alexa488)的面积作为血清VLM水平的函数绘图，产生标准曲线。通过将该峰的大小与标准曲线相比较，可以内推患者的VLM 药物浓度。
本实施例中描述的试验的前提是，来自正接受VLM治疗的患者的样品中的VLM和加入样品反应物中的标记的VLM之间对可溶性α4β7抗原存在结合竞争。标记的和未标记的VLM的相对比例确定了有多少α4β7抗原分别与之结合，并确定了游离的标记VLM(例如，VLM-Alexa488) 的峰面积。患者样品中存在越多药物，将有越多的标记VLM保持游离而非结合于α4β7抗原。
实施例4
本实施例举例说明对用于测量炎性肠病(IBD)患者血清中的维多珠单抗(VLM)和抗-VLM抗体的均相迁移率变动试验(HMSA)的验证。
背景和目的
维多珠单抗，α4β7整联蛋白拮抗剂，是最近批准的治疗性单克隆抗体，用于不能充分响应常规治疗或TNFα拮抗剂的中度至重度溃疡性结肠炎或克罗恩病患者。可获得准确测量血清VLM和抗-VLM(ATV)水平的诊断试验，对于在IBD患者中有效使用这种新的治疗剂是必需的。我们在此分析验证了研发用于测量患者血清中VDM和ATV水平的HMSA及其临床实用性。
方法
在哺乳动物细胞中表达和纯化可溶性α4β7异源二聚体(例如，α4Δ620/β7Δ527异源二聚体；参见，图13)。将该重组异源二聚体用于基于“竞争”的HMSA形式中，用于测量正接受VLM治疗的患者中的血清 VLM水平。将患者血清与α4β7混合，以允许治疗性VLM结合α4β7。随后，荧光标记的VLM与患者血清中未标记的VLM竞争结合其靶标α4β7，接着在HPLC大小排阻色谱上分离(参见，图1)。对于抗VLM试验，通过如下方式形成标准曲线：用荧光标记的VLM孵育含有已知量的兔抗VLM抗体的正常人血清，；然后通过SEC-HPLC分离结合的和游离的VLM。根据行业推荐进行了验证(Shankar，G.等，2008)。
结果
VLM和ATV试验显示出高的试验内精确性和准确性。试验内精确性低于10％，试验内准确性低于15％误差。运行与运行之间、仪器与仪器之间，以及分析物与分析物之间的变异性在几乎所有情况中低于15％CV和低于20％误差(表2)。针对VLM的灵敏度为0.348μg/mL，具有 0.625-14μg/mL的动态范围(表3)。ATV试验的检出限为<1.56U/mL。不能确定精确值，因为该值太低以致不能插入我们的曲线中。ATV的动态范围在未稀释的血清中为3.13-150U/mL(表3)。掺入了VLM或ATV 的正常人血清显示出跨连续稀释的良好线性和回收率(recovery)(图14)。 ATV显示出在20μg/mL VLM水平下的高耐药性(表4)。测试了患者血清中的常见干扰因素，在IBD患者中看到的水平下没有干扰(图15)。
表2.针对试验的准确性和精确性的验证数据
VLM-HMSA的准确性和精确性
ATV-HMSA的准确性和精确性
表3.每个试验的定量限
表4.抗-VLM试验中的药物干扰
Vedo[μg/mL] 总ATV[U/mL]
20 51.6
0 49.2
20 26.4
0 24.8
20 13
0 14
结论
已经研发并验证了一种灵敏且特异性的试验来测量正接受IBD治疗的患者中的VLM和抗-VLM水平。由于大异源二聚体的、高度糖基化的膜蛋白作为药物靶标的复杂性，这种试验形式需要一种独特的方法。药物试验和抗药物试验都显示了高准确性和精确性、以及对已知干扰因素的容忍性。VLM和抗-VLM试验的研发对于个体患者中的临床监控和药物优化是有用的。
实施例5
本实施例举例说明对用于测量炎性肠病(IBD)患者血清中的优斯它单抗(UTK)和抗优斯它单抗抗体(ATU)的均相迁移率变动试验(HMSA) 的验证。
背景和目的
优斯它单抗是在不能响应常规治疗或TNFα拮抗剂的IBD患者的治疗中具有潜在实用性的治疗性单克隆抗体。优斯它单抗对IL-12和IL-23(经由其共有的p40亚基)具有特异性，并且通过这些途径阻断炎症。可获得准确测量血清UST和抗-UST(ATU)水平的诊断试验，对于在IBD患者中有效利用这种新的治疗剂是必需的。在此，我们分析验证了研发用于测量UTK水平的基于“竞争”的HMSA以及用于测量患者血清中的ATU水平的常规HMSA。
方法
从哺乳动物细胞表达和纯化重组的、可溶性的IL12p40(例如，SEQ ID NO:7)。将重组IL12p40用于基于“竞争”的HMSA形式中，以测量接受 UTK治疗的患者中的血清UTK水平。将患者血清与rIL12p40混合以允许治疗性UTK结合rIL12p40。随后，荧光标记的UTK与患者血清中未标记的UTK竞争结合其靶标，rIL12p40，接着在HPLC大小排阻色谱上分离(参见，图16)。对于抗UTK试验，通过如下形成标准曲线：用荧光标记的UTK孵育含有已知量的兔抗-UTK抗体的正常人血清；然后通过 SEC-HPLC分离结合的和游离的UTK。
结果
UTK和ATU试验显示出高的试验内精确性和准确性。试验内精确性低于10％，试验内准确性低于15％误差。运行与运行之间、仪器与仪器之间，以及分析物与分析物之间的变异性低于15％CV和低于20％误差(表 5)。针对UTK的灵敏度为0.224μg/mL，具有0.625-10μg/mL的动态范围(表6)。ATU试验的检出限为<1.56U/mL。不能确定精确值，因为该值太低以致不能从标准曲线内推得出。ATV的动态范围在未稀释的血清中为3.13-150U/mL(表6)。掺入了UTK或ATU的正常人血清显示出在试验动态范围内跨连续稀释的良好线性和回收率(图17)。ATU显示出高耐药性。20μg/mL的UTK水平不显著干扰ATU检测(表7)。测试了患者血清中常见的干扰因素，并且在IBD患者中看到的水平下没有干扰。只有高度溶血的血清可能潜在干扰，但在患者血清中正常可见的水平下没有干扰(图18)。
表5.试验的精确性和准确性的验证数据
UTK-HMSA的准确性和精确性
ATU-HMSA的准确性和精确性
表6.每个试验的定量限
定量限
表7.抗-UTK试验中的药物干扰
UTK[μg/mL] 总ATU[U/mL]
20 58.8
0 51.7
20 16.7
0 22.1
20 5.6
0 9.2
结论
用于UTK和ATU的HMSA显示出在宽动态范围内的高准确性和精确性。HMSA平台允许检测UTK和ATU，即使在已知限制ELISA/ECLIA 方法应用的干扰因素存在下也可以。新的基于“竞争”的HMSA平台的研发允许在常规HMSA不可行时测量治疗性药物的水平。
实施例6
本实施例举例说明，通过实施实验以提高用于维多珠单抗(VDZ)测量的均相迁移率变动试验(HMSA)的动态范围。
在改善试验的动态范围的努力中，通过将试验中使用的VDZ-Alexa488 的量提高1.6倍来改进试验。提高标记的VDZ的量并成比例地提高α4β7 抗原(例如，α4Δ620/β7Δ527异源二聚体；参见，图13)的量，改善了试验的动态范围。此外，改变α4β7相对于标记VDZ的量影响了定量的下限。相对于标记VDZ的过量抗原使得试验相对地对患者血清中的药物不敏感并且升高了定量的下限。相反，相对于标记VDZ太少的抗原具有降低定量上限的作用。将标记VDZ的量从75ng/孔提高至120ng/孔(1.6倍)并滴定抗原以使存在的抗原结合75-80％标记的VDZ，可以在所需的下限灵敏度以及改善的动态范围(使得能够在大多数情况下不需要稀释即可以测量患者血清中的药物)之间提供最佳的平衡。
此外，将数据作图，可以将VDZ-Alexa488的峰面积(没有除以封闭的 Alexa488对照峰面积)相对于VDZ浓度的对数作图。
I.试验限
空白限(Limit of Blank)
从标准曲线空白的30个重复测定了空白限(LOB)。所有试验中的标准曲线空白(阴性对照)由在每100μL注射中4％正常人血清+40ng VDZ-Alexa488+165ngα4β7组成。计算了VDZ-Alexa488峰面积的平均值 (mean)+1.645SD并随后用于LOD的计算。
表8.试验的空白限(LOB)
N 30
平均值(VDZ-Alexa488峰面积) 1.91
SD(VDZ-Alexa488峰面积) 0.09
平均值(mean)+1.645SD 2.06
内推得出的LOB 0.156/ml*
*平均值(mean)+1.645SD刚好低于曲线的最低点并且因此取曲线上的最低点用于LOB。
检出限
通过利用测量的LOB和血清重复(含有接近LOB的低浓度的VDZ)，测定了检出限(LOD)。选择标准10，因为这是曲线上的最低点并且最接近LOB。使用等式：LOD＝LOB+1.645(SD低浓度样品)计算了LOD(Armbruster 等，2008)。然后从用于该计算的实验的平均标准曲线，内推得出该值，产生以μg/mL计的浓度。
表9.试验的检出限
N 30
平均(VDZ-Alexa488峰面积) 1.91
SD(VDZ-Alexa488峰面积) 0.061
1.645*SD 0.100
内推的(1.645*SD) 太低以致不能内推
LOD＝平均值(mean)+3*SD 0.457μg/mL
定量限
通过分析低浓度VDZ阳性样品的30个重复的内推浓度，确定了定量下限(LLOQ)。在这种情况中，选择了标准8(0.625μg/mL的有效血清浓度)。通过分析高浓度VDZ阳性样品(有效血清浓度等于14μg/mL) 的30个重复，确定了定量上限(ULOQ)。将LLOQ规定为导致CV≤20％，误差≤25％的浓度，并且由此测量低分析物浓度下试验的精确性和准确性。还通过CV≤20％，误差≤25％定量了ULOQ。
表10.LLOQ和ULOQ
LLOQ ULOQ
N 30 30
预期的(μg/mL) 1 25
平均值(μg/mL) 1.05 20.95
SD(μg/mL) 0.12 1.44
CV(％) 11.39 6.86
误差(％) 5.13 -16.19
这些标准导致了用于试验限的以下值：
表11.试验定量限
LOD 0.457μg/mL
LLOQ 1μg/mL
ULOQ 25μg/mL
2.干扰
抗维多珠单抗抗体(ATV)的干扰
在本实验中，将2.5、5、10和20μg/mL VDZ加入正常的人血清或各种浓度的兔ATV阳性血清中。然后使用试验分析了这些样品并计算％回收率。
表12.ATV干扰
在此实验中，对ATV的试验容忍性高达6.25U/ml。ATV干扰是预期的，因为中和性ATV将与α4β7竞争结合患者VDZ。预期只有结合非中和性ATV的VDZ得到检测。
整联蛋白α4β7底物干扰
为了检查α4β7的干扰，在1至1000ng/mL范围中进行了滴定。VDZ 浓度作图在X-轴的截距上，对应于每种干扰因素的零浓度(图19)。
表13.α4β7干扰(100ng/mL)
从远超过预期在VDZ治疗的患者血清中看到的水平的α4β7水平，没有明显干扰。
3.抗原稳定性
通过在4度(4℃)下储存一周来评价α4β7抗原的稳定性。1周后，从 4℃储存中取出α4β7并相对在-70℃储存的新鲜等份试样进行分析。然后将来自4℃储存样品的数据与储存前获得的进行比较，并计算百分比误差。如果误差在25％内，则认为等份试样在4℃是稳定的。
表14.加速的稳定性
α4β7的加速稳定性。将储存在-70℃的抗原用于该试验中，以检查VDZ 阳性对照。对照出自规格范围内(误差≤25％和CV≤25％)。将储存在4℃的抗原用于试验中，以检查VDZ阳性对照。这些对照也出自规格范围内。此外，作为储存在4℃vs.-70℃的结果，没有明显的抗原效力损失。
4.其他动态范围实验
使用1×量标记的VDZ(例如，75ng/孔VDZ-Alexa488)，以及2×和4×量，产生了三个标准曲线。图20显示，成比例地提高试验中使用的 VDZ-Alexa488和整联蛋白α4β7的浓度可以增加试验的动态范围。还可以提高对抗药物抗体的容忍性。1μg/mL的最大LLOQ是针对该试验的标准。特别地，将标记的VDZ和α4β7的量提高1.6倍能够实现1μg/mL的最大 LLOQ，同时提供25μg/mL的提高的顶端范围(参见，表11)。
尽管为了理解清楚的目的，通过说明书和实施例，较为详细地描述了之前的发明，但本领域技术人员将认识到可以在所附权利要求的范围内实施某些改变和变化。此外，本文中提供的每篇参考文献全部按引用并入，就如同每篇参考文献单独按引用并入一样。
序列表
SEQ ID NO：1
人α4整联蛋白片段
MAWEARREPGPRRAAVRETVMLLLCLGVPTGRPYNVDTESALLYQGPHNTLFGYSVVLHSHGANRWLLVGAPTANWLANASVINPGAIYRCRIGKNPGQTCEQLQLGSPNGEPCGKTCLEERDNQWLGVTLSRQPGENGSIVTCGHRWKNIFYIKNENKLPTGGCYGVPPDLRTELSKRIAPCYQDYVKKFGENFASCQAGISSFYTKDLIVMGAPGSSYWTGSLFVYNITTNKYKAFLDKQNQVKFGSYLGYSVGAGHFRSQHTTEVVGGAPQHEQIGKAYIFSIDEKELNILHEMKGKKLGSYFGASVCAVDLNADGFSDLLVGAPMQSTIREEGRVFVYINSGSGAVMNAMETNLVGSDKYAARFGESIVNLGDIDNDGFEDVAIGAPQEDDLQGAIYIYNGRADGISSTFSQRIEGLQISKSLSMFGQSISGQIDADNNGYVDVAVGAFRSDSAVLLRTRPVVIVDASLSHPESVNRTKFDCVENGWPSVCIDLTLCFSYKGKEVPGYIVLFYNMSLDVNRKAESPPRFYFSSNGTSDVITGSIQVSSREANCRTHQAFMRKDVRDILTPIQIEAAYHLGPHVISKRSTEEFPPLQPILQQKKEKDIM KKTINFAR
SEQ ID NO：2
人β7整联蛋白片段
MVALPMVLVLLLVLSRGESELDAKIPSTGDATEWRNPHLSMLGSCQPAPSCQKCILSHPSCAWCKQLNFTASGEAEARRCARREELLARGCPLEELEEPRGQQEVLQDQPLSQGARGEGATQLAPQRVRVTLRPGEPQQLQVRFLRAEGYPVDLYYLMDLSYSMKDDLERVRQLGHALLVRLQEVTHSVRIGFGSFVDKTVLPFVSTVPSKLRHPCPTRLERCQSPFSFHHVLSLTGDAQAFEREVGRQSVSGNLDSPEGGFDAILQAALCQEQIGWRNVSRLLVFTSDDTFHTAGDGKLGGIFMPSDGHCHLDSNGLYSRSTEFDYPSVGQVAQALSAANIQPIFAVTSAALPVYQELSKLIPKSAVGELSEDSSNVVQLIMDAYNSLSSTVTLEHSSLPPGVHISYESQCEGPEKREGKAEDRGQCNHVRINQTVTFWVSLQATHCLPEPHLLRLRALGFSEELIVELHTLCDCNCSDTQPQAPHCSDGQGHLQCGVCSCAPGRLGRLCECSVAELSSPDLESGC
SEQ ID NO：3
带有酸性肽的人α4整联蛋白片段
MAWEARREPGPRRAAVRETVMLLLCLGVPTGRPYNVDTESALLYQGPHNTLFGYSVVLHSHGANRWLLVGAPTANWLANASVINPGAIYRCRIGKNPGQTCEQLQLGSPNGEPCGKTCLEERDNQWLGVTLSRQPGENGSIVTCGHRWKNIFYIKNENKLPTGGCYGVPPDLRTELSKRIAPCYQDYVKKFGENFASCQAGISSFYTKDLIVMGAPGSSYWTGSLFVYNITTNKYKAFLDKQNQVKFGSYLGYSVGAGHFRSQHTTEVVGGAPQHEQIGKAYIFSIDEKELNILHEMKGKKLGSYFGASVCAVDLNADGFSDLLVGAPMQSTIREEGRVFVYINSGSGAVMNAMETNLVGSDKYAARFGESIVNLGDIDNDGFEDVAIGAPQEDDLQGAIYIYNGRADGISSTFSQRIEGLQISKSLSMFGQSISGQIDADNNGYVDVAVGAFRSDSAVLLRTRPVVIVDASLSHPESVNRTKFDCVENGWPSVCIDLTLCFSYKGKEVPGYIVLFYNMSLDVNRKAESPPRFYFSSNGTSDVITGSIQVSSREANCRTHQAFMRKDVRDILTPIQIEAAYHLGPHVISKRSTEEFPPLQPILQQKKEKDIMKKTINFARTGGLAQCEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQ
SEQ ID NO：4
人β7整联蛋白片段，带有肽Velcro的BASE-p1序列(在七肽重复肽的“d”位置含有Cys)、带有TEV断裂位点和His6标签
MVALPMVLVLLLVLSRGESELDAKIPSTGDATEWRNPHLSMLGSCQPAPSCQKCILSHPSCAWCKQLNFTASGEAEARRCARREELLARGCPLEELEEPRGQQEVLQDQPLSQGARGEGATQLAPQRVRVTLRPGEPQQLQVRFLRAEGYPVDLYYLMDLSYSMKDDLERVRQLGHALLVRLQEVTHSVRIGFGSFVDKTVLPFVSTVPSKLRHPCPTRLERCQSPFSFHHVLSLTGDAQAFEREVGRQSVSGNLDSPEGGFDAILQAALCQEQIGWRNVSRLLVFTSDDTFHTAGDGKLGGIFMPSDGHCHLDSNGLYSRSTEFDYPSVGQVAQALSAANIQPIFAVTSAALPVYQELSKLIPKSAVGELSEDSSNVVQLIMDAYNSLSSTVTLEHSSLPPGVHISYESQCEGPEKREGKAEDRGQCNHVRINQTVTFWVSLQATHCLPEPHLLRLRALGFSEELIVELHTLCDCNCSDTQPQAPHCSDGQGHLQCGVCSCAPGRLGRLCECSVAELSSPDLESGCGGLENGYFQGGKNAQCKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQGGHHHHHH
SEQ ID NO：5
人IL-12p40野生型
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPC
SEQ ID NO：6
人IL-12p40变体(C199A，C274A)
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSAAPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFAVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPC
SEQ ID NO：7
具有六组氨酸标签的人IL-12p40变体(C199A，C274A)
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSAAPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFAVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCHHHHHH
SEQ ID NO：8
具有半胱氨酸残基(3)的ACID肽
AQCEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQ
SEQ ID NO：9
具有半胱氨酸残基的(16)、TEV断裂位点(3-9)和六组氨酸标签(46-51)的BASE肽
GGLENGYFQGGKNAQCKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQGGHHHHHH
SEQ ID NO：10
TEV断裂位点
EXXYXQ/S
X是任何氨基酸残基
SEQ ID NO：11
人IL-12p40变体(C199S，C274S)
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSASPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFSVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPC
SEQ ID NO：12
人IL-12p40变体(C199A，C274S)
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSAAPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFSVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPC
SEQ ID NO：13
人IL-12p40变体(C199S，C274A)
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSASPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFAVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPC。

Claims (35)

1.一种用于测定样品中生物制品的存在或水平的方法，该方法包括：
(a)将样品接触结合生物制品的未标记的可溶性抗原，以在抗原和样品中的生物制品之间形成未标记的复合物；
(b)将来自步骤(a)的样品接触标记形式的生物制品，以在抗原和标记的生物制品之间形成标记的复合物；
(c)将未标记和标记的复合物进行大小排阻色谱，以将未标记和标记的复合物与游离的标记生物制品分离，并检测游离的标记生物制品的量；和
(d)将步骤(c)中检测的游离的标记生物制品的量与已知量的生物制品的标准曲线进行比较，由此确定样品中生物制品的存在或水平。
2.权利要求1的方法，其中抗原包括膜结合蛋白、糖基化蛋白、多聚体蛋白、不溶性蛋白、难以表达或纯化的蛋白和/或大蛋白的可溶性片段、变体或单体。
3.权利要求1或2的方法，其中抗原是细胞表面分子的可溶性片段。
4.权利要求3的方法，其中细胞表面分子是细胞粘附分子(CAM)。
5.权利要求4的方法，其中细胞粘附分子(CAM)是选自Ig超家族CAM、整联蛋白、钙粘蛋白和选择蛋白的成员。
6.权利要求5的方法，其中整联蛋白是α4β7整联蛋白。
7.权利要求6的方法，其中可溶性片段包含α4片段和/或β7片段，所述α4片段包含与SEQID NO:1或SEQ ID NO:3具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述β7片段包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少80％同一性的氨基酸序列。
8.权利要求6或7的方法，其中生物制品是维多珠单抗。
9.权利要求1或2的方法，其中抗原是细胞因子或其单体。
10.权利要求9的方法，其中细胞因子是IL-12或IL-23的p40亚基。
11.权利要求10的方法，其中p40亚基包含与SEQ ID NO:6、7、11、12或13具有至少80％同一性的氨基酸序列。
12.权利要求10或11的方法，其中生物制品是优斯它单抗。
13.权利要求1至12任一项的方法，其中通过用连续稀释的已知量的生物制品孵育抗原和标记的生物制品来产生标准曲线。
14.权利要求1至13任一项的方法，其中将游离的标记生物制品的曲线下面积(AUC)相对于已知量的生物制品的对数作图，并通过内推计算样品中的生物制品的水平。
15.权利要求1至14任一项的方法，其中样品是血清。
16.权利要求1至15任一项的方法，其中标记的生物制品是荧光团标记的生物制品。
17.权利要求1至16任一项的方法，其中从接受生物制品治疗的受试者获得样品。
18.分离的可溶性α4整联蛋白多肽，其包含与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的氨基酸序列。
19.权利要求18的分离的可溶性α4整联蛋白多肽，进一步包含ACID肽。
20.权利要求18或19的分离的可溶性α4整联蛋白多肽，进一步包含接头。
21.权利要求18至20任一项的分离的可溶性α4整联蛋白多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有至少80％同一性。
22.权利要求18至21任一项的分离的可溶性α4整联蛋白多肽，进一步包含亲和标签。
23.分离的可溶性β7整联蛋白多肽，包含与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的氨基酸序列。
24.权利要求23的分离的可溶性β7整联蛋白多肽，进一步包含BASE肽。
25.权利要求23或24的分离的可溶性β7整联蛋白多肽，进一步包含蛋白酶断裂位点。
26.权利要求23至25任一项的分离的可溶性β7整联蛋白多肽，进一步包含亲和标签。
27.权利要求23至26任一项的分离的可溶性β7整联蛋白多肽，进一步包含接头。
28.权利要求23至27任一项的分离的可溶性β7整联蛋白多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4具有至少80％同一性。
29.分离的可溶性α4β7整联蛋白多肽，其包含：
(a)α4整联蛋白多肽，其具有与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中α4整联蛋白多肽连接结合对的第一成员，和
(b)β7整联蛋白多肽，其具有与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中β7整联蛋白多肽连接结合对的第二成员。
30.权利要求29的分离的可溶性α4β7整联蛋白多肽，其中结合对选自卷曲-螺旋肽、亮氨酸拉链肽、对接锁定(dock-and-lock)肽、亲和素-生物素，及其衍生物。
31.权利要求30的分离的可溶性α4β7整联蛋白多肽，其中卷曲-螺旋肽是ACID-BASE肽。
32.权利要求29至31任一项的分离的可溶性α4β7整联蛋白多肽，其中α4整联蛋白多肽和β7整联蛋白多肽经由半胱氨酸桥或其衍生物异二聚体体化。
33.分离的可溶性IL-12p40多肽，其包含与SEQ ID NO:6、11、12或13具有至少80％同一性的氨基酸序列。
34.权利要求33的分离的可溶性IL-12p40多肽，其中所述多肽进一步包含亲和标签。
35.权利要求33或34的分离的可溶性IL-12p40多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ IDNO:7具有至少80％同一性。
CN201580075470.7A 2014-12-05 2015-12-04 用于检测患者样品中的生物制品的间接均相迁移率变动试验 Pending CN107250798A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462088465P 2014-12-05 2014-12-05
US62/088,465 2014-12-05
US201562113317P 2015-02-06 2015-02-06
US62/113,317 2015-02-06
US201562158791P 2015-05-08 2015-05-08
US62/158,791 2015-05-08
PCT/IB2015/059381 WO2016088104A2 (en) 2014-12-05 2015-12-04 Indirect homogeneous mobility shift assays for the detection of biologics in patient samples

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107250798A true CN107250798A (zh) 2017-10-13

Family

ID=55025290

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580075470.7A Pending CN107250798A (zh) 2014-12-05 2015-12-04 用于检测患者样品中的生物制品的间接均相迁移率变动试验

Country Status (15)

Country Link
US (3) US10422807B2 (zh)
EP (2) EP3227683B1 (zh)
JP (1) JP2018500553A (zh)
KR (1) KR20170091717A (zh)
CN (1) CN107250798A (zh)
AU (1) AU2015356613A1 (zh)
BR (1) BR112017011545A2 (zh)
CA (1) CA2969609C (zh)
ES (1) ES2735085T3 (zh)
HK (1) HK1244880B (zh)
IL (1) IL252396A0 (zh)
MX (1) MX2017007232A (zh)
RU (1) RU2017122720A (zh)
SG (1) SG11201704200SA (zh)
WO (1) WO2016088104A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114624343A (zh) * 2020-12-10 2022-06-14 中国科学院大连化学物理研究所 一种用于血清中45种炎症及免疫代谢物相对定量的方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ621655A (en) 2009-10-26 2015-08-28 Nestec Sa Assays for the detection of anti-tnf drugs and autoantibodies
CN103782172A (zh) 2011-07-06 2014-05-07 雀巢产品技术援助有限公司 检测针对使用TNFα的生物疗法的中和性自体抗体的测定法
MX2017007232A (es) 2014-12-05 2017-10-16 Nestec Sa Ensayos de desplazamiento por movilidad homogeneos indirectos para la deteccion de productos biologicos en muestras de pacientes.
WO2023057995A1 (en) * 2021-10-08 2023-04-13 Kashiv Biosciences, Llc Separation of pre-peak and post-peak in fusion protein sample by using size exclusion high performance liquid chromatography
CA3234491A1 (en) * 2021-10-08 2023-04-13 Kashiv Biosciences, Llc Separation of pre-peak in fusion protein sample by using size exclusion high performance liquid chromatography

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080286774A1 (en) * 2007-05-16 2008-11-20 The Regents Of The University Of California Real-time individualized therapy evaluation
CN102695955A (zh) * 2009-10-26 2012-09-26 普罗米修斯实验室股份有限公司 检测抗-tnf药物和自身抗体的试验
US20140051184A1 (en) * 2012-08-15 2014-02-20 Nestec S.A. Mobility shift assays for detecting anti-tnf alpha drugs and autoantibodies thereto

Family Cites Families (84)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3107755A1 (de) 1981-02-28 1982-09-16 Degussa Ag, 6000 Frankfurt Katalysatoren fuer die herstellung von 3-cyanpyridin
US5700466A (en) 1981-09-08 1997-12-23 The Rockefeller University Method of ameliorating or preventing septic shock using a monoclonal antibody specific to cachectin/tumor necrosis factor
US4459359A (en) 1981-11-19 1984-07-10 New York Blood Center, Inc. Sensitive immunoassays of antigens or antibodies sequestered within immune complexes
US5672347A (en) 1984-07-05 1997-09-30 Genentech, Inc. Tumor necrosis factor antagonists and their use
US4857456A (en) 1985-04-30 1989-08-15 The Regents Of The University Of California Assay of Bone morphogenetic protein (BMP) and anti-BMP antibody for the diagnosis of bone disorders
FR2590674B1 (fr) 1985-11-25 1989-03-03 Inst Nat Sante Rech Med Nouveaux reactifs de diagnostic
DE3631229A1 (de) 1986-09-13 1988-03-24 Basf Ag Monoklonale antikoerper gegen humanen tumornekrosefaktor (tnf) und deren verwendung
US5223395A (en) 1988-12-01 1993-06-29 Centocor, Inc. Immunometric assays for tumor necrosis factor-alpha and methods for preventing the loss of biological activity of tumor necrosis factor-alpha in biological samples
EP0440044A1 (en) 1990-01-31 1991-08-07 Abbott Laboratories Avoidance of human anti-mouse antibody interference in in vitro diagnostic testing
US5094740A (en) 1990-02-16 1992-03-10 Glycomed, Inc. Two-dimensional electrophoretic separation of carbohydrates
GB9028123D0 (en) 1990-12-28 1991-02-13 Erba Carlo Spa Monoclonal antibodies against human tumor necrosis factor alpha
US6284471B1 (en) 1991-03-18 2001-09-04 New York University Medical Center Anti-TNFa antibodies and assays employing anti-TNFa antibodies
JPH04303867A (ja) 1991-03-30 1992-10-27 Toshiba Corp 画像形成装置
US5582998A (en) 1991-06-19 1996-12-10 Boehringer Ingelheim International Gmbh Monoclonal antibodies against human TNF-binding protein I (TNF-BP I) and immunoassays therefor
JPH0566222A (ja) 1991-09-09 1993-03-19 Tosoh Corp 物質の分析方法
DK0672141T3 (da) * 1992-10-23 2003-06-10 Immunex Corp Fremgangsmåder til fremstilling af opløselige, oligomere proteiner
US5837242A (en) 1992-12-04 1998-11-17 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
EP0642021B1 (en) 1993-09-07 2000-11-02 Wako Pure Chemical Industries Ltd Process for measuring complement activity and reagent used therefor
JPH07110331A (ja) 1993-09-07 1995-04-25 Wako Pure Chem Ind Ltd ヒト補体価測定方法及びヒト補体価測定用試薬組成物
JPH07140144A (ja) 1993-11-19 1995-06-02 S R L:Kk アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の測定方法および抗原抗体複合体の測定方法
EP1298144A3 (en) 1994-12-28 2006-05-31 University of Kentucky Research Foundation Murine monoclonal anti-idiotype antibody 3H1
US6903183B1 (en) 1996-06-07 2005-06-07 Texas Tech University Health Services Center Compositions and methods for regulation of steroidogenesis
JP3718435B2 (ja) 1996-08-12 2005-11-24 積水化学工業株式会社 細胞機能測定用容器及び細胞機能測定方法
AU727500B2 (en) 1996-08-12 2000-12-14 Sekisui Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Container for measurement of cell functions, kit for measurement of cell functions and method for measuring cell functions
US6391622B1 (en) 1997-04-04 2002-05-21 Caliper Technologies Corp. Closed-loop biochemical analyzers
US6309888B1 (en) 1998-09-04 2001-10-30 Leuven Research & Development Vzw Detection and determination of the stages of coronary artery disease
DE19858777B4 (de) 1998-12-18 2006-07-27 Delta Biotechnology Ltd. Verfahren zur teilweisen oder vollständigen Trennung von glykosilierten und nicht-glykosilierten Proteinen
US6680209B1 (en) 1999-12-06 2004-01-20 Biosite, Incorporated Human antibodies as diagnostic reagents
WO2001044472A1 (en) 1999-12-16 2001-06-21 Amgen, Inc. Tnfr/opg-like molecules and uses thereof
US7323552B2 (en) * 2000-07-31 2008-01-29 The General Hospital Corporation Variant integrin polypeptides and uses thereof
WO2002081518A2 (en) * 2001-02-21 2002-10-17 Curagen Corporation Proteins, polynucleotides encoding them and methods of using the same
EP1637601A3 (en) * 2001-02-21 2006-03-29 Curagen Corporation Proteins, polynucleotides encoding them and methods of using the same
US7179655B2 (en) 2001-03-02 2007-02-20 Activx Biosciences, Inc. Protein profiling platform
US7256257B2 (en) 2001-04-30 2007-08-14 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
WO2003019136A2 (en) * 2001-08-06 2003-03-06 The Regents Of The University Of California Methods for inhibiting angiogenesis
US20030040027A1 (en) 2001-08-16 2003-02-27 Gerd Ritter Method for determining protein component in a biological sample
US7524502B2 (en) 2001-11-12 2009-04-28 Merck Patent Gmbh Modified anti-TNF alpha antibody
IL158297A0 (en) 2001-12-05 2004-05-12 Cangene Corp Pharmaceutical compositions containing immune globulin and methods for the preparation thereof
GB0208817D0 (en) 2002-04-17 2002-05-29 European Molecular Biology Lab Embl Method for producing monoclonal antibodies
US20040022792A1 (en) 2002-06-17 2004-02-05 Ralph Klinke Method of stabilizing proteins at low pH
WO2004012673A2 (en) 2002-08-01 2004-02-12 Wyeth, Methods and reagents relating to inflammation and apoptosis
US20060034845A1 (en) 2002-11-08 2006-02-16 Karen Silence Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor
US7662569B2 (en) 2003-04-11 2010-02-16 Cedars-Sinai Medical Center Methods of assessing Crohn's disease patient phenotype by I2 serologic response
EP1718327B1 (en) 2003-06-20 2015-01-07 University of Florida Biomarkers for differentiating between type 1 and type 2 diabetes
KR20070008501A (ko) 2003-08-01 2007-01-17 암젠 인코퍼레이티드 결정성 종양 괴사 인자 수용체 2 폴리펩티드
WO2005019271A1 (en) 2003-08-14 2005-03-03 Wyeth Anti-lewis y anti-idiotypic antibodies and uses thereof
EP1519194A1 (en) 2003-09-24 2005-03-30 Roche Diagnostics GmbH Use of gfap for identification of intracerebral hemorrhage
WO2005072340A2 (en) * 2004-01-27 2005-08-11 Compugen Ltd. Novel polynucleotides encoding polypeptides and methods using same
US20090275496A1 (en) 2004-05-07 2009-11-05 Peptimmune, Inc. Effective quantitation of complex peptide mixtures in tissue samples and improved therapeutic methods
WO2006004958A2 (en) 2004-06-30 2006-01-12 Centocor, Inc. Detection or measurement of antibodies to antigenic proteins in biological tissues or samples
US20060253263A1 (en) 2005-04-11 2006-11-09 Meshkin Brian J Method to optimize drug selection, dosing and evaluation and to help predict therapeutic response and toxicity from immunosuppressant therapy
CN101223448B (zh) 2005-05-20 2012-01-18 健泰科生物技术公司 来自自身免疫病受试者的生物学样品的预处理
SG164379A1 (en) 2005-07-21 2010-09-29 Genmab As Potency assays for antibody drug substance binding to an fc receptor
US20090162374A1 (en) 2005-09-14 2009-06-25 Geraghty Daniel E Specific removal of activated immune cells
US7542502B2 (en) 2005-09-27 2009-06-02 Cymer, Inc. Thermal-expansion tolerant, preionizer electrode for a gas discharge laser
EP1948214A4 (en) 2005-11-08 2009-12-30 Medarex Inc ANTI-TNF-ALPHA TREATMENT FOR TREATING ENTEROCOLITIS ASSOCIATED WITH IMMUNOSTIMULATORY THERAPEUTIC ANTIBODY TREATMENT
JP2007147367A (ja) 2005-11-25 2007-06-14 Sekisui Chem Co Ltd サイトカイン産生能の測定方法
DE102005057920A1 (de) 2005-12-02 2007-06-28 Strohner, Pavel, Dr. Immunoassay zur simultanen immunchemischen Bestimmung eines Analyten (Antigen) und eines gegen den Analyten gerichteten Therapieantikörpers in Proben
WO2008008349A2 (en) 2006-07-11 2008-01-17 Drexel University Methods of quantitatively assessing inflammation with biosensing nanoparticles
EP2636754B1 (en) * 2006-09-11 2015-03-04 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with psoriasis, methods of detection and uses thereof
NZ582618A (en) 2007-07-13 2012-07-27 Prometheus Lab Inc Drug selection for lung cancer therapy using antibody-based arrays
US20090035216A1 (en) 2007-08-03 2009-02-05 Biomonitor Aps Method for determining in vivo biopharmaceutical concentration or bioavailability
EP2200613B1 (en) 2007-09-21 2018-09-05 The Johns Hopkins University Phenazine derivatives and uses thereof
CA2712021A1 (en) 2008-01-15 2009-07-23 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Methods and kits for detecting antibodies against therapeutic antibodies
AU2009234106A1 (en) 2008-03-05 2009-10-15 Singulex, Inc. Methods and compositions for highly sensitive detection of molecules
US8877893B2 (en) * 2008-12-29 2014-11-04 Children's Medical Center Corporation Stabilized low affinity conformation of integrins for drug discovery
ES2575160T3 (es) * 2010-03-15 2016-06-24 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Inhibidores de las interacciones que unen la subunidad alfa de la beta integrina-proteína G
JP5066222B2 (ja) 2010-05-31 2012-11-07 三菱電機株式会社 ネットワーク解析支援装置、ネットワーク解析支援方法及びプログラム
JP6173911B2 (ja) * 2010-09-10 2017-08-09 メディミューン リミテド 抗体誘導体
EP2630495B1 (en) 2010-10-18 2017-02-08 Nestec S.A. Methods for determining anti-drug antibody isotypes
KR20140008397A (ko) 2011-02-17 2014-01-21 네스텍 소시에테아노님 항-ＴＮＦα 약물에 대한 자가항체 검출을 위한 검정법
UY34054A (es) 2011-05-02 2012-11-30 Millennium Pharm Inc FORMULACIÓN PARA ANTICUERPO ANTI-a(alfa)4B(Beta)7
CA2839792A1 (en) 2011-05-10 2012-11-15 Nestec S.A. Methods of disease activity profiling for personalized therapy management
MX363606B (es) * 2011-06-22 2019-03-28 Apellis Pharmaceuticals Inc Uso de inhibidores del complemento en trastornos crónicos.
CN103619874A (zh) * 2011-06-30 2014-03-05 株式会社免疫生物研究所 可溶性整联蛋白α4突变体
CN103782172A (zh) 2011-07-06 2014-05-07 雀巢产品技术援助有限公司 检测针对使用TNFα的生物疗法的中和性自体抗体的测定法
US20130266963A1 (en) 2011-07-06 2013-10-10 Nestec S.A. Assay for detecting neutralizing autoantibodies to biologic therapy
WO2013126595A1 (en) * 2012-02-21 2013-08-29 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Methods for treating corneal and conjunctival inflammation and inflammatory disorders
US20130295685A1 (en) 2012-04-10 2013-11-07 Nestec S.A. Mobility shift assays for detecting anti-tnf alpha drugs and autoantibodies
BR112015012482A2 (pt) 2012-11-30 2017-07-11 Nestec Sa ensaios para detecção de autoanticorpos neutralizantes à terapia com produtos biológicos
SG10201810298VA (en) 2013-11-13 2018-12-28 Pfizer Tumor necrosis factor-like ligand 1a specific antibodies and compositions and uses thereof
MX2017007232A (es) * 2014-12-05 2017-10-16 Nestec Sa Ensayos de desplazamiento por movilidad homogeneos indirectos para la deteccion de productos biologicos en muestras de pacientes.
KR102423893B1 (ko) 2015-03-31 2022-07-21 삼성디스플레이 주식회사 플렉서블 표시 장치
KR102616436B1 (ko) 2016-12-14 2023-12-27 비오라 쎄라퓨틱스, 인크. Tnf 저해제로의 위장관 질환의 치료

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080286774A1 (en) * 2007-05-16 2008-11-20 The Regents Of The University Of California Real-time individualized therapy evaluation
CN102695955A (zh) * 2009-10-26 2012-09-26 普罗米修斯实验室股份有限公司 检测抗-tnf药物和自身抗体的试验
US20140051184A1 (en) * 2012-08-15 2014-02-20 Nestec S.A. Mobility shift assays for detecting anti-tnf alpha drugs and autoantibodies thereto

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHUI-LONG WANG ET AL.: "Development and validation of a homogeneous mobility shift assay for the measurement of infliximab and antibodies-to-infliximab levels in patient serum", 《JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114624343A (zh) * 2020-12-10 2022-06-14 中国科学院大连化学物理研究所 一种用于血清中45种炎症及免疫代谢物相对定量的方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3227683B1 (en) 2019-04-24
CA2969609A1 (en) 2016-06-09
IL252396A0 (en) 2017-07-31
HK1244880B (zh) 2020-06-05
KR20170091717A (ko) 2017-08-09
BR112017011545A2 (pt) 2018-03-13
JP2018500553A (ja) 2018-01-11
US11846642B2 (en) 2023-12-19
AU2015356613A1 (en) 2017-06-15
CA2969609C (en) 2023-02-28
US20240183867A1 (en) 2024-06-06
US10422807B2 (en) 2019-09-24
ES2735085T3 (es) 2019-12-16
US20200088749A1 (en) 2020-03-19
MX2017007232A (es) 2017-10-16
SG11201704200SA (en) 2017-06-29
EP3227683A2 (en) 2017-10-11
US20170328923A1 (en) 2017-11-16
RU2017122720A (ru) 2019-01-10
WO2016088104A3 (en) 2016-08-18
WO2016088104A2 (en) 2016-06-09
EP3536705A1 (en) 2019-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107250798A (zh) 用于检测患者样品中的生物制品的间接均相迁移率变动试验
JP6181646B2 (ja) Ｔｎｆアルファによる生物学的治療に対する中和自己抗体の検出のためのアッセイ
CN103299190B (zh) 确定抗药物抗体同种型的方法
CN105074461A (zh) 用于检测抗生物制品治疗的中和性自身抗体的测定
US20200132686A1 (en) Assays for assessing neutralizing antibodies levels in subjects treated with a biological drug and uses thereof in personalized medicine
ES2311485T3 (es) Ligandos anclados y procedimientos de utilizacion.
US20110294135A1 (en) Compositions and methods for analyte detection and quantitation
Lei et al. Development and application of potency assays based on genetically modified cells for biological products
CN112094351B (zh) 一种抗vegfr-2单克隆抗体的检测性抗体、应用及检测方法
Nice et al. Strategies for the identification and purification of ligands for orphan biomolecules
EP3084439B1 (en) Analysis of antibodies
WO2023154780A1 (en) Anti-her2/neu antibodies and methods of use
EP3504551A1 (en) Lateral flow assay for assessing recombinant protein expression or reporter gene expression

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20190717

Address after: Vevey

Applicant after: SOCIETE DES PRODUITS NESTLE S. A.

Address before: Vevey

Applicant before: Nestle Products Technical Assistance Co., Ltd.

AD01 Patent right deemed abandoned
AD01 Patent right deemed abandoned

Effective date of abandoning: 20210122