CN107209186A - Btk抑制剂的测定 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及BTK占用率测定法。

Description

BTK抑制剂的测定
相关申请
本专利申请要求于2014年12月11日提交的的美国临时专利申请第62/090,648号的优先权，其全部内容纳入作为参考。
技术领域
本发明涉及用于布鲁顿酪氨酸激酶(BRUTON'S TYROSINE KINASE，下文称为“BTK”)抑制剂的测定法。
发明背景
蛋白激酶构成了人类酶中最大的一族并且通过向蛋白质加成磷酸根基团来调节许多不同的信号过程(T.Hunter，Cell 1987 50：823-829)。具体而言，酪氨酸激酶磷酸化蛋白质中酪氨酸残基的苯酚部分。酪氨酸激酶族包括控制细胞生长、迀移和分化的成员。已经表明在许多人类疾病中都涉及异常的激酶活性，所述疾病包括癌症、自身免疫性和炎性疾病。由于蛋白激酶是细胞信号传导的关键调节剂，它们因此提供了用小分子激酶抑制剂调节细胞功能的靶点，成为良好的药物设计靶点。除治疗激酶介导的疾病过程外，也可用激酶活性的有效的选择性抑制剂来研究细胞信号传导过程和鉴定治疗感兴趣的其它细胞靶点。
有良好的证据表明B-细胞在自身免疫和/或炎性疾病的发病机理中起关键作用。消耗B细胞的以蛋白质为基础的疗法如利妥昔单抗(Rituxan)可有效对抗自身抗体驱动的炎性疾病如类风湿性关节炎(Rastetter等，Annu Rev Med 2004 55：477)。因此，在B-细胞活化中起一定作用的蛋白激酶抑制剂将可用于治疗B-细胞介导的疾病病理如自身抗体产生。
通过B-细胞受体(BCR)的信号传导控制着包括增殖和分化成成熟的抗体生产细胞在内的一系列B-细胞应答。BCR是B-细胞活性的关键调节点，异常的信号传导可造成失调的B-细胞增殖和形成导致多种自身免疫和/或炎性疾病的致病性自身抗体。布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)是一种非-BCR关联性激酶，其位于膜近侧区并且直接位于BCR的下游。已经表明BTK的缺乏减少了BCR信号传导，因此，抑制BTK将是一种阻断B-细胞介导的疾病进程的有用的治疗途径。还报导了BTK在细胞凋亡中起一定作用(Islam和Smith Immunol.Rev.2000 178：49)，因此，BTK抑制剂将可用于治疗一些B-细胞淋巴瘤和白血病(Feldhahn等，J.Exp.Med.2005 201：1837)。
BTK是酪氨酸激酶Tec族的一员，已经表明其是早期B-细胞发育和成熟的B-细胞活化和存活的关键调节剂(Khan等，Immunity 1995 3：283；Ellmeier等，J.Exp.Med.2000192：1611)。人体内的BTK突变导致了X-连锁无丙种球蛋白血症(XLA)(Rosen等，NewEng.J.Med.1995 333：431和Lindvall等，Immunol.Rev.2005 203：200中的综述)。这些患者免疫功能低下，表现出B-细胞成熟受损、免疫球蛋白和外周B-细胞水平下降、不依赖T-细胞的免疫应答减少以及BCR刺激后的钙动员减弱。
BTK-缺乏小鼠模型且用BTK抑制剂治疗也提供了BTK在自身免疫和炎性疾病中的作用的证据。在全身性红斑狼疮(SLE)的临床前鼠科动物模型中，BTK-缺乏小鼠表现出显着的疾病进程改善。此外，BTK-缺乏小鼠耐受胶原诱导的关节炎(Jansson和HolmdahlClin.Exp.Immunol.1993 94：459)。已经证明，选择性BTK抑制剂在小鼠关节炎模型中表现出剂量依赖性的功效(Z.Pan等，Chem.Med Chem.2007 2：58-61)。
BTK也通过参与疾病进程的除B-细胞外的其它细胞进行表达。BTK是骨髓细胞中Fc受体信号传导的关键成分。例如，BTK由嗜酸性粒细胞肥大细胞表达，并且得自BTK-缺乏的骨髓的肥大细胞表现出受损的抗原诱导的脱粒作用(Iwaki等，J.Biol.Chem.2005 280：40261)。这表明BTK可用于治疗病理性肥大细胞应答如过敏和哮喘。得自无BTK活性的XLA患者的单核细胞在刺激后也表现出TNFα产生减少(Horwood等，JExpMed 197：1603，2003)。因此，可用小分子BTK抑制剂来调控TNFα介导的炎症。
理解任何潜在的疗法如何作用的一个重要方面是要知道将分子给予人受试者后该分子与药物靶标接合的水平。测量这种药效学(PD)活性为选择适当的剂量提供了指导，以优化药物靶标的抑制并优化靶标的抑制与疾病治疗功效的相关性。这种信息对于在试验中成功评价候选药物和随后的临床实践中使用至关重要。BTK抑制剂通常与酶的活性位点结合，并“占据”该空间，从而阻止催化和酶活性。本发明测量在施加BTK抑制剂之后，样品中有多少BTK已被占据或未被占据。通过确定占用率，本发明能测定被抑制的BTK的百分比，从而测定了施加抑制剂化合物所获得的抑制水平的PD读数。
发明内容
业已发现，本发明的化合物是有效的探针化合物，能测量BTK的占用率。所述化合物以通式I表示：
其中R1、R2、R3、R4’、X、Y、L、T1和Rt具有此处实施例中所限定和描述的意义。
附图说明
图1是BTK占用率测定的MSD结果。
详细描述
化合物和定义
本发明的化合物包括上文所概述的化合物，且按本文所揭示的类别、子类和种类进一步加以说明。除非另外指示，否则如本文所用的以下定义应适用。就本发明来说，化学元素是根据元素周期表(the Periodic Table of the Elements)(化学文摘社版本(CASversion)，化学与物理手册(Handbook of Chemistry和Physics)，第75版)来识别。另外，有机化学的一般原理描述于“有机化学(Organic Chemistry)”(托马斯·索瑞尔(ThomasSorrell)，大学自然科学图书公司(University Science Books)，索萨利托(Sausalito)：1999)和“马奇高等有机化学(March′s Advanced Organic Chemistry)”(第5版，编辑：史密斯(SmitH,M.B.)和马奇(MarcH,J.)，约翰威立父子出版公司(John Wiley&Sons)，纽约(NewYork)：2001)中，这些书籍的全部内容都以引用的方式并入本文中。
本文所用的术语“脂族”或“脂族基团”是指完全饱和或含有一个或一个以上不饱和单元的经取代或未经取代的直链(即无支链)或支链烃链，或完全饱和或含有一个或一个以上不饱和单元但不为芳香族的单环烃或双环烃，其具有单个连接点与分子的其余部分相连接。除非另外说明，否则脂肪族基含有1-6个脂肪族碳原子。在一些实施例中，脂肪族基含有1-5个脂肪族碳原子。在一些实施例中，脂肪族基含有1-4个脂肪族碳原子。在一些实施例中，脂肪族基含有1-3个脂肪族碳原子，并且在一些实施例中，脂肪族基含有1-2个脂肪族碳原子。在一些实施例中，“环脂肪族基”(或“碳环”或“环烷基”)是指完全饱和或含有一个或一个以上不饱和单元但非芳香族的单环C3-C6烃，其具有单个连接点与分子的其余部分相连接。示例性脂族基团是直链或支链的取代的或未取代的C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基及其杂化物，例如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)烯基。
术语“低级烷基”是指C1-4直链或支链烷基。示例性低级烷基是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。
术语“低级卤代烷基”指的是含有一个或多个卤素原子的C1-4直链或支链烷基。
术语“杂原子”是指一个或一个以上氧、硫、氮、或磷(包括氮、硫、或磷的任何氧化形式；任何碱性氮的季铵化形式；杂环的可取代氮，例如N(如在3,4-二氢-2H-吡咯基)、NH(如在吡咯烷基中)或NR+(如在N-取代的吡咯烷基中))。
本文所用的术语“不饱和”是指具有一个或更多个不饱和单元的部分。
本文所用的术语“二价C1-8(或C1-6)饱和或不饱和的直链或支链烃链”是指二价亚烷基、亚烯基、亚炔基链，它们是此处定义的直链或支链。
术语“亚烷基”是指二价烷基。“亚烷基链”是聚亚甲基，即-(CH2)n-，其中n为正整数，优选为1到6、1到4、1到3、1到2或者2到3。经取代的亚烷基链是一个或一个以上亚甲基氢原子经取代基置换的聚亚甲基。合适的取代基包括下文关于经取代的脂肪族基所描述的取代基。
术语“亚烯基”是指二价烯基。取代的亚烯基链是含有至少一个双键的聚亚甲基，其中一个或多个氢原子被取代基置换。合适的取代基包括下文描述有关取代的脂族基团的那些。
术语“卤素”指F、Cl、Br或I。
单独使用或作为较大部分如“芳烷基”、“芳羟基”或“芳氧基烷基”的一部分使用的术语“芳基”指单环和双环系统，所述系统共具有5至14个环成员，其中系统中至少一个环是芳族，并且其中系统中各环含有3至7个环成员。术语“芳基”与术语“芳基环”互换使用。在本发明的一些实施方案中，“芳基”是指芳香环系统。示例性芳基是苯基、联苯基、萘基、蒽基等，其任选地包括一个或多个取代基。如本文中所用，术语“芳基”的范围内也包括芳环与一个或一个以上非芳环稠合而成的基团，例如茚满基、邻苯二甲酰亚胺基、萘二甲酰亚胺基(naphthimidyl)、菲啶基或四氢萘基等。
单独使用或作为例如“杂芳烷基”或“杂芳羟基”等较大部分的一部分使用的术语“杂芳基”和“杂芳-”是指如下基团，其具有5到10个环原子，优选5、6或9个环原子；环系(cyclic array)中共享6、10或14个π电子；并且除碳原子外，还具有1到5个杂原子。术语“杂原子”是指氮、氧或硫，并包括氮或硫的任何氧化形式和碱性氮的任何季铵化形式。杂芳基包括(但不限于)噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲哚嗪基、嘌呤基、萘啶基和蝶啶基。如本文所用的术语“杂芳基”和“杂芳-”也包括杂芳环与一个或一个以上芳环、环脂肪族环或杂环稠合而成的基团，其中连接基团或连接点在杂芳环上。非限制性实例包括吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、4H-喹嗪基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基和吡啶并[2,3-b]-1，4-噁嗪-3(4H)-酮。杂芳基可为单环或双环的。术语“杂芳基”与术语“杂芳环”或“杂芳香族基”可互换使用，任一术语都包括任选经取代的环。术语“杂芳烷基”是指经杂芳基取代的烷基，其中烷基和杂芳基部分独立地任选经取代。
本文所用的术语“杂环”、“杂环基”、“杂环基团”和“杂环状环”可互换使用，并且是指饱和或部分不饱和并且除碳原子外还具有一个或一个以上、优选1到4个如上文所定义的杂原子的稳定的5到7元单环或7-10元双环杂环部分。当关于杂环的环原子而使用时，术语“氮”包括经取代的氮。举例来说，在具有0-3个选自氧、硫或氮的杂原子的饱和或部分不饱和环中，氮可能是N(如3,4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如吡咯烷基中)或+NR(如N-取代的吡咯烷基中)。
杂环可在任何杂原子或碳原子上连接到其侧基，从而形成稳定结构，并且任何环原子都可以任选经取代。这些饱和或部分不饱和杂环基的实例包括(但不限于)四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、哌啶基、吡咯啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、噁唑烷基、哌嗪基、二噁烷基、二氧戊环基、二氮杂卓基、氧氮杂卓基、硫氮杂卓基、吗啉基和奎宁环基。术语“杂环”、“杂环基”和“杂环部分”在本文中可互换使用，并且也包括杂环与一个或一个以上芳环、杂芳环或环脂肪族环稠合而成的基团，例如吲哚啉基、3H-吲哚基、色满基、菲啶基或四氢喹啉基，其中连接基团或连接点在杂环上。杂环基可为单环或双环的。术语“杂环基烷基”是指经杂环基取代的烷基，其中烷基和杂环基部分独立地任选经取代。
如本文所用的术语“部分不饱和”是指包括至少一个双键或三键的环部分。术语“部分不饱和”打算涵盖具有多个不饱和位点的环，但不打算包括如本文中所定义的芳基或杂芳基部分。
如本文所述，本发明的一些化合物可含有“任选经取代”的部分。一般来说，术语“经取代”之前无论是否存在术语“任选”，都意指指定部分的一个或一个以上氢经合适的取代基置换。“取代的”适用于结构上明确的或暗示的一个或多个氢原子(例如，至少指以及至少指 除非另外指示，否则“任选经取代”的基团可能在此基团的各可取代位置上都具有合适的取代基，并且当任何给定结构中的一个以上位置可经一个以上选自规定基团的取代基取代时，每个位置上的取代基可能相同或不同。本发明所预想的取代基组合优选是会形成稳定或化学上可行的化合物的取代基组合。如本文所用的术语“稳定”是指化合物在经受允许其制造、检测和在一些实施例中允许其回收、纯化以及用于达成一个或一个以上本文中所揭示的目的的条件时实质上不发生改变。
“任选经取代”的基团的可取代碳原子上的合适单价取代基独立地为氘；卤素；–(CH2)0–4Ro；–(CH2)0–4ORo；-O(CH2)0-4Ro，–O–(CH2)0–4C(O)ORo；–(CH2)0–4CH(ORo)2；–(CH2)0– 4SRo；–(CH2)0–4PH,其可经Ro取代；–(CH2)0–4O(CH2)0–1PH,其可经Ro取代；–CH＝CHPH,其可经Ro取代；–(CH2)0–4O(CH2)0–1-吡啶基，其可经Ro取代；–NO2；–CN；–N3；-(CH2)0–4N(Ro)2；–(CH2)0–4N(Ro)C(O)Ro；–N(Ro)C(S)Ro；–(CH2)0–4N(Ro)C(O)NRo 2；-N(Ro)C(S)NRo 2；–(CH2)0–4N(Ro)C(O)ORo；–N(Ro)N(Ro)C(O)Ro；-N(Ro)N(Ro)C(O)NRo 2；-N(Ro)N(Ro)C(O)ORo；–(CH2)0–4C(O)Ro；–C(S)Ro；–(CH2)0–4C(O)ORo；–(CH2)0–4C(O)SRo；-(CH2)0–4C(O)OSiRo 3；–(CH2)0–4OC(O)Ro；–OC(O)(CH2)0–4SRo，SC(S)SRo；–(CH2)0–4SC(O)Ro；–(CH2)0–4C(O)NRo 2；–C(S)NRo 2；–C(S)SRo；–SC(S)SRo，-(CH2)0–4OC(O)NRo 2；-C(O)N(ORo)Ro；–C(O)C(O)Ro；–C(O)CH2C(O)Ro；–C(NORo)Ro；-(CH2)0–4SSRo；–(CH2)0–4S(O)2Ro；–(CH2)0–4S(O)2ORo；–(CH2)0–4OS(O)2Ro；–S(O)2NRo 2；-(CH2)0–4S(O)Ro；-N(Ro)S(O)2NRo 2；–N(Ro)S(O)2Ro；–N(ORo)Ro；–C(NH)NRo 2；–P(O)2Ro；-P(O)Ro 2；-OP(O)Ro 2；–OP(O)(ORo)2；SiRo 3；–(C1–4直链或支链亚烷基)O–N(Ro)2；或(C1–4直链或支链亚烷基)C(O)O–N(Ro)2，其中各Ro可如下文所定义经取代并且独立地为氢、C1-6脂肪族基、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph、-CH2-(5-6元杂芳基环)、或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳环，或不管以上定义，两个独立存在的Ro连同插入其间的原子一起形成具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-12元饱和、部分不饱和或芳基单环或多环，此环可如下文所定义经取代。
Ro(或由两个独立存在的Ro连同插入其间的原子一起形成的环)上的合适单价取代基独立地为氘、卤素、–(CH2)0–2R●、–(卤代R●)、–(CH2)0–2OH、–(CH2)0–2OR●、–(CH2)0–2CH(OR●)2、-O(卤代R●)、–CN、–N3、–(CH2)0–2C(O)R●、–(CH2)0–2C(O)OH、–(CH2)0–2C(O)OR●、–(CH2)0–2SR●、–(CH2)0–2SH、–(CH2)0–2NH2、–(CH2)0–2NHR●、–(CH2)0–2NR● 2、–NO2、–SiR● 3、–OSiR● 3、-C(O)SR●、–(C1–4直链或支链亚烷基)C(O)OR●、或–SSR●，其中各R●未经取代或在前面有“卤代”的情况下仅经一个或一个以上卤素取代，并且独立地选自C1-4脂肪族基、–CH2Ph、–O(CH2)0–1Ph、或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳环。Ro的饱和碳原子上的合适二价取代基包括＝O和＝S。
“任选经取代”的基团的饱和碳原子上的合适二价取代基包括以下：＝O、＝S、＝NNR* 2、＝NNHC(O)R*、＝NNHC(O)OR*、＝NNHS(O)2R*、＝NR*、＝NOR*、–O(C(R* 2))2–3O–、或–S(C(R* 2))2–3S–，其中各独立存在的R*是选自氢、可如下文所定义经取代的C1-6脂肪族基或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未经取代的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳环。与“任选经取代”的基团的邻位可取代碳结合的合适二价取代基包括：–O(CR* 2)2–3O–，其中各独立存在的R*是选自氢、可如下文所定义经取代的C1-6脂肪族基或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未经取代的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳环。
R*的脂肪族基上的合适取代基包括卤素、–R●、-(卤代R●)、-OH、–OR●、–O(卤代R●)、–CN、–C(O)OH、–C(O)OR●、–NH2、–NHR●、–NR● 2、或–NO2，其中各R●未经取代或在前面有“卤代”的情况下仅经一个或一个以上卤素取代，并且独立地为C1-4脂肪族基、–CH2PH,–O(CH2)0– 1Ph或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳环。
“任选经取代”的基团的可取代氮上的合适取代基包括 或其中各独立地为氢、可如下文所定义经取代的C1-6脂肪族基、未经取代的-OPh或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未经取代的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳环，或不管以上定义，两个独立存在的连同插入其间的原子一起形成具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未经取代的3-12元饱和、部分不饱和或芳基单环或双环。
的脂肪族基上的合适取代基独立地为卤素、–R●、-(卤代R●)、–OH、–OR●、–O(卤代R●)、–CN、–C(O)OH、–C(O)OR●、–NH2、–NHR●、–NR● 2、或-NO2，其中各R●未经取代或在前面有“卤代”的情况下仅经一个或一个以上卤素取代，并且独立地为C1-4脂肪族基、–CH2Ph、–O(CH2)0– 1PH,或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳环。
在一些实施方案中，术语“任选经取代的”，“任选经取代的烷基”，“任选经取代的烯基”，“任选经取代的炔基”，“任选经取代的碳环”，“任选经取代的芳基”，“任选经取代的杂芳基”，“任选经取代的杂环”，以及本文中所使用的任何其它任选经取代的基团，是指未被取代的基团或者被取代的基团，其中由典型的取代基独立地置换该基团上一个、两个、三个或更多个氢原子，所述典型的取代基不限于：
-F、-Cl、-Br、-I、氘，
-OH、保护的羟基、烷氧基、氧代-、硫代氧代-，
-NO2、-CN、CF3、N3，
-NH2、保护的氨基、-NH烷基、-NH烯基、-NH链炔基、-NH环烷基、-NH-芳基、-NH-杂芳基、-NH-杂环基、-二烷基氨基、-二芳基氨基、-二杂芳基氨基，
-O-烷基、-O-烯基、-O-炔基、-O-环烷基、-O-芳基、-O-杂芳基、-O-杂环基，
-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-炔基、-C(O)-碳环基、-C(O)-芳基、-C(O)-杂芳基、-C(O)-杂环基，
-CONH2、-CONH-烷基、-CONH-烯基、-CONH-炔基、-CONH-碳环基、-CONH-芳基、-CONH-杂芳基、-CONH-杂环基，
-OCO2-烷基、-OCO2-烯基、-OCO2-炔基、-OCO2-碳环基、-OCO2-芳基、-OCO2-杂芳基、-OCO2-杂环基、-OCONH2、-OCONH-烷基、-OCONH-烯基、-OCONH-炔基、-OCONH-碳环基、-OCONH-芳基、-OCONH-杂芳基、-OCONH-杂环基，
-NHC(O)-烷基、-NHC(O)-烯基、-NHC(O)-炔基、-NHC(O)-碳环基、-NHC(O)-芳基、-NHC(O)-杂芳基、-NHC(O)-杂环基、-NHCO2-烷基、-NHCO2-烯基、-NHCO2-炔基、-NHCO2-碳环基、-NHCO2-芳基、-NHCO2-杂芳基、-NHCO2-杂环基、-NHC(O)NH2、-NHC(O)NH-烷基、-NHC(O)NH-烯基、-NHC(O)NH-烯基、-NHC(O)NH-碳环基、-NHC(O)NH-芳基、-NHC(O)NH-杂芳基、-NHC(O)NH-杂环基、NHC(S)NH2、-NHC(S)NH-烷基、-NHC(S)NH-烯基、-NHC(S)NH-炔基、-NHC(S)NH-碳环基、-NHC(S)NH-芳基、-NHC(S)NH-杂芳基、-NHC(S)NH-杂环基、-NHC(NH)NH2、-NHC(NH)NH-烷基、-NHC(NH)NH--烯基、-NHC(NH)NH-烯基、-NHC(NH)NH-碳环基、-NHC(NH)NH-芳基、-NHC(NH)NH-杂芳基、-NHC(NH)NH-杂环基、-NHC(NH)-烷基、-NHC(NH)-烯基、-NHC(NH)-烯基、-NHC(NH)-碳环基、-NHC(NH)-芳基、-NHC(NH)-杂芳基、-NHC(NH)-杂环基，
-C(NH)NH-烷基、-C(NH)NH-烯基、-C(NH)NH-炔基、-C(NH)NH-碳环基、-C(NH)NH-芳基、-C(NH)NH-杂芳基、-C(NH)NH-杂环基，
-S(O)-烷基、-S(O)-烯基、-S(O)-炔基、-S(O)-碳环基、-S(O)-芳基、-S(O)-杂芳基、-S(O)-杂环基-SO2NH2、-SO2NH-烷基、-SO2NH-烯基、-SO2NH-炔基、-SO2NH-碳环基、-SO2NH-芳基、-SO2NH-杂芳基、-SO2NH-杂环基，
-NHSO2-烷基、-NHSO2-烯基、-NHSO2-炔基、-NHSO2-碳环基、-NHSO2-芳基、-NHSO2-杂芳基、-NHSO2-杂环基，
-CH2NH2、-CH2SO2CH3，
-一-、二-、或三-烷基甲硅烷基，
-烷基、-烯基、-炔基、-芳基、-芳基烷基、-杂芳基、-杂芳基烷基、-杂环烷基、-环烷基、-碳环基、-杂环基、聚烷氧基烷基、聚烷氧基、-甲氧基甲氧基、-甲氧基乙氧基、-SH、-S-烷基、-S-烯基、-S-炔基、-S-碳环基、-S-芳基、-S-杂芳基、-S-杂环基、或者甲基硫代甲基。
本文所用的术语“药学上可接受的盐”用以指在可靠医学判断的范围内，适于与人类和低等动物的组织接触使用而没有过多毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，并且与合理的效益/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐是公知的现有技术。例如，SMBerge等人在J.Pharmaceutical Sciences，第1977年，66，1-19，详细描述了药学上可接受的盐，纳入其内容作为参考。本发明的化合物的药学上可接受的盐包括从适合的无机酸和碱以及有机酸和碱衍生而来的那些盐。药学上可接受的无毒性酸加成盐的实例是氨基与无机酸如盐酸，氢溴酸，磷酸，硫酸和高氯酸，或者与有机酸如乙酸，草酸，马来酸、酒石酸，柠檬酸，琥珀酸或丙二酸形成的盐，或者通过使用诸如离子交换等本领域的其他方法形成的盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊丙酸盐、葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。
从适当的碱衍生的盐包括碱金属、碱土金属、铵和N+(C1–4烷基)4盐。代表性的碱或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。其它药学可接受的盐包括使用诸如卤化物、氢氧化物、羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、低级烷基磺酸盐和芳基磺酸盐形成的合适的无毒的铵盐，季铵盐和胺阳离子。
除非另有说明，本文所描述的结构也意味着包括结构的所有异构形式(例如，对映体、非对映体、和几何(或构象)异构体)；例如，每一不对称中心的R和S构型、Z和E双键异构体、以及Z和E构象异构体。因此，本发明化合物的混合物的单个立体化学异构体以及对映体、非对映体、和几何(或构象)异构体的混合物在本发明的范围之内。除非另有说明，本发明的化合物的所有互变异构形式都在本发明的范围之内。
另外，除非另有说明，本文所述的结构包括这样的化合物：其区别仅在于存在一个或多个同位素富集的原子。例如，具有本发明结构的化合物包括由氘或氚替换氢、或由一个13C-或14C-富集碳置换碳，这些化合物都本发明的范围之内。在一些实施方案中，基团包含一个或多个氘原子。
具有通式I的化合物还应包括其同位素标记形式。具有通式I的化合物的同位素标记形式与所述化合物的区别仅在于所述化合物的一个或多个原子被原子量或质量数与通常是天然存在的原子的原子量或质量数不同的一个或多个原子取代。市场上容易买到且可通过已知方法被结合到具有通式I的化合物中的同位素的例子包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯，例如分别为2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、31P、32P、35S、18F和36CI。含有一或多个上述同位素和/或其他原子的同位素的通式I化合物、其前药或它们中任一个的药学上可接受的盐都应理解为本发明的一部分。可以多种有利的方式使用同位素标记的通式I化合物。例如，结合了诸如3H或14C的放射性同位素的同位素标记的通式1化合物可用于药物和/或底物组织分布试验。由于其制备简单及可检测性良好而尤其优选这两种放射性同位素，即氚(3H)和碳-14(14C)。由于诸如氘(2H)的较重的同位素具有较高的代谢稳定性，将这种同位素标记化合物结合到通式I化合物中在治疗上是有好处的。较高的代谢稳定性直接导致体内半衰期延长或剂量减少，这在多数情况下代表了本发明的优选实施例。通常可通过进行本文本的实施例部分和制备部分中的合成方案和相关描述中公开的步骤来制备同位素标记的通式I化合物，用容易得到的同位素标记反应物代替非同位素标记反应物。
为了通过一级动力学同位素效应控制化合物的氧化代谢，可将氘(2H)结合到所述化合物中。一级动力学同位素效应是由于同位素核的替换而导致化学反应速率发生变化，这是由于所述同位素替换之后形成共价键所需的基态能量的变化而引起的。较重的同位素的替换通常导致化学键的基态能量降低，从而引起速率限制的键断裂反应的速率降低。如果键断裂发生在沿着多产物反应的坐标的鞍点区中或其附近，产物分布比率可被显着改变。解释如下：如果氘被键合到碳原子的非可替换位置上，通常速率差异km/kd＝2-7。如果该速率差异被成功地应用于易于氧化的通式I化合物，则该化合物在体内的性质可被显着地改变，从而改善药物动力学特性。
在发现和开发治疗剂时，本领域技术人员尝试在保持有利的体外特性的同时优化药物动力学参数。可以合理地认为，许多药物动力学性质差的化合物易于被氧化代谢。现有的体外肝微粒体试验提供了关于这种类型的氧化代谢过程的有价值的信息，这些信息使得可以合理地设计具有通式I的含氘化合物，使其由于抗氧化代谢而提高稳定性。因此，通式I化合物的药物动力学性质显着地改善了，这种改善可用体内半衰期(t/2)的延长、疗效最好的浓度(Cmax)、剂量响应曲线下的面积(AUC)以及F来定量地表示，也可用降低的清除率、剂量和材料成本来定量地表示。
以下阐述用于说明上述内容：把通式I化合物制备成一系列类似物，其中所述通式I化合物具有多个氧化代谢可能攻击的位点，例如苯甲基氢原子和与氮原子键合的氢原子，在所述类似物中各种组合的氢原子被氘原子取代，因此所述氢原子中的一部分、大多数或全部被氘原子取代。半衰期的确定使得可以有利地及准确地确定对氧化代谢的抵抗能力提高的程度。通过这种方式确定了，由于这种类型的氘-氢替换，母化合物的半衰期可被提高高达100％。
通式I化合物中的氘-氢替换也可被用来有利地改变起始化合物的代谢物谱，以减少或消除不良有毒代谢物。例如，如果通过氧化性碳-氢(C-H)键断裂产生了有毒代谢物，可以合理地认为，含氘类似物将会显着地减少或消除不良代谢物的产生，即使该具体的氧化反应并不是速率决定步骤。更多现有技术中关于氘-氢替换的信息可参见例如Hanzlik等，J.Org.Chem.55，3992-3997，1990，Reider等，J.Org.Chem.52,3326-3334，1987，Foster，Adv.Drug Res.14，1-40，1985，Gillette等，Biochemistry 33(10)2927-2937，1994，和Jarman等Carcinogenesis 16(4)，683-688，1993。
本文所使用的术语“调节剂”被定义为以可测量的亲和力结合和/或抑制靶的化合物。在一些实施方案中，调节剂的IC50和/或结合常数约小于50μM，约小于1μM，约小于500nM，约小于100nM，或小于约10nM。
本文所使用的术语“可测量的亲和力”和“可测量地抑制”是指在含有本发明化合物或其组合物和BTK的样本与包含BTK但不含有本发明化合物或其组合物的等效样品之间的BTK活性发生可测量的变化。
本发明预想的取代基和变量的组合仅为形成稳定化合物的那些。本文所用的术语“稳定”是指具有的稳定性足以允许制造，并且能保持化合物的完整性足够长的时间以用于本文详述的各种目的。
本文的变量的任何定义中化学基团列表的记载包括该变量作为任何单个基团或列出基团的组合的定义。本文的变量的实施方案的记载包括该实施方案作为任何单个实施方案或与任何其他实施方案结合。
实施例化合物的描述
本发明的一方面提供用于确定药物靶标占用率的测定，包括探针。
本发明的一方面提供用于确定接受了BTK激酶抑制剂疗法的患者体内的药物靶标占用率的测定，包括探针。
本发明的一方面提供一种用于确定接受了BTK激酶抑制剂疗法的患者体内的药物靶标占用率的试剂盒，包含探针。
本发明的另一方面提供一种用于确定BTK抑制剂化合物占据药物靶标的占用率的测定法，所述方法包括：
(a)将包含BTK激酶和BTK抑制剂化合物的混合物的样品与探针接触以形成探针结合的激酶；
(b)检测所述样品中的探针结合的激酶的量；以及
(c)基于在所述样品中检测到的探针结合的激酶的量确定所述BTK抑制剂化合物的占用率。
本发明的另一方面提供一种用于确定接受了BTK激酶抑制剂疗法的患者体内的药物靶标占用率的测定法，所述方法包括：
(a)将BTK抑制剂化合物给予受试者；
(b)收集所述受试者的生物样品(例如血液或脾)；
(c)将所述样品与探针接触以形成探针结合的激酶；
(d)检测所述样品中的探针结合的BTK激酶的量；以及
(e)基于在所述样品中检测到的探针结合的激酶的量确定所述BTK激酶的靶标占用率。
本发明的另一方面提供一种用于确定接受了BTK激酶抑制剂疗法的患者体内的药物靶标占用率的测定法，所述方法包括：
(a)将包含BTK激酶的样品与探针接触以形成探针结合的激酶，其中所述样品得自服用了至少一剂不可逆的BTK激酶抑制剂后的患者；
(b)检测所述样品中的探针结合的激酶的量；以及
(c)基于在所述样品中检测到的探针结合的激酶的量确定所述BTK激酶的靶标占用率。
本发明的另一方面提供一种用于监测接受了BTK激酶抑制剂疗法的患者体内的药物靶标占用率的方法。
在一些实施例中，探针是通式I所示的化合物，
式中：
环A是具有1或2个氮原子的6元杂芳环，选自吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶；
R2选自–R、卤素、-卤代烷基、–OR、–SR、–CN、–NO2、-SO2R、-SOR、-C(O)R、-CO2R、-C(O)N(R)2、-NRC(O)R、-NRC(O)N(R)2、-NRSO2R、或–N(R)2；
R3选自–R、卤素、-卤代烷基、–OR、–SR、–CN、–NO2、-SO2R、-SOR、-C(O)R、-CO2R、-C(O)N(R)2、-NRC(O)R、-NRC(O)N(R)2、-NRSO2R、或–N(R)2；
其中R2和R3中至少一个是-C(O)N(R)2或CN；
每个R独立地是氢，C1–6脂族基团，C3–10芳基，3-8元饱和或部分不饱和碳环，具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元杂环，或者具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环；上述每个基团任选经取代；或者
在同一个原子上的两个R基团与它们所连接的原子一起形成C3–10芳基，3-8元饱和或部分不饱和碳环，具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元杂环，或者具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环；上述每个基团任选经取代；
L是二价基团，选自C1–6脂族基团，C3–10芳基，3-8元饱和或部分不饱和碳环，具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元杂环，或者具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环，上述每个基团任选经取代；或L是二价基团，选自C1–6脂族基团-C3–10芳基，C1–6脂族基团-3-8元饱和或部分不饱和碳环，C1–6脂族基团-3-7元杂环，或C1–6脂族基团-5-6元单环杂芳环，其中所述3-7元杂环具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子，所述5-6元单环杂芳环具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子；上述每个基团任选经取代；
Y是O、S、SO2、SO、C(O)、CO2、C(O)N(R)、-NRC(O)、-NRC(O)N(R)、-NRSO2、或N(R)；或者Y不存在；
R1是迈克受体(Michael acceptor)，选自C1–6脂族基团，C3–10芳基，3-8元饱和或部分不饱和碳环，具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元杂环，以及具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环；上述每个基团任选经取代；
X是O、S、SO2、SO、C(O)、CO2、C(O)N(R)、-NRC(O)、-NRC(O)N(R)、-NRSO2、或N(R)；或者X不存在；以及
R4’是二价基团，选自C1–6脂族基团，C3–10芳基，3-8元饱和或部分不饱和碳环，具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元杂环，以及具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环；上述每个基团任选经取代；
T1是二价系栓部分；以及
Rt是可检测部分。
在一些实施例中，所述探针是通式I-a、I-b、I-c或I-d所示的化合物：
其中R1、R2、R3、R4、X、L和Y各自的定义如上所述，且按实施例、类别、子类和本文单独或结合进一步加以描述。
在本发明的任一通式的一些实施例中，R2是氢、卤素、-OR、–SR、–CN、-NO2、-SO2R、-SOR、-C(O)R、-CO2R、-C(O)N(R)2、-NRC(O)R、-NRC(O)N(R)2、-NRSO2R、或–N(R)2。在一些实施例中，R2是卤素、-OR、-SR、-SO2R、-SOR、-C(O)R、-CO2R、-C(O)N(R)2、-NRC(O)R、-NRC(O)N(R)2、-NRSO2R、或–N(R)2。在一些实施例中，R2是卤素、-C(O)R、-CO2R、-C(O)N(R)2、-NRC(O)R、-NRC(O)N(R)2、或-NRSO2R。在一些实施例中，R2是卤素或-C(O)N(R)2。
在本发明的任一通式的一些实施例中，R2是F或者-C(O)NH2。在一些实施例中，R2是F。在一些实施例中，R2是-C(O)NH2。在一些实施例中，R2是-CN。
在本发明的任一通式的一些实施例中，R2是氢。
在本发明的任一通式的一些实施例中，R3是氢、卤素、-OR、–SR、–CN、–NO2、-SO2R、-SOR、-C(O)R、-CO2R、-C(O)N(R)2、-NRC(O)R、-NRC(O)N(R)2、-NRSO2R、或–N(R)2。在一些实施例中，R3是卤素、-OR、–SR、-SO2R、-SOR、-C(O)R、-CO2R、-C(O)N(R)2、-NRC(O)R、-NRC(O)N(R)2、-NRSO2R、或–N(R)2。在一些实施例中，R3是卤素、-C(O)R、-CO2R、-C(O)N(R)2、-NRC(O)R、-NRC(O)N(R)2、或者-NRSO2R。在一些实施例中，R3是卤素或-C(O)N(R)2。
在本发明的任一通式的一些实施例中，R3是NH2、Cl、F或-C(O)NH2。在一些实施例中，R3是F。在一些实施例中，R3是-C(O)NH2。在一些实施例中，R3是-CN。
在本发明的任一通式的一些实施例中，R3是氢。
在本发明的任一通式的一些实施例中，L是任选经取代的二价C1–6脂族基团。在本发明的任一通式的一些实施例中，L是任选经取代的二价C3–10芳基。在本发明的任一通式的一些实施例中，L是3-8元饱和或部分未饱和的二价碳环，所述碳环任选经取代。在本发明的任一通式的一些实施例中，L是具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元二价杂环，所述杂环任选经取代。在本发明的任一通式的一些实施例中，L是具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元二价单环杂芳环，所述杂芳环任选经取代。
在本发明的任一通式的一些实施例中，L是任选经取代的二价C1–6脂族基团-C3–10芳基。在本发明的任一通式的一些实施例中，L是二价C1–6脂族基团-3-8元饱和或部分未饱和的碳环，所述碳环任选经取代。在本发明的任一通式的一些实施例中，L是具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的二价C1–6脂族基团-3-7元杂环，所述杂环任选经取代。在本发明的任一通式的一些实施例中，L是具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的二价C1–6脂族基团-5-6元单环杂芳环，所述杂芳环任选经取代。
在一些实施例中，L是二价C1–6脂族基团，选自亚甲基、亚乙基、亚丙基、异亚丙基、亚丁基、仲亚丁基、叔亚丁基、直链或支链的亚戊基、或直链或支链的亚己基；上述每个基团任选经取代。
在一些实施例中，L是如下二价基团：苯基，萘基，环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基，金刚烷基，环辛基，[3.3.0]双环辛烷基，[4.3.0]双环壬烷基，[4.4.0]双环癸烷基，[2.2.2]双环辛烷基，芴基，茚满基，四氢萘基，吖啶基，吖辛因基，苯并咪唑基，苯并呋喃基，苯并噻吩基，苯并苯硫基，苯并噁唑基，苯并噻唑基，苯并三唑基，苯并四唑基，苯并异噁唑基，苯并异噻唑基，苯并咪唑啉基，咔唑基，NH-咔唑基，咔啉基，色满基，色烯基，噌啉基，十氢喹啉基，2H,6H-1,5,2-二噻嗪基，二氢呋喃并[2,3-b]四氢呋喃基，呋喃基，呋咱基，咪唑烷基，咪唑啉基，咪唑基，1H-吲唑基，吲哚烯基，二氢吲哚基，中氮茚基，吲哚基，3H-吲哚基，异二氢吲哚，异吲哚烯基，异苯并呋喃基，异色满基，异吲唑基，异二氢吲哚，异吲哚基，异喹啉基，异噻唑基，异噁唑基，吗啉基，萘啶基，八氢异喹啉基，噁二唑基，1,2,3-噁二唑基，1,2,4-噁二唑基；1,2,5-噁二唑基，1,3,4-噁二唑基，噁唑烷基，噁唑基，噁唑烷基，嘧啶基，菲啶基，菲咯啉基，吩嗪基，吩噻嗪基，苯并氧硫杂环己二烯基，吩噁嗪基，酞嗪基，哌嗪基，哌啶基，蝶啶基，嘌呤基，吡喃基，吡嗪基，吡唑烷基，吡唑啉基，吡唑基，哒嗪基，吡啶并噁唑，吡啶并咪唑，吡啶并噻唑，吡啶基，吡啶基，嘧啶基，吡咯烷基，吡咯啉基，2H-吡咯基，吡咯基，喹唑啉基，喹啉基，4H-喹嗪基，喹喔啉基，奎宁环基，四氢呋喃基，四氢异喹啉基，四氢喹啉基，6H-1,2,5-噻二嗪基，1,2,3-噻二唑基，1,2,4-噻二唑基，1,2,5-噻二唑基，1,3,4-噻二唑基，噻蒽基，噻唑基，噻吩基，噻吩并噻唑基，噻吩并噁唑基，噻吩并咪唑基，硫代苯基，三嗪基，1,2,3-三唑基，1,2,4-三唑基，1,2,5-三唑基，1,3,4-三唑基，氧杂环丁烷基，氮杂环丁烷基，或呫吨基；上述每个基团任选经取代。
在一些实施例中，L是
在一些实施例中，L是
对于上述每个L，本发明考虑任一方向的取代(例如在通式I中，表示
在本发明的任一通式的一些实施例中，Y是-NRC(O)、-NRC(O)N(R)、-NRSO2、或N(R)。
在本发明的任一通式的一些实施例中，Y是O、S、SO2、SO、C(O)、CO2、或C(O)N(R)。
在本发明的任一通式的一些实施例中，Y不存在。
在本发明的任一通式的一些实施例中，Y是
在本发明的任一通式的一些实施例中，R1是任选经取代的C1–6脂族基团。在一些实施例中，R1是任选经取代的C3–10芳基。在一些实施例中，R1是任选经取代的3-8元饱和或部分不饱和碳环。在一些实施例中，R1是任选经取代的具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元杂环。在一些实施例中，R1是任选经取代的具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环。
在本发明的任一通式的一些实施例中，R1是C1–6脂族基团。在一些实施例中，R1是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、直链或支链的戊基、或直链或支链的己基；上述每个基团任选经取代。
在本发明的任一通式的一些实施例中，R1是任选经取代的C2–6烯基。在一些实施例中，R1任选经取代的C2–6炔基。
在本发明的任一通式的一些实施例中，R1是
在本发明的任一通式的一些实施例中，X是O、C(O)、CO2、C(O)N(R)、-NRC(O)、-NRC(O)N(R)、-NRSO2、或N(R)。在一些实施例中，X是O、C(O)N(R)、-NRC(O)、或N(R)。在一些实施例中，X is O、C(O)NH、-NHC(O)、NH、或N(Me)。在一些实施例中，X不存在。
在本发明的任一通式的一些实施例中，R4’是二价C1–6脂族基团，C3–10芳基，3-8元饱和或部分不饱和碳环，具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元杂环，或者具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环，上述每个基团任选经取代。
在一些实施例中，R4’是任选经取代的C1–6脂族基团。在一些实施例中，R4是任选经取代的C3–10芳基。在一些实施例中，R4是任选经取代的3-8元饱和或部分不饱和碳环。在一些实施例中，R4是任选经取代的具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元杂环。在一些实施例中，R4是任选经取代的具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环。
在一些实施例中，R4’是二价甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、直链或支链的戊基、直链或支链的己基、或直链或支链的庚基。在一些实施例中，R4’是甲基。
在一些实施例中，R4’是如下二价基团：苯基，萘基，环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基，金刚烷基，环辛基，[3.3.0]双环辛烷基，[4.3.0]双环壬烷基，[4.4.0]双环癸烷基，[2.2.2]双环辛烷基，芴基，茚满基，四氢萘基，吖啶基，吖辛因基，苯并咪唑基，苯并呋喃基，苯并噻吩基，苯并苯硫基，苯并噁唑基，苯并噻唑基，苯并三唑基，苯并四唑基，苯并异噁唑基，苯并异噻唑基，苯并咪唑啉基，咔唑基，NH-咔唑基，咔啉基，色满基，色烯基，噌啉基，十氢喹啉基，2H,6H-1,5,2-二噻嗪基，二氢呋喃并[2,3-b]四氢呋喃基，呋喃基，呋咱基，咪唑烷基，咪唑啉基，咪唑基，1H-吲唑基，吲哚烯基，二氢吲哚基，中氮茚基，吲哚基，3H-吲哚基，异二氢吲哚，异吲哚烯基，异苯并呋喃基，异色满基，异吲唑基，异二氢吲哚，异吲哚基，异喹啉基，异噻唑基，异噁唑基，吗啉基，萘啶基，八氢异喹啉基，噁二唑基，1,2,3-噁二唑基，1,2,4-噁二唑基；1,2,5-噁二唑基，1,3,4-噁二唑基，噁唑烷基，噁唑基，噁唑烷基，嘧啶基，菲啶基，菲咯啉基，吩嗪基，吩噻嗪基，苯并氧硫杂环己二烯基，吩噁嗪基，酞嗪基，哌嗪基，哌啶基，蝶啶基，嘌呤基，吡喃基，吡嗪基，吡唑烷基，吡唑啉基，吡唑基，哒嗪基，吡啶并噁唑，吡啶并咪唑，吡啶并噻唑，吡啶基，吡啶基，嘧啶基，吡咯烷基，吡咯啉基，2H-吡咯基，吡咯基，喹唑啉基，喹啉基，4H-喹嗪基，喹喔啉基，奎宁环基，四氢呋喃基，四氢异喹啉基，四氢喹啉基，6H-1,2,5-噻二嗪基，1,2,3-噻二唑基，1,2,4-噻二唑基，1,2,5-噻二唑基，1,3,4-噻二唑基，噻蒽基，噻唑基，噻吩基，噻吩并噻唑基，噻吩并噁唑基，噻吩并咪唑基，硫代苯基，三嗪基，1,2,3-三唑基，1,2,4-三唑基，1,2,5-三唑基，1,3,4-三唑基，氧杂环丁烷基，氮杂环丁烷基，或呫吨基；上述每个基团任选经取代。
在一些实施例中，R4’如下二价基团：苯基，呋喃基，呋咱基，咪唑烷基，咪唑啉基，咪唑基，1H-吲唑基，吲哚烯基(indolenyl)，异噁唑基，噁二唑基，1,2,3-噁二唑基，1,2,4-噁二唑基；1,2,5-噁二唑基，1,3,4-噁二唑基，噁唑烷基，噁唑基，噁唑烷基，嘧啶基，哌嗪基，哌啶基，嘌呤基，吡喃基，吡嗪基，吡唑烷基，吡唑啉基，吡唑基，哒嗪基，吡啶基，吡啶基，嘧啶基，吡咯烷基，吡咯啉基，2H-吡咯基，吡咯基，四氢呋喃基，噻唑基，噻吩基，硫代苯基，氧杂环丁烷基，或氮杂环丁烷基；上述每个基团任选经取代。
在一些实施例中，R4’是如下二价基团：苯基，吡啶基，哌啶基或吡唑基，上述每个基团任选经取代。
在一些实施例中，本发明的探针化合物包含所提供的本文描述的任何通式所示的化合物，其借助二价系栓部分-T1-系栓于可检测部分Rt。系栓部分通过R4’连接到本发明的化合物。
在一些实施例中，Rt为选自一次标记或二次标记的可检测部分。在一些实施例中，Rt为选自荧光标记(例如荧光染料或荧光团)、质量卷标、化学发光基团、发色团、电子致密基团或能量转移剂的可检测部分。在一些实施例中，Rt是生物素、生物素亚砜、放射性同位素、或荧光标记。
本文使用的术语“可检测部分”与术语“标记”和“报导体”可互换使用，而且指能够进行检测的任何部分，例如一次标记和二次标记。可使用定量(绝对、近似或相对地)所研究系统中的可检测部分的方法来测量可检测部分的存在。在一些实施例中，所述方法是所属领域的普通技术人员众所周知的，并且包括定量报导体部分(例如标记、染料、光交联剂、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、抗体或抗体片段、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射性部分、量子点、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光隔离部分(photocaged moiety)、光化辐射可激发部分、配体、可光异构化部分、生物素、生物素类似物(例如生物素亚砜)、并有重原子的部分、可化学裂解的基团、可光裂解的基团、氧化还原活性剂、同位素标记的部分、生物物理学探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、嵌入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记和上述的任何组合)的任何方法。
一次标记(例如放射性同位素(例如氚、32P、33P、35S、14C、123I、124I、125I、或131I))、质量卷标(包括(但不限于)稳定同位素(例如13C、2H、17O、18O、15N、19F、和127I))、正电子发射同位素(例如11C、18F、13N、124I、和15O)和荧光标记是产生信号的报导基团，其可在未经进一步修饰下进行检测。可检测部分可通过一些方法来进行分析。这些方法的实例是荧光、正电子发射断层摄影法、SPECT医学成像、化学发光、电子自旋共振、紫外/可见光吸收光谱分析、质谱分析、核磁共振、磁共振、流式细胞测量术、自动放射照相术、闪烁计数、磷成像和电化学方法。
本文使用的术语“二次标记”是指需要存在能产生可检测信号的第二中间物的部分，例如生物素和各种蛋白质抗原。对于生物素，二次中间物可包括抗生蛋白链菌素-酶结合物或抗生蛋白链菌素-抗体结合物。对于抗原标记，二次中间物可包括抗体-酶结合物。一些荧光基团可充当二次标记，因为其在非辐射性荧光共振能量转移(FRET)的过程中将能量转移到另一基团，而且第二基团会产生所检测的信号。
本文使用的术语“荧光标记”、“荧光染料”和“荧光团”是指吸收某一指定激发波长的光能并发射一种不同波长的光能的部分。荧光标记的实例包括(但不限于)：Alexa Fluor系列染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660和Alexa Fluor680)、AMCA、AMCA-S、BODIPY系列染料(BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、BODIPY 493/503、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665)、羧基罗丹明 6G(caroxyrhodamine6G)、羧基-X-罗丹明(ROX)、瀑布蓝(Cascade Blue)、瀑布黄(Cascade Yellow)、香豆素343(Coumarin 343)、花青染料(Cyanine dye)(Cy3、Cy5、Cy3.5、Cy5.5)、丹酰(Dansyl)、达坡(Dapoxyl)、二烷基氨基香豆素、4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基-荧光素、DM-NERF、伊红(Eosin)、藻红(Erythrosin)、荧光素(Fluorescein)、FAM、羟基香豆素、IRDyes(IRD40、IRD700、IRD800)、J0E、丽丝胺罗丹明B(Lissamine rhodamine B)、马里那蓝(MarinaBlue)、甲氧基香豆素、萘并荧光素(Naphthofluorescein)、俄勒冈绿 488(Oregon Green488)、俄勒冈绿 500、俄勒冈绿 514、太平洋蓝(Pacific Blue)、PyMPO、芘、罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、对甲氨基酚绿(Rhodol Green)，2’,4’,5’,7’-四溴砜-荧光素、四甲基-罗丹明(TMR)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、得克萨斯红(Texas Red)、得克萨斯红-X、5(6)-羧基荧光素、2,7-二氯荧光素、N,N-双(2,4,6-三甲基苯基)-3,4：9,10-茈双(二甲酰亚胺)、HPTS、乙基伊红、DY-490XL MegaStokes、DY-485XL MegaStokes、阿第伦达克绿 520(Adirondack green 520)、ATTO 465、ATTO 488、ATTO 495、YOYO-1,5-FAM、BCECF、二氯荧光素、罗丹明 110、罗丹明 123、YO-PRO-1、SYTOX绿、钠绿、SYBR绿I、Alexa Fluor 500、FITC、Fluo-3、Fluo-4、荧光-祖母绿(氟-emerald)、YoYo-l ssDNA、YoYo-l dsDNA、YoYo-1、SYTORNASelect、Diversa绿-FP、龙绿(Dragon Green)、EvaGreen、冲浪绿EX(Surf Green EX)、光谱绿(Spectrum Green)、NeuroTrace 500525、NBD-X、MitoTracker绿FM、LysoTracker绿DND-26、CBQCA、PA-GFP(活化后)、WEGFP(活化后)、F1ASH-CCXXCC、单体阿兹米绿(AzamiGreen monomeric)、阿兹米绿、绿色荧光蛋白(GFP)、EGFP(坎培尔提森(Campbell Tsien2003))、EGFP(帕特森(Patterson)2001)、枫绿(Kaede Green)、7-苯甲基氨基-4-硝基苯基-2-氧杂-1,3-二唑、Bexl、多柔比星、荧光绿(Lumio Green)和SuperGlo GFP。
本文使用的术语“质量卷标”是指能够使用质谱分析(MS)检测技术根据质量唯一性检测的任何部分。质量卷标的实例包括电泳释放卷标，例如N-[3-[4'-[(对甲氧基四氟苯甲基)氧基]苯基]-3-甲基甘油基]异哌啶甲酸、4'-[2,3，5，6-四氟-4-(五氟苯氧基)]甲基苯乙酮、及其衍生物。这些质量卷标的合成和效用描述于美国专利4,650,750、4,709,016、5,360,8191、5,516,931、5,602,273、5,604,104、5,610,020和5,650,270中。质量卷标的其它实例包括(但不限于)核苷酸、双脱氧核苷酸、具有不同长度和碱基组成的寡核苷酸、寡肽、寡糖、以及具有不同长度和单体组成的其它合成聚合物。具有适当质量范围(100到2000道尔顿(Dalton))的多种中性与带电有机分子(生物分子或合成化合物)也可用作质量卷标。稳定同位素(例如 13C、2H、17O、18O和 15N)也可用作质量卷标。
本文使用的术语“化学发光基团”是指在不加热情况下因发生化学反应而发光的基团。举例来说，鲁米诺(luminol)(5-氨基-2,3-二氢-1，4-酞嗪二酮)与如过氧化氢(H2O2)等氧化剂在碱和金属催化剂存在下反应，产生激发态产物(3-氨基邻苯二甲酸酯，3-APA)。
本文使用的术语“发色团”是指吸收可见波长、紫外(UV)波长或红外(IR)波长的光的分子。
本文使用的术语“染料”是指含有发色团的可溶性着色物质。
本文使用的术语“电子致密基团”是指当用电子束照射时会散射电子的基团。所述基团包括(但不限于)钼酸铵、碱式硝酸铋、碘化镉、碳酰胼、六水合氯化铁、六亚甲基四胺、无水三氯化铟、硝酸镧、三水合乙酸铅、三水合柠檬酸铅、硝酸铅、高碘酸、磷钼酸、磷钨酸、铁氰化钾、亚铁氰化钾、钌红、硝酸银、“浓”蛋白银(silver proteinate)(Ag分析：8.0-8.5％)、四苯基卟吩银(S-TPPS)、氯金酸钠、钨酸钠、硝酸铊、氨基硫脲(TSC)、乙酸铀酰、硝酸铀酰和硫酸氧钒。
本文使用的术语“能量转移剂”是指可贡献能量或从另一分子接受能量的分子。仅举例来说，荧光共振能量转移(FRET)为偶极-偶极偶合过程，通过所述过程，荧光供体分子的激发态能量非辐射性地转移到未激发的受体分子，随后所述受体分子以较长波长将所贡献能量以荧光形式发射。
本文使用的术语“并有重原子的部分”是指并有通常比碳重的原子的离子的基团。在一些实施例中，所述离子或原子包括(但不限于)硅、钨、金、铅和铀。
本文使用的术语“光亲和标记”是指一种标记，所述标记具有当曝露于光时会与所述标记具有亲和性的分子形成键联的基团。
本文使用的术语“光隔离部分”是指当在一些波长下光照时共价或非共价结合其它离子或分子的基团。
本文使用的术语“可光异构化部分”是指当光照时由一种异构形式变为另一种异构形式的基团。
本文使用的术语“放射性部分”是指核自发地放出核辐射(例如，α、β或γ粒子)的基团；其中α粒子为氦核，β粒子为电子，且γ粒子为高能量光子。
本文使用的术语“自旋标记”是指含有显示不成对电子自旋的原子或原子团的分子(即，稳定的顺磁性基团)，在一些实施例中，这些分子是借助电子自旋共振谱分析来进行检测，而在其它实施例中其连接到另一分子。所述白旋标记分子包括(但不限于)硝酰基和氮氧化物，而且在一些实施例中，其为单自旋标记或双自旋标记。
本文使用的术语“量子点”是指胶状半导体纳米晶体，在一些实施例中，其可在近红外范围内检测，而且具有极高量子产率(即，在适度光照时非常明亮)。
所属领域的普通技术人员将认识到，可检测部分可经由适合的取代基连接至所提供的化合物。本文使用的术语“适合的取代基”是指能够共价连接至可检测部分的部分。这些部分是所属领域的普通技术人员众所周知的，并且包括含有例如羧酸酯部分、氨基部分、硫醇部分或羟基部分等的基团。应了解，这些部分可直接连接到所提供的化合物，或经由系栓部分(例如二价饱和或不饱和烃链)连接到所提供的化合物。
在一些实施例中，这些可检测部分是经由点击化学(click chemistry)连接到所提供的化合物。在一些实施例中，所述部分经由迭氮化物与炔烃任选在铜催化剂存在下发生1,3-环加成反应来连接。所属领域中已知使用点击化学的方法，而且其包括罗斯托斯夫(Rostovtsev)等人，应用化学(国际版)(Angew.Chem.Int.Ed.)2002,41,2596-99；和孙(Sun)等人，生物共轭化学(Bioconjugate Chem.)，2006，17，52-57所述的方法。在一些实施例中，提供预备点击抑制剂部分，并使其与预备点击-T-Rt部分反应。本文使用的“预备点击”是指含有迭氮化物或炔烃以用于点击化学反应中的部分。在一些实施例中，预备点击抑制剂部分包含迭氮化物。在一些实施例中，预备点击-T-Rt部分包含用于无铜点击化学反应中的应变环辛炔(strained cyclooctyne)(例如使用贝斯肯(Baskin)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)2007，104，16793-16797中所述的方法)。
在一些实施例中，可检测部分Rt选自标记、染料、光交联剂、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、抗体或抗体片段、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射性部分、量子点、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光隔离部分、光化辐射可激发部分、配体、可光异构化部分、生物素、生物素类似物(例如生物素亚砜)、并有重原子的部分、可化学裂解的基团、可光裂解的基团、氧化还原活性剂、同位素标记的部分、生物物理学探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、嵌入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、或其组合。
在一些实施例中，Rt为生物素或其类似物。在一些实施例中，Rt为生物素。在一些实施例中，Rt为生物素亚砜。
在另一实施例中，Rt为荧光团。在又一实施例中，所述荧光团选自Alexa Fluor系列染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、AlexaFluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660和Alexa Fluor 680)、AMCA、AMCA-S、BODIPY系列染料(BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、BODIPY493/503、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665)、羧基罗丹明 6G(caroxyrhodamine 6G)、羧基-X-罗丹明(ROX)、瀑布蓝(Cascade Blue)、瀑布黄(Cascade Yellow)、香豆素343(Coumarin 343)、花青染料(Cyanine dye)(Cy3、Cy5、Cy3.5、Cy5.5)、丹酰(Dansyl)、达坡(Dapoxyl)、二烷基氨基香豆素、4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基-荧光素、DM-NERF、伊红(Eosin)、藻红(Erythrosin)、荧光素(Fluorescein)、FAM、羟基香豆素、IRDyes(IRD40、IRD700、IRD800)、JOE、丽丝胺罗丹明B(Lissamine rhodamine B)、马里那蓝(MarinaBlue)、甲氧基香豆素、萘并荧光素(Naphthofluorescein)、俄勒冈绿 488(Oregon Green488)、俄勒冈绿 500、俄勒冈绿 514、太平洋蓝(Pacific Blue)、PyMPO、芘、罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、对甲氨基酚绿(Rhodol Green)，2’,4’,5’,7’-四溴砜-荧光素、四甲基-罗丹明(TMR)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、得克萨斯红(Texas Red)、得克萨斯红-X、5(6)-羧基荧光素、2,7-二氯荧光素、N,N-双(2,4,6-三甲基苯基)-3,4：9,10-茈双(二甲酰亚胺)、HPTS、乙基伊红、DY-490XL MegaStokes、DY-485XL MegaStokes、阿第伦达克绿 520(Adirondack green 520)、ATTO 465、ATTO 488、ATTO 495、YOYO-1,5-FAM、BCECF、二氯荧光素、罗丹明 110、罗丹明 123、YO-PRO-1、SYTOX绿、钠绿、SYBR绿I、Alexa Fluor 500、FITC、Fluo-3、Fluo-4、荧光-祖母绿(氟-emerald)、YoYo-l ssDNA、YoYo-l dsDNA、YoYo-1、SYTORNASelect、Diversa绿-FP、龙绿(Dragon Green)、EvaGreen、冲浪绿EX(Surf Green EX)、光谱绿(Spectrum Green)、NeuroTrace 500525、NBD-X、MitoTracker绿FM、LysoTracker绿DND-26、CBQCA、PA-GFP(活化后)、WEGFP(活化后)、F1ASH-CCXXCC、单体阿兹米绿(AzamiGreen monomeric)、阿兹米绿、绿色荧光蛋白(GFP)、EGFP(坎培尔提森(Campbell Tsien2003))、EGFP(帕特森(Patterson)2001)、枫绿(Kaede Green)、7-苯甲基氨基-4-硝基苯基-2-氧杂-1,3-二唑、Bexl、多柔比星、荧光绿(Lumio Green)和SuperGlo GFP。
如上文大体描述，所提供的探针化合物包含系栓部分-T1-，其将不可逆抑制剂连接于可检测部分。本文使用的术语“系栓剂”或“系栓部分”是指任何二价化学间隔基，包括(但不限于)共价键、聚合物、水溶性聚合物、任选经取代的烷基、任选经取代的杂烷基、任选经取代的杂环烷基、任选经取代的环烷基、任选经取代的杂环基、任选经取代的杂环烷基烷基、任选经取代的杂环烷基烯基、任选经取代的芳基、任选经取代的杂芳基、任选经取代的杂环烷基烯基烷基、任选经取代的酰胺部分、醚部分、酮部分、酯部分、任选经取代的氨基甲酸酯部分、任选经取代的腙部分、任选经取代的胼部分、任选经取代的肟部分、二硫化物部分、任选经取代的亚胺部分、任选经取代的磺酰胺部分、砜部分、亚砜部分、硫醚部分或其任何组合。
在一些实施例中，系栓部分-T1-选自共价键、聚合物、水溶性聚合物、任选经取代的烷基、任选经取代的杂烷基、任选经取代的杂环烷基、任选经取代的环烷基、任选经取代的杂环烷基烷基、任选经取代的杂环烷基烯基、任选经取代的芳基、任选经取代的杂芳基和任选经取代的杂环烷基烯基烷基。在一些实施例中，系栓部分为任选经取代的杂环。在其它实施例中，杂环选自氮丙啶、环氧乙烷、环硫化物、氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、吡咯啉、四氢呋喃、四氢噻吩、批咯烷、批唑、批咯、咪唑、三唑、四唑、噁唑、异噁唑、环氧乙烯、噻唑、异噻唑、二硫杂环戊烷、呋喃、噻吩、哌啶、四氢吡喃、硫杂环己烷(thiane)、吡啶、吡喃、噻喃、哒嗪、嘧啶、吡嗪、哌嗪、噁嗪、噻嗪、二硫杂环己烷和二噁烷。在一些实施例中，杂环为哌嗪。在其它实施例中，系栓部分任选经卤素、-CN、-OH、-NO2、烷基、S(O)和S(O)2取代。在其它实施例中，水溶性聚合物是PEG基团。
在其它实施例中，系栓部分使可检测部分与激酶抑制剂部分之间在空间上充分隔开。在其它实施例中，系栓部分是稳定的。在另一实施例中，系栓部分实质上不影响可检测部分的反应。在其它实施例中，系栓部分使探针化合物在化学上稳定。在其它实施例中，系栓部分使探针化合物具有足够溶解性。
在一些实施例中，系栓部分-T1-(例如水溶性聚合物)在一端与所提供的不可逆抑制剂偶合，并在另一端与可检测部分Rt偶合。在其它实施例中，水溶性聚合物是经由所提供不可逆抑制剂的官能团或取代基偶合。在其它实施例中，水溶性聚合物是经由报导部分的官能团或取代基偶合。
在一些实施例中，系栓部分-T1-中所用的亲水性聚合物的实例包括(但不限于)：聚烷基醚和其经烷氧基封端的类似物(例如，聚氧乙二醇、聚氧乙二醇/丙二醇和其经甲氧基或乙氧基封端的类似物，聚氧乙二醇，后者也称为聚乙二醇或PEG)；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯烷基醚；聚噁唑啉、聚烷基噁唑啉和聚羟烷基噁唑啉；聚丙烯酰胺、聚烷基丙烯酰胺和聚羟烷基丙烯酰胺(例如，聚羟丙基甲基丙烯酰胺和其衍生物)；聚丙烯酸羟烷基酯；聚唾液酸和其类似物；亲水性肽序列；多糖和其衍生物，包括葡聚糖和葡聚糖衍生物，例如羧甲基葡聚糖、硫酸葡聚糖、氨基葡聚糖；纤维素和其衍生物，例如羧甲基纤维素、羟烷基纤维素；几丁质和其衍生物，例如壳聚糖、琥珀酰基壳聚糖、羧甲基几丁质、羧甲基壳聚糖；透明质酸和其衍生物；淀粉；海藻酸盐；硫酸软骨素；白蛋白；普鲁兰多糖(pullulan)和羧甲基普鲁兰多糖；聚氨基酸和其衍生物，例如聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚天冬酰胺；马来酸酐共聚物，例如苯乙烯马来酸酐共聚物、二乙烯基乙基醚马来酸酐共聚物；聚乙烯醇；其共聚物；其三元共聚物；其混合物；和上述物质的衍生物。在其它实施例中，水溶性聚合物可为任何结构形式，包括(但不限于)线性、叉状或分支形式。在其它实施例中，多官能聚合物衍生物包括(但不限于)具有两个末端的线性聚合物，各末端键结至相同或不同的官能团。
在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在其它实施例中，聚合物的分子量具有宽广的范围，包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da之间或100,000Da以上。在其它实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)约100,000Da、约95,000Da、约90,000Da、约85,000Da、约80,000Da、约75,000Da、约70,000Da、约65,000Da、约60,000Da、约55,000Da、约50,000Da、约45,000Da、约40,000Da、约35,000Da、30,000Da、约25,000Da、约20,000Da、约15,000Da、约10,000Da、约9,000Da、约8,000Da、约7,000Da、约6,000Da、约5,000Da、约4,000Da、约3,000Da、约2,000Da、约1,000Da、约900Da、约800Da、约700Da、约600Da、约500Da、约400Da、约300Da、约200Da和约100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子为分支聚合物。在其它实施例中，分支链PEG的分子量介于约1,000Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)约100,000Da、约95,000Da，约90,000Da、约85,000Da、约80,000Da、约75,000Da、约70,000Da、约65,000Da、约60,000Da、约55,000Da、约50,000Da、约45,000Da、约40,000Da、约35,000Da、约30,000Da、约25,000Da、约20,000Da、约15,000Da、约10,000Da、约9,000Da、约8,000Da、约7,000Da、约6,000Da、约5,000Da、约4,000Da、约3,000Da、约2,000Da和约1,000Da。在一些实施例中，分支链PEG的分子量介于约1,000Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，分支链PEG的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，分支链PEG的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，分支链PEG的分子量介于约5,000Da与约20,000Da之间。实质上水溶性主链的上述清单绝非详尽且仅用于说明，并且在一些实施例中，具有上述质量的所有聚合物材料都适用于本文所述的方法和组合物中。
在一些实施例中，系栓部分-T1-具有以下结构：
在一些实施例中，系栓部分-T1-具有以下结构：
式中m是0、1、2、3、4、5、6、或7。
在一些实施例中，-Rt是奎宁、苯基丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、NADH、FMN、EDANS、荧光黄、芘、4-MU、AMC、DAPI、赫斯特33342(Hoechst33342)、NBD、bimane、瀑布黄、荧光、RH110、TMR、SRh101、萘并荧光素(naphthofluorescein)、SNARF-1、碘化丙、BODIPY-FL、BODIPY-TR、Cy3、Cy5、Cy7、IRDye700DX、或试卤灵。
在一些实施例中，-T1-Rt具有以下结构：
在一些实施例中，-T1-Rt具有以下结构：
在一些实施例中，-T1-Rt具有以下结构：
在一些实施例中，-T1-Rt具有以下结构：
在一些实施例中，-T1-Rt具有以下结构：
在一些实施例中，-T1-Rt具有以下结构：
在一些实施例中，-T1-Rt具有以下结构：
在一些实施例中，-T1-Rt具有以下结构：
在一些实施例中，-T1-Rt具有以下结构：
在一些实施例中，-T1-Rt具有以下结构：
应当理解，许多T1-Rt试剂可通过商业途径获得。
在一些实施例中，本发明提供一种测定患者体内所提供的不可逆抑制剂对蛋白质激酶的占用率的方法，所述方法包括提供一种或多种在给予任何一剂所述不可逆抑制剂化合物之前从患者获得的组织、细胞类型或其溶解产物；提供一种或多种从已给予了至少一剂所述不可逆抑制剂化合物的患者获得的组织、细胞类型或其溶解产物，使所述组织、细胞类型或其溶解产物与探针化合物(即，通式I所示的化合物)接触以共价修饰所述溶解产物中存在的至少一种蛋白质激酶，和测量经所述探针化合物共价修饰的所述蛋白质激酶的量，以便相较于所述探针化合物对所述蛋白质激酶的占用率，测定所述式I化合物对所述蛋白质激酶的占用率。在一些实施例中，所述方法进一步包括调整本文提供的化合物的剂量以增加对所述蛋白质激酶的占用率的步骤。在一些其它实施例中，所述方法进一步包括调整本文提供的化合物的剂量以降低对所述蛋白质激酶的占用率的步骤。
在一些实施例中，本发明提供一种测定患者体内所提供的不可逆抑制剂对蛋白质激酶的占用率的方法，所述方法包括提供一种或多种从已给予了至少一剂所述不可逆抑制剂化合物的患者获得的组织、细胞类型或其溶解产物，使所述组织、细胞类型或其溶解产物与探针化合物(即，通式I所示的化合物)接触以共价修饰所述溶解产物中存在的至少一种蛋白质激酶，和测量经所述探针化合物共价修饰的所述蛋白质激酶的量，以便相较于所述探针化合物对所述蛋白质激酶的占用率，测定所述式I化合物对所述蛋白质激酶的占用率。在一些实施例中，所述方法进一步包括调整本文提供的化合物的剂量以增加对所述蛋白质激酶的占用率的步骤。在一些其它实施例中，所述方法进一步包括调整本文提供的化合物的剂量以降低对所述蛋白质激酶的占用率的步骤。
本文使用的术语“占用率”或“占用”是指所提供的共价抑制剂化合物对蛋白质激酶的修饰程度。所属领域的普通技术人员应了解，需要给予对达成对蛋白质激酶的所需有效占用率来说尽可能最低的剂量。
在一些实施例中，欲修饰的蛋白质激酶是BTK。
在一些实施例中，探针化合物包含待测定占用率的不可逆抑制剂。
在一些实施例中，BTK抑制剂化合物是不可逆抑制剂。在一些实施例中，BTK抑制剂化合物包含迈克受体部分。
在一些实施例中，本发明提供一种用于评估所提供的不可逆抑制剂在哺乳动物中的功效的方法，所述方法包括对所述哺乳动物给予所提供的不可逆抑制剂；对从所述哺乳动物分离的组织或细胞或者其溶解产物给予所提供的探针化合物；测量所述探针化合物的可检测部分的活性；和将可检测部分的活性与标准物相比较。
在其它实施例中，本发明提供一种用于评估所提供的不可逆抑制剂在哺乳动物中的药效学的方法，所述方法包括对所述哺乳动物给予所提供的不可逆抑制剂；对一种或多种从所述哺乳动物分离的细胞类型或其溶解产物给予本文提供的探针化合物；和在给予抑制剂后的不同时间点测量所述探针化合物的可检测部分的活性。
在其它实施例中，本发明提供一种用于在活体外标记蛋白质激酶的方法，所述方法包括使所述蛋白质激酶与本文所述的探针化合物接触。在一个实施例中，接触步骤包括将蛋白质激酶与本文提供的探针化合物一起培育。
在一些实施例中，本发明提供一种用于在活体外标记蛋白质激酶的方法，所述方法包括使一种或多种表达所述蛋白质激酶的细胞或组织或者其溶解产物与本文所述的探针化合物接触。
在一些其它实施例中，本发明提供一种用于检测经标记的蛋白质激酶的方法，所述方法包括借助电泳法分离蛋白质，所述蛋白质包含经本文所述的探针化合物标记的蛋白质激酶，和借助荧光来检测所述探针化合物。
在一些实施例中，本发明提供一种用于在活体外评估所提供的不可逆抑制剂的药效学的方法，所述方法包括将所提供的不可逆抑制剂与目标蛋白质激酶一起培育，将本文提供的探针化合物添加到目标蛋白质激酶中，和测定经所述探针化合物修饰的目标的量。
在一些实施例中，探针是借助十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来进行检测。在其它实施例中，探针是借助ELISA来进行检测。在一些实施例中，探针是借助流式细胞测量术来进行检测。
在其它实施例中，本发明提供一种用不可逆抑制剂探测激酶组(kinome)的方法，所述方法包括将一种或多种细胞类型或其溶解产物与生物素化探针化合物一起培育以产生经生物素部分修饰的蛋白质，消化所述蛋白质，用亲和素或其类似物进行捕捉，和进行多维LC-MS-MS，以鉴别经所述探针化合物修饰的蛋白质激酶和所述激酶的加合位点(adductionsite)。
在一些实施例中，本发明提供一种用于测量细胞中的蛋白质合成的方法，所述方法包括将细胞与目标蛋白质的不可逆抑制剂一起培育，在特定时间点形成细胞的溶解产物，和将所述细胞溶解产物与本发明探针化合物一起培育，以测量在较长时间段内自由蛋白质的出现。
在其它实施例中，本发明提供一种用于确定哺乳动物的给药时程以使目标蛋白质激酶的占用率达到最大的方法，所述方法包括分析一种或多种从已给予了本文所提供的任一通式所示的不可逆抑制剂的哺乳动物分离的细胞类型或其溶解产物(来源于例如所述哺乳动物的脾细胞、周围B细胞、全血、淋巴结、肠组织或其它组织)，其中所述分析步骤包含使所述一种或多种组织、细胞类型或者其溶解产物与所提供的探针化合物接触，和测量经所述探针化合物共价修饰的蛋白质激酶的量。
在一些实施例中，本发明提供了确定用于治疗受试者中BTK介导的疾病或病症的有效剂量的方法，所述方法包括向受试者施加一定量的BTK抑制剂，收集受试者的生物样品，将所述样品与探针接触以形成探针结合的BTK激酶，检测所述样品中的探针结合的BTK激酶的量，基于在所述样品中检测到的探针结合的激酶的量确定所述BTK激酶的靶标占用率，以及确定能增加功效的BTK抑制剂的剂量。
在一些实施例中，本发明提供了如上所述的方法，还包括重复用不同量的BTK抑制剂的步骤，以确定剂量分布(dosing profile)。
在一些实施例中，在给予BTK抑制剂后1小时至8周进行所述测定。在一些实施例中，在给予BTK抑制剂后1小时至4周进行所述测定。在一些实施例中，在给予BTK抑制剂后0小时至10小时进行所述测定。在一些实施例中，在给予BTK抑制剂后5分钟至8小时进行所述测定。
在一些实施例中，使用本文描述的任一通式所示的化合物在体外检测BTK占用率的水平。
在一些实施例中，在得自患者/受试者的血液或生物样品中测量BTK的含量。
在一些实施例中，使用免疫荧光法测定BTK占用率的水平。在一些实施例中，使用免疫印迹方法测定BTK占用率的水平。在一些实施例中，使用ELISA测定法测定BTK占用率的水平。在一些实施例中，使用SDS-PAGE测量BTK占用率的水平。
在一些实施例中，本发明提供了一种使用BTK抑制剂选择用于BTK相关疾病/病症治疗的患者的方法，所述方法包括使用BTK占用率测定法测定患者样品中的BTK的含量或BTK转录靶的含量，将BTK或BTK转录靶的高含量与对治疗的阳性应答相关联，以及根据所述BTK的含量或BTK转录靶的含量选择或排除患者进行治疗。
在一些实施例中，本发明提供了一种测量患者对治疗的应答的方法，所述方法包括向所述患者施加BTK抑制剂，使用BTK占用率测定法测量患者样品中的BTK的含量或BTK转录靶的含量，将BTK或BTK转录靶的降低含量与施加BTK抑制剂的阳性应答相关联，以及根据所述BTK的含量或BTK转录靶的含量继续或终止用所述化合物治疗患者。
在一些实施例中，本发明提供了一种确定受试者的给药时间表的方法，所述方法包括以下步骤：i)如果靶标占用率低于约 50％，则增加BTK激酶抑制剂的剂量，ii)如果所述靶标占用率至少在约70％以上，则降低所述BTK激酶抑制剂的剂量，iii)维持相同的所述BTK激酶抑制剂治疗方案，或iv)中断所述治疗方案。
在一些实施例中，本发明提供了一种基于靶标占用率确定BTK激酶抑制剂疗法的功效的方法，其中所述BTK激酶抑制剂i)在所述BTK激酶的占用率为至少约70％时有效，或者ii)在所述BTK激酶的占用率低于约50％时无效。
在一些实施例中，本发明提供以上描述的方法，所述方法还包括用捕获剂来捕获探针结合的激酶。在一些实施例中，捕获靶标为链霉亲和素或抗体。在各种实施例中，捕获靶标连接到固体载体。在各种实施例中，固体载体为板、微孔板、珠粒或多个珠粒。
在一些实施例中，本发明提供以上描述的方法，所述方法还包括将探针结合的激酶与一级检测剂，以及任选地，与结合到一级检测剂的二级检测剂接触。在一些实施例中，一级检测剂或二级检测剂包括抗体、珠粒、染料、标签、标记、荧光团、或它们的任意组合。在一些实施例中，一级检测剂是抗BTK抗体、抗ITK抗体、抗TXK抗体、抗TEC抗体、抗BMX抗体、或抗BLK抗体。在另一些实施例中，一级检测剂或二级检测剂偶联到化学发光标记。
在一些实施例中，R1、R2、R3、R4’、T1、Rt、X、Y和L各自的定义如上所述，且按实施例、类别、子类和本文单独或结合进一步加以描述。
在一些实施例中，探针是通式I-a1所示的化合物，
或其药学上可接受的盐，其中R1、R2、R3、R4’、T1、Rt、X、L和Y各自的定义如上所述，且按实施例、类别、子类和本文单独或结合进一步加以描述。
在一些实施例中，本发明提供通式I-a2所示的化合物，
或其药学上可接受的盐，其中R1、R2、R3、R4’、T1、Rt、X、L和Y各自的定义如上所述，且按实施例、类别、子类和本文单独或结合进一步加以描述。
在一些实施例中，本发明提供通式I-a3所示的化合物，
或其药学上可接受的盐，其中R1、R2、R3、R4’、T1、Rt、X、L和Y各自的定义如上所述，且按实施例、类别、子类和本文单独或结合进一步加以描述。
在一些实施例中，本发明提供通式I-a4所示的化合物，
或其药学上可接受的盐，其中R1、R2、R3、R4’、T1、Rt、X、L和Y各自的定义如上所述，且按实施例、类别、子类和本文单独或结合进一步加以描述。
在一些实施例中，本发明提供通式I-a5所示的化合物，
或其药学上可接受的盐，其中R1、R2、R3、R4’、T1、Rt、X、L和Y各自的定义如上所述，且按实施例、类别、子类和本文单独或结合进一步加以描述。.
在一些实施例中，本发明的测定法包括探针化合物(探针化合物是BODIPY标记的探针或生物素标记的探针)，以及使用不同探针测量BTK占用率的测定方法。在一些实施例中，使用基于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的方法测量BODIPY标记的探针与BTK的活性位点的结合。在一些实施例中，使用修饰的ELISA(酶联免疫吸附试验)检测生物素化的探针与BTK的结合，所述修饰的ELISA使用以链霉抗生物素蛋白涂覆的96孔板。在一些实施例中，生物素-链霉抗生物素蛋白测定法以传统的ELISA形式进行，其中使用HRP标记的二级抗体进行检测。在其他一些实施例中，测定法在Meso Scale Discovery(MSD)平台上进行，并且使用SULFO标签标记的抗体来检测。
在一些实施例中，本发明提供选自表1的化合物：
表1
如上文大体定义，基团“L-Y-R1”为弹头基团。不希望受任何特定理论的束缚，相信所述弹头基团特别适于共价结合于一些蛋白质激酶的结合结构域中的关键半胱氨酸残基。所属领域的普通技术人员已知在结合结构域中具有半胱氨酸残基的蛋白质激酶，且其包括BTK或其突变体。因此，在一些实施例中，L-R1的特征在于，L-R1部分能够共价结合于半胱氨酸残基，由此不可逆抑制酶。在一些实施例中，半胱氨酸残基为ATP结合位点的激酶结构域中的半胱氨酸残基。在一些实施例中，半胱氨酸残基是半胱氨酸残基-481。
各种结构示式可以显示杂原子，没有与其连接的基团、根、电荷或反离子。本领域普通技术人员会明白这样的示式意指杂原子与氢连接(例如，应理解为)。
在一些实施例中，按照以下实施例提供的流程合成本发明的化合物。
具体实施方式
如在下面的实施例所描述那样，在某些示例性实施方案中按照以下一般程序制备化合物。应当理解，尽管一般方法描述了本发明某些化合物的合成，但下面的一般方法以及本领域普通技术人员所公知的其他方法的也适用于合成本文描述的所有化合物及每个化合物的子类和种类。
以下方法、流程和实施例的下列描述中使用的符号和惯例与现代科学文献(例如美国化学协会或生物化学杂志)中使用的那些一致。
除非另外指明，所有温度以℃(摄氏度)表示。除非另外指出，全部反应在室温下进行。本发明的化合物由发明人设计的方法合成。
在Bruker Avance III 400MHz光谱仪上记录1H NMR谱。化学位移以在每百万份(ppm，δ单位)表示。偶合常数以赫兹为单位(Hz)。分裂模式描述明显的多重性，表示如下：s(单峰)，d(双峰)，t(三重峰)，q(四重峰)，m(多重峰)，br(宽)。
从Agilent technologies的Agilent 1200系列质谱仪上获得质谱数据，使用大气化学电离(APCI)或电喷雾离子化(ESI)。柱：XBridge C8，3.5μm，4.6x50mm；溶剂A：水+0.1％TFA；溶剂B：ACN；流量：2毫升/分钟；梯度：0分：5％B，8分钟：100％B，8.1分钟：100％B，8.5分：5％B，10分钟，5％B。
从Agilent technologies的Agilent 1200系列高效液相色谱仪上获得HPLC数据，使用XBridge柱。溶剂A：水+0.1％TFA；溶剂B：ACN；流量：2毫升/分钟；梯度：0分：5％B，8分钟：100％B，8.1分钟：100％B，8.5分：5％B，10分钟，5％B。
使用Biotage Initiator Microwave Synthesizer按照本领域已知的标准协议进行微波反应。
实施例1
1'-丙烯酰基-6-{4-[4-(5-{3-[4-(4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-3a,4aλ4-二氮杂-4λ4-硼杂-s-引达省-8-基)-苯基]-硫脲基}-戊酰基)-哌嗪-1-羰基]-苯基氨基}-1',2',3',4',5',6'-六氢-[2,4']联吡啶基-5-羧酸酰胺(1)
将1'-丙烯酰基-6-{4-[4-(5-氨基-戊酰基)-哌嗪-1-羰基]-苯基氨基}-1',2',3',4',5',6'-六氢-[2,4']联吡啶基-5-羧酸酰胺盐酸盐(0.14mmol；1.00eq.；83.00mg)与4,4-二氟-8-(4-异氰硫基-苯基)-1,3,5,7-四甲基-3a,4aλ4-二氮杂-4λ4-硼杂-s-引达省(indacene)(0.15mmol；1.10eq.；58.19mg)和Hünig’s碱(0.42mmol；3.00eq.；53.77mg；0.07ml)混合，再加入至乙腈(38.29mmol；275.95eq.；1572.00mg；2.00ml)和甲醇(12.34mmol；88.95eq.；395.50mg；0.50ml)的混合物中。所述混合物室温搅拌1.5小时。移除全部溶剂，通过硅胶(15微米)纯化所述材料，洗脱梯度：0-20％甲醇在DCM中的溶液，获得1'-丙烯酰基-6-{4-[4-(5-{3-[4-(4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-3a,4aλ4-二氮杂-4λ4-硼杂-s-引达省-8-基)-苯基]-硫脲基}-戊酰基)-哌嗪-1-羰基]-苯基氨基}-1',2',3',4',5',6'-六氢-[2,4']联吡啶基-5-羧酸酰胺(56.00mg，42％)。HPLC：99％，RT＝6.46min。MS：m/z＝943[M+H]+。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ10.91(s，1H)，7.98(bs，1H)，7.87–7.77(m，2H)，7.73(d，J＝7.9Hz，1H)，7.51–7.36(m，4H)，7.36-7.25(m，4H)，6.85(s，1H)，6.73–6.58(m，2H)，6.31(dd，J＝16.8，2.0Hz，1H)，5.99(s，2H)，5.73(dd，J＝10.6，2.0Hz，1H)4.81-4.65(m，2H)，4.23-4.08(m，2H)，3.83-3.47(m，12H)，3.31-3.15(m，1H)，3.00-2.72(m，2H)，2.56(s，3H)，2.50-2.37(m，2H)2.11-1.97(m，2H)，1.89-1.67(m，4H)，1.42(s，3H)，1.61(s，6H)。
实施例2
6-(1-丙烯酰基哌啶-4-基)-2-((4-(4-(5,21-二氧代-1-(2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)-9,12,15,18-四氧杂-6,22-二氮杂二十七烷-27-酰基)哌嗪-1-羰基)苯基)氨基)烟酰胺(2)
将上述的1'-丙烯酰基-6-{4-[4-(5-氨基-戊酰基)-哌嗪-1-羰基]-苯基氨基}-1',2',3',4',5',6'-六氢-[2,4']联吡啶基-5-羧酸酰胺盐酸盐(0.13mmol；1.00eq.；80.00mg)与3-{2-[2-(2-{2-[5-(2-氧代-六氢-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)-戊酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(0.14mmol；1.01eq.；79.52mg；0.07ml)以及Hünig碱(0.40mmol；3.00eq.；51.82mg；0.07ml)混合，再加入乙腈中。得到的混合物在60℃加热1小时。反应物经柱色谱法纯化，洗脱梯度：0-15％甲醇/DCM，获得6-(1-丙烯酰基哌啶-4-基)-2-((4-(4-(5,21-二氧代-1-(2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)-9,12,15,18-四氧杂-6,22-二氮杂二十七烷-27-酰基)哌嗪-1-羰基)苯基)氨基)烟酰胺(44.00mg，32％)。HPLC：99％，RT＝6.46min。MS：m/z＝1035[M+H]+。1HNMR(400MHz，MeOD)δ8.06(d，J＝7.9Hz，1H)，7.88(d，J＝8.7Hz，2H)，7.44(d，J＝8.7Hz，2H)，6.94–6.71(m，2H)，6.24(dd，J＝16.8，2.0Hz，2H)，5.78(dd，J＝10.6，2.0Hz，1H)，5.48(dt，J＝34.5,22.2Hz，2H)，4.50(dd，J＝12.9，5.2Hz，1H)，4.43–4.25(m，2H)，3.80–3.51(m，15H)，3.39–3.34(m，4H)，3.22(dd，J＝23.8，17.0Hz，3H)，3.06–2.84(m，3H)，2.47(dt，J＝12.3，5.7Hz，3H)，2.37–2.01(m，4H)，1.86–1.53(m，7H)，1.54–1.27(m，4H)。
实施例3
用于BTK占用率实验的含有生物素化的探针和MSD平台的人血液
用CPTTM试管收集单个人供体的血液，分离和冷冻外周血单个核细胞(PBMC)。解冻后，将细胞分成3份，分别装在3支试管内。一支试管不作任何处理(无探针)，一支试管用1μM化合物2(含有探针)处理，1支试管用1μM有代表性的不可逆BTK抑制剂处理10分钟，再用1μM化合物2处理(含有探针和BTK抑制剂)。在37℃下与探针一起孵育1小时。然后溶解细胞并通过MSD测定法分析BTK-生物素。结果见图1。

Claims (13)

1.一种用于确定BTK抑制剂化合物占据药物靶标的占用率的方法，所述方法包括：
(a)将包含BTK激酶和BTK抑制剂化合物的混合物的样品与探针接触以形成探针结合的激酶；
(b)检测所述样品中的探针结合的激酶的量；以及
(c)基于在所述样品中检测到的探针结合的激酶的量确定所述BTK抑制剂化合物的占用率。
2.一种用于确定接受了BTK激酶抑制剂疗法的患者体内的药物靶标占用率的测定法，所述方法包括：
(a)将BTK抑制剂化合物给予受试者；
(b)收集所述受试者的生物样品；
(c)将所述样品与探针接触以形成探针结合的BTK激酶；
(d)检测所述样品中的探针结合的BTK激酶的量；以及
(e)基于在所述样品中检测到的探针结合的激酶的量确定所述BTK激酶的靶标占用率。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述探针是通式I所示的化合物：
式中：
环A是具有1或2个氮原子的6元杂芳环，选自吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶；
R2选自–R、卤素、-卤代烷基、–OR、–SR、–CN、–NO2、-SO2R、-SOR、-C(O)R、-CO2R、-C(O)N(R)2、-NRC(O)R、-NRC(O)N(R)2、-NRSO2R、或–N(R)2；
R3选自–R、卤素、-卤代烷基、–OR、–SR、–CN、–NO2、-SO2R、-SOR、-C(O)R、-CO2R、-C(O)N(R)2、-NRC(O)R、-NRC(O)N(R)2、-NRSO2R、或–N(R)2；
其中R2和R3中至少一个是-C(O)N(R)2或CN；
每个R独立地是氢，C1–6脂族基团，C3–10芳基，3-8元饱和或部分不饱和碳环，具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元杂环，或者具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环；上述每个基团任选经取代；或者
在同一个原子上的两个R基团与它们所连接的原子一起形成C3–10芳基，3-8元饱和或部分不饱和碳环，具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元杂环，或者具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环；上述每个基团任选经取代；
L是二价基团，选自C1–6脂族基团，C3–10芳基，3-8元饱和或部分不饱和碳环，具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元杂环，或者具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环，上述每个基团任选经取代；或L是二价基团，选自C1–6脂族基团-C3–10芳基，C1–6脂族基团-3-8元饱和或部分不饱和碳环，C1–6脂族基团-3-7元杂环，或C1–6脂族基团-5-6元单环杂芳环，其中所述3-7元杂环具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子，所述5-6元单环杂芳环具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子；上述每个基团任选经取代；
Y是O、S、SO2、SO、C(O)、CO2、C(O)N(R)、-NRC(O)、-NRC(O)N(R)、-NRSO2、或N(R)；或者Y不存在；
R1是迈克受体，选自C1–6脂族基团，C3–10芳基，3-8元饱和或部分不饱和碳环，具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元杂环，以及具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环；上述每个基团任选经取代；
X是O、S、SO2、SO、C(O)、CO2、C(O)N(R)、-NRC(O)、-NRC(O)N(R)、-NRSO2、或N(R)；或者X不存在；以及
R4’是二价基团，选自C1–6脂族基团，C3–10芳基，3-8元饱和或部分不饱和碳环，具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元杂环，以及具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环；上述每个基团任选经取代；
T1是二价系栓部分；以及
Rt是可检测部分。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述可检测部分包括标记、染料、光交联剂、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、抗体或抗体片段、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射性部分、量子点、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光隔离部分、光化辐射可激发部分、配体、可光异构化部分、生物素、生物素类似物(例如生物素亚砜)、并有重原子的部分、可化学裂解的基团、可光裂解的基团、氧化还原活性剂、同位素标记的部分、生物物理学探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、嵌入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、或者上述的任何组合。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述可检测部分是生物素或其类似物。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述可检测部分是荧光团。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述荧光团选自Alexa Fluor系列染料(AlexaFluor 350、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660和Alexa Fluor 680)、AMCA、AMCA-S、BODIPY系列染料(BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、BODIPY 493/503、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665)、羧基罗丹明6G、羧基-X-罗丹明(ROX)、瀑布蓝、瀑布黄、香豆素343、花青染料(Cy3、Cy5、Cy3.5、Cy5.5)、丹酰、达坡、二烷基氨基香豆素、4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基-荧光素、DM-NERF、伊红、藻红、荧光素、FAM、羟基香豆素、IRDyes(IRD40、IRD700、IRD800)、JOE、丽丝胺罗丹明B、马里那蓝、甲氧基香豆素、萘并荧光素、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝、PyMPO、芘、罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、对甲氨基酚绿，2’,4’,5’,7’-四溴砜-荧光素、四甲基-罗丹明(TMR)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、得克萨斯红、得克萨斯红-X、5(6)-羧基荧光素、2,7-二氯荧光素、N,N-双(2,4,6-三甲基苯基)-3,4：9,10-茈双(二甲酰亚胺)、HPTS、乙基伊红、DY-490XLMegaStokes、DY-485XL MegaStokes、阿第伦达克绿520、ATTO 465、ATTO 488、ATTO 495、YOYO-1,5-FAM、BCECF、二氯荧光素、罗丹明110、罗丹明123、YO-PRO-1、SYTOX绿、钠绿、SYBR绿I、Alexa Fluor 500、FITC、Fluo-3、Fluo-4、荧光-祖母绿、YoYo-l ssDNA、YoYo-l dsDNA、YoYo-1、SYTO RNASelect、Diversa绿-FP、龙绿、EvaGreen、冲浪绿EX、光谱绿、NeuroTrace500525、NBD-X、MitoTracker绿FM、LysoTracker绿DND-26、CBQCA、PA-GFP(活化后)、WEGFP(活化后)、F1ASH-CCXXCC、单体阿兹米绿、阿兹米绿、绿色荧光蛋白(GFP)、EGFP(坎培尔提森(Campbell Tsien 2003))、EGFP(帕特森2001)、枫绿、7-苯甲基氨基-4-硝基苯基-2-氧杂-1,3-二唑、Bexl、多柔比星、荧光绿和SuperGlo GFP。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述荧光团选自BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPYTMR、BODIPY TR、BODIPY 493/503、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650和BODIPY 650/665。
9.根据权利要求3所述的方法，其中T1-Rt是
10.根据权利要求3所述的方法，其中所述探针是：
11.根据权利要求1或2所述的方法，其中确定靶标占用率的步骤包括基于在所述样品中检测到的探针结合的激酶的量来确定未被所述BTK激酶抑制剂占据的结合位点的数量。
12.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括基于所述BTK激酶的所述靶标占用率来确定或修改治疗方案。
13.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括在所述疗法的过程中的两个或更多个时间点处执行所述方法的步骤。
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