CN107245476B - 单克隆抗体6c9g4及其在制备治疗内毒素血症的药物中的应用 - Google Patents

单克隆抗体6c9g4及其在制备治疗内毒素血症的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了单克隆抗体6C9G4及其在制备治疗内毒素血症的药物中的应用，由保藏编号为CCTCC No.C201768的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体6C9G4有效阻断HK与LPS的结合，显著降低血浆中LPS的浓度，并提高动物内毒素血症的生存率。基于单克隆抗体6C9G4的这一作用，本发明公开的单克隆抗体6C9G4在控制内毒素血症方面具有潜在的应用前景，为临床内毒素血症患者的治疗提供了新的途径和措施。

Description

单克隆抗体6C9G4及其在制备治疗内毒素血症的药物中的 应用
技术领域
本发明涉及单克隆抗体6C9G4及其在制备治疗内毒素血症的药物中的应用。
背景技术
内毒素血症是是机体感染后，革兰氏阴性菌释放出大量内毒素即脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）入血液所导致的病理表现。在美国每年大约有75万例内毒素血症患者，其中重度患者和败血性休克所致死亡率分别是25-30%和40-70%。在我国细菌感染所致内毒素血症同样是严重危害人民生命的主要疾病，其治疗成本为患者带来巨大的经济负担。内毒素血症的高发病率和高死亡率的主要原因是当前对其发病机制仍然认识不清，因此缺乏有效的靶向治疗药物，尤其是抗生素抵抗的耐药菌的感染已成为临床棘手的长期难题。因此，面临这一严重迫境，科学家的共识和挑战是如何确立新的靶点和建立新的干预途径。
发明内容
本发明公开了一种单克隆抗体6C9G4及其在制备治疗内毒素血症的药物中的应用；可以通过阻断HK蛋白的第五结构域中的氨基酸序列（简称为DHG15）与LPS的结合来阻断血浆高分子量激肽原（high molecular weight kininogen，HK）与LPS的结合，是治疗内毒素血症发病的新靶点
本发明用合成的DHGHKHKHGHGHGKH多肽序列免疫BALB/c小鼠，通过细胞融合杂交瘤技术制备并筛选纯化出一株杂交瘤细胞株，从而分泌单克隆抗体6C9G4。本发明杂交瘤细胞株的制备方法具体包括以下步骤：
（1）将DHG15多肽-KLH 偶联物抗原用完全佐剂乳化后对8只Balb/c小鼠进行腹腔注射初次免疫，而后分别在第2周，第5周将DHG15多肽-KLH 偶联物抗原用不完全佐剂乳化后腹腔注射进行加强免疫。第7周鼠尾釆血后收集血清，采用间接ELISA法测定血清效价，效价达标后即可取脾，按照常规方法进行细胞融合；
（2）从免疫合格小鼠无菌取其脾细胞作为抗原致敏的B细胞，按常规方法，将B细胞与骨髓瘤细胞株融合，然后利用常规的融合细胞HAT筛选方法进行筛选，进而获取融合细胞生长克隆；
（3）采用间接ELISA方法筛选鉴定阳性杂交瘤细胞。采用有限稀释法将阳性孔细胞进行4次克隆纯化，挑选出具有高抗体分泌水平的杂交瘤细胞株，命名为6C9G4。所述杂交瘤细胞株6C9G4保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期是2017年4月26日，保藏编号为CCTCC No. C201768。
采用上述杂交瘤细胞株制备单克隆抗体的方法有以下两种：
1）在杂交瘤培养液中接种上述杂交瘤细胞，培养后培养液中分离纯化所需单克隆抗体；
2）在动物腹腔内接种上述杂交瘤细胞，动物腹水液中分离和纯化所需单克隆抗体。
本发明还公开了由保藏编号为CCTCC No. C201768的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体6C9G4。
本发明还公开了利用单克隆抗体6C9G4制备的药物、试剂或者试剂盒。
本发明还公开了单克隆抗体6C9G4在制备阻断血浆高分子量激肽原与脂多糖结合的药物中应用。
本发明还公开了单克隆抗体6C9G4在制备治疗内毒素血症的药物中的应用。
本发明还公开了单克隆抗体6C9G4的特异性抗原作为靶点在制备治疗内毒素血症的药物中的应用。
本发明还公开了一种治疗内毒素血症药物的制备方法，将单克隆抗体6C9G4与药物辅料组合，得到治疗内毒素血症药物。
本发明还公开了一种降低血浆中脂多糖浓度药物的制备方法，将单克隆抗体6C9G4与药物辅料组合，得到降低血浆中脂多糖浓度药物。
本发明还公开了单克隆抗体6C9G4在制备降低血浆中脂多糖的药物中的应用。
ELISA检测6C9G4的抗体效价大于1:2430；进一步体外检测6C9G4能否抑制小鼠血浆中HK与LPS的结合，20μl小鼠血浆与100ug 6C9G4或小鼠IgG孵育后，再与LPS-PolymyxinB孵育，检测上清血浆中HK与LPS的结合情况，与小鼠IgG相比，6C9G4明显抑制LPS与血浆HK结合；并且与小鼠IgG组小鼠相比，6C9G4组小鼠血浆中LPS浓度显著降低，提示单克隆抗体6C9G4可以通过阻断血浆中HK与LPS的结合，降低血浆中LPS浓度；特别的，与注射小鼠IgG的对照组相比，注射6C9G4的小鼠，其生存率显著提高，说明6C9G4与HK蛋白结合后阻断了LPS与HK的结合，从而降低了血浆中LPS的含量，改善LPS所致死亡。
本发明制备了特异性抗DHG15序列的单克隆抗体6C9G4，研究6C9G4抗体在治疗内毒素血症方面的潜在临床应用价值；发现，6C9G4抗体有效阻断HK与LPS的结合，显著降低血浆中LPS的浓度，并提高小鼠内毒素血症的生存率。可见本发明提公开的单克隆抗体6C9G4在控制内毒素血症方面具有潜在的应用前景，为临床内毒素血症患者的治疗提供了新的线索和方向。
附图说明
图1为6C9G4单抗抑制LPS与HK的结合图；
图2为低剂量下血浆中LPS浓度曲线图；
图3为高剂量下血浆中LPS浓度曲线图；
图4为小鼠生存率图。
具体实施方式
实施例一 单克隆抗体6C9G4的制备和鉴定结果
用合成的DHGHKHKHGHGHGKH多肽序列免疫BALB/c小鼠，通过细胞融合杂交瘤技术制备并筛选纯化出一株杂交瘤细胞株6C9G4。所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期是2017年4月26日，保藏编号为CCTCC No. C201768。
单克隆抗体6C9G4的制备
（1）腹腔注射0.5ml不完全佐剂于BALB/C 鼠，3天后腹腔注射1×106个6C9G4杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后收集腹水。
（2）腹水中的单克隆抗体用Protein G 亲和纯化法纯化富集。
ELISA检测纯化的6C9G4抗体效价大于1:2430，如表1；进一步体外检测6C9G4能否抑制小鼠血浆中HK与LPS的结合，20μl小鼠血浆与或不与10ug 6C9G4 在4℃孵育2小时后，再与LPS-PolymyxinB 4℃孵育30分钟，检测上清血浆中HK与LPS的结合情况，如图1所示，6C9G4与血浆中HK结合后，能明显抑制LPS与血浆HK的结合。
表1 6C9G4单抗效价测定结果
Figure 677944DEST_PATH_IMAGE002
C57/B6野生型小鼠腹腔注射LPS（5μg/kg或 5mg/kg）前后，分别经静脉（LPS注射前1小时）及经腹腔（LPS注射后3小时）注射小鼠IgG和6C9G4（600µg/小鼠），在0、3、6、12、24小时各个时间点眼眶取血，检测血浆中LPS浓度，结果见图2、图3。如图所示，LPS注射量为低剂量（5μg/kg）和高剂量（5mg/kg）时，均可见与小鼠IgG组小鼠相比，6C9G4组小鼠血浆中LPS浓度显著降低，说明本发明的单克隆抗体6C9G4可以通过阻断血浆中HK与LPS的结合，降低血浆中LPS浓度。
为进一步研究6C9G4能否改善LPS所致小鼠死亡，C57/B6野生型小鼠注射LPS（25mg/kg）前后，分别经静脉（LPS注射前1小时）及经腹腔（LPS注射后3小时）注射mouse IgG和6C9G4（600µg/mouse），观察两组小鼠的生存率。结果发现，与注射mouse IgG的对照组相比，注射6C9G4的小鼠，其生存率显著提高 （图4）。结果提示6C9G4与HK蛋白结合后阻断了LPS与HK的结合，从而降低了血浆中LPS的含量，改善LPS所致死亡。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州大学
<120> 单克隆抗体6C9G4及其在制备治疗内毒素血症的药物中的应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Asp His Gly His Lys His Lys His Gly His Gly His Gly Lys His
1 5 10 15

Claims (2)

1.一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏日期是2017年4月26日，保藏编号为CCTCC No. C201768。
2.由保藏编号为CCTCC No. C201768的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体6C9G4。
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WO2016004281A1 (en) * 2014-07-03 2016-01-07 Chunlei Liu Polypeptides comprising a thermal sensitive ion channel linked to a domain 5 of kininogen, nucleic acids, and their uses for cell modulation and treatments

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