CN107206128B

CN107206128B - 淬灭涂料

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Publication number: CN107206128B
Application number: CN201580061496.6A
Authority: CN
Inventors: 朱尔津·咖泽恩丹
Original assignee: Oriquino G Co ltd
Current assignee: Oriquino G Co ltd
Priority date: 2014-11-13
Filing date: 2015-11-05
Publication date: 2021-05-25
Anticipated expiration: 2035-11-05
Also published as: US20200237966A1; ES2711790T3; BR112017009948A2; JP6673597B2; JP2018501830A; US20180055974A1; NL2013786B1; EP3218024A2; BR112017009948B1; CA2965812A1; EP3218024B1; CN107206128A; WO2016076707A3; AU2015347424A1; US10668186B2; MY183598A; WO2016076707A2

Abstract

本公开描述了包含一种或多种聚合物和与所述一种或多种聚合物中的至少一种共价连接的肽的物体表面涂料，所述肽包含a)第一切割位点，其中所述第一切割位点由属于由有限数量的微生物菌株、种或属组成的第一组的微生物特异性提供的第一化合物切割，并且不被由不属于所述第一组的任何微生物提供的任何化合物切割，b)具有650‑900nm发射波长的第一荧光剂，c)具有650‑900nm吸收波长的第一非荧光剂，其用于淬灭所述第一荧光剂的发射，其中所述第一切割位点的切割导致所述第一非荧光剂从所述涂料的释放，所述第一非荧光剂的释放指示属于所述第一组的微生物的存在。

Description

淬灭涂料

描述

本发明涉及物体表面涂料，制备物体表面涂料的方法以及物体表面涂料在微生物检测中的用途。

表面(例如医疗装置和食物制备表面)上的病原微生物的生长导致感染的发展。当前，无法在医疗装置和食物制备表面上廉价快速地检测到病原微生物的存在。用于检测表面上微生物存在的当前标准是通过从怀疑被污染的样品中获取的微生物培养物。在收集用于培养的样品之前，需要移除植入式医疗装置。此类测试的缺点是它们是耗时的、昂贵的且劳动密集的，并且需要移除植入物。

克服此类针对医疗装置的问题的尝试在现有技术中是已知的。例如US6306422描述了涂覆有水凝胶基质的植入物，其包含嵌入的由于环境变化而产生的可释放活性剂(如治疗剂和/或诊断剂)。通过植入物位置处的宿主的pH变化，释放嵌入的活性剂。

此类植入物的缺点是植入物对特定病原微生物没有响应，并且因此由于纯粹的环境而非微生物原因引起的假阳性是可能的。

用于检测微生物的物体表面涂料在现有技术中是已知的。WO2014098603描述了在特定病原微生物存在下，从物体表面涂料释放治疗剂和/或诊断剂。此类涂料的缺点是荧光剂被释放到基质或周围区域中。因此，释放的荧光剂的检测取决于离开表面涂料的扩散。在慢扩散的情况下，可能会导致假阴性。

本发明的目的是解决现有技术中的物体表面涂料的问题。

本发明提供了包含一种或多种聚合物和与所述一种或多种聚合物中的至少一种共价连接的肽的物体表面涂料，所述肽包含：

a)第一切割位点，其中所述第一切割位点由属于由有限数量的微生物菌株、种或属组成的第一组的微生物特异性提供的第一化合物切割，并且不被由不属于所述第一组的任何微生物提供的任何化合物切割，

b)具有650-900nm发射波长的第一荧光剂，

c)具有650-900nm吸收波长的第一非荧光剂，其用于淬灭所述第一荧光剂的发射，

其中所述第一切割位点的切割导致第一淬灭剂从所述涂料释放，所述第一淬灭剂的释放指示属于所述第一组的微生物的存在。

本发明提供物体表面涂料，其包含：

a)一种或多种聚合物，

b)具有650-900nm发射波长的第一荧光剂，

d)与所述一种或多种聚合物中的至少一种共价连接的肽，所述肽包含具有650-900nm吸收波长的用于淬灭所述第一荧光剂的发射的第一非荧光剂和第一切割位点，

其中所述第一切割位点由属于由有限数量的微生物菌株、种或属组成的第一组的微生物特异性提供的第一化合物切割，并且不被由不属于所述第一组的任何微生物提供的任何化合物切割，

其中所述第一切割位点的切割导致所述第一非荧光剂从所述涂料释放，所述第一非荧光剂的释放指示属于所述第一组的微生物的存在。

本发明提供了物体表面涂料，其中第一切割位点的切割同时导致第一非淬灭剂从物体表面涂料的切割，从而可以检测到第一荧光剂的发射。

在优选的实施方案中，第一切割位点的切割不会导致第一荧光剂从物体表面涂料的释放。换句话说，在切割第一切割位点之后，第一荧光剂保持共价结合到物体表面涂料。

仅从物体表面涂料释放第一非荧光剂的作用是，物体表面涂料将其状态从“暗”态(即不发射波长650-900nm的光)改变到“亮”态(即发射波长650-900nm的光)，发射光可以通过合适的检测器进行记录。此种从“暗(关)”态到“亮(开)”态的改变的优点是减少了假阳性的可能性。

例如，在不包含根据本发明的非荧光部分的现有技术的涂料中，物体表面涂料在不存在微生物时发光，但是在微生物存在时，荧光剂从涂料中释放出来并且涂料变成不发光的暗态。然而，在这种情况下，如果第一荧光剂没有扩散离开涂料，则物体表面涂料仍然可以发光，因此将观察到错误的结果。在根据本发明的涂料中，减少了此类假阳性的可能性，因为一旦发生切割，第一荧光剂和第一非荧光剂之间的距离增加，使得发射不再淬灭。

不希望受理论束缚，从物体表面涂料释放第一非荧光剂意味着第一荧光剂发射的光的淬灭不依赖于如在现有技术的涂料中的第一荧光剂离开物体表面涂料的扩散。

这种切割受由属于由有限数量的微生物菌株、种或属组成的组的微生物提供的化合物的影响。这组(容易指示为第一组)微生物菌株、种或属的成员能够特异性提供切割所述第一切割位点的化合物。术语“特异性地”意指与所述第一组的成员相反，不属于所述第一组的微生物菌株、种或属不能提供能识别和切割所述切割位点的化合物。可以例如通过从微生物中释放所述化合物，或可以例如被呈现在微生物的外表面上来提供化合物。在后一种情况下，在微生物与涂料接触时将实现切割，然而当化合物从微生物释放时，微生物可以在涂覆物体的一定距离处，只要从微生物释放后，释放的化合物能够到达涂料。

微生物也可能属于某一组，其在感染宿主后诱导宿主释放或产生特定化合物。在后一种情况下，这种化合物不由感染不属于所述组的另一种微生物后的宿主产生或释放。切割可以通过化合物实现，或可以例如通过结合所述化合物形成复合物诱导，所述复合物被存在于涂料环境中的切割因子识别，即由微生物或由微生物感染并包含物体的宿主提供的切割因子。对于属于某一组的微生物，如第一组菌株、种或属，这些微生物的存在必须诱导切割位点的切割，而切割不是由来自另一组的微生物诱导的。这种切割可以由相同的化合物发生，但也可以由多种不同的化合物发生，只要这些化合物诱导相同切割位点的切割即可。例如，第一组包含三种不同的细菌种类，第一种类和第二种类提供切割涂料的切割位点的相同化合物，第三种类提供与来自第一种类和第二种类的化合物不同的但也特异性切割涂料中的相同切割位点的化合物。术语“有限的”意味着这样的组不包括所有的微生物或所有的细菌，而是较少的，即有限的数量，因此第一剂的释放确实指示一种或多种微生物，但不是全部或任何微生物或细菌等。

在一实施方案中，第一荧光剂具有300-450nm的发射波长，优选地为450-650nm，甚至更优选地为650-900nm。

具有650-900nm发射波长的第一荧光剂可以是发射650-900nm所需波长的光并且与第一非荧光剂具有光谱重叠的任何化合物，使得当第一荧光剂和第一非荧光剂都存在于物体表面涂料中的未切割肽上时，不发光。

在一实施方案中，具有450-650nm发射波长的第一荧光剂可以是发射450-650nm所需波长的光并且与第一非荧光剂具有光谱重叠的任何化合物，使得当第一荧光剂和第一非荧光剂都存在于物体表面涂料中的未切割的肽上时，不发光。

在另一实施方案中，具有300-350nm发射波长的第一荧光剂可以是发射300-350nm所需波长的光并且与第一非荧光剂具有光谱重叠的任何化合物，使得当第一荧光剂和第一非荧光剂都存在于物体表面涂料中的未切割的肽上时，不发光。

具有650-900nm吸收波长的第一非荧光剂是具有很少或没有固有荧光的化合物，并且其可以有效地淬灭来自最近的NIR荧光团的荧光，而需要很少的背景。在一实施方案中，第一非荧光染料是花青分子。花青分子，也被称为花青染料，包括具有通过聚甲炔链连接的两个取代或未取代的含氮杂环的化合物(式I)：

在一实施方案中，第一荧光剂是具有式I所示通式的花青染料，其中R¹选自H、烃基、卤素、羧基、氨基和SO3^-Cat⁺，其中Cat⁺是阳离子，优选碱土金属，优选钠、钾或锂；Z选自H、O、S、NH和N-烃基；R²、R³、R⁹、R¹⁰各自独立地选自H和烃基，R⁴、R⁵、R¹¹、R¹²各自独立地选自H、烃基和磺酸基，或与它们键合的原子一起形成芳香环；R⁶、R⁷、R¹³、R¹⁴各自独立地选自H和烃基，或与它们键合的原子一起形成芳香环；R⁸和R¹⁵各自独立地选自烃基、(CH₂)_qFG或(CH₂)_pLN，其中R⁸和R¹⁵中的至少一个是(CH₂)_qFG，其中q是1至20的整数，并且FG是不直接与羧基、羟基、氨基或硫醇基反应的官能团，其中p是1至20的整数，并且LN是与羧基、羟基、氨基或硫醇基反应的连接基团；R¹⁵是H或烃基。

第一非荧光剂也可以是例如BHQ3、(Biosearch)QC-1(Li-COR.com)或包含此类化合物的颗粒(例如金纳米颗粒和铁纳米颗粒)。

在一实施方案中，一种或多种聚合物选自聚乙二醇、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚交酯、聚乙烯醇、聚DL-丙交酯-共-乙交酯/聚乙二醇共聚物及其组合。

已经发现，由于聚乙二醇类聚合物的生物相容性质，用于物体表面涂料的有利聚合物是聚乙二醇类聚合物。

在一实施方案中，由C4-C30烃基接头通过N末端或C末端或侧链，优选地通过C末端或侧链，最优选地通过C末端将肽与所述一种或多种聚合物中的至少一种共价连接。

本说明书中所用的术语烃基意指含有氢和碳原子的接头；它是直链、支链或环状的，饱和或不饱和的，如烷基、烯基和炔基；脂环族取代基，如环烷基、环烯基；芳香性的。它可以被一个或多个非烃基取代基(例如杂原子)取代。优选的接头选自4个、5个、6个和7个碳原子。

本发明人已经发现，通过C末端将肽共价连接到物体表面涂料的一种或多种聚合物，切割位点以有助于微生物切割的取向呈现。

在一实施方案中，根据前述权利要求中任一项所述的物体表面涂料，其中C4-C30接头包含环状烃基基团或环状杂环基团，优选地所述杂环基团为三唑基。

在本发明的一实施方案中，可以通过肽的N末端或C末端或侧链上的反应性基团与聚合物上的互补反应性基团的反应来安装接头。特别优选的反应性基团是叠氮基，并且优选的互补反应性基团是炔基。叠氮化物和炔的反应在第一荧光剂和第一非荧光剂的存在下进行而不发生不需要的副反应。

其他实例包括各种Pd(0)-催化的偶联反应、施陶丁格连接、环加成反应(狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)，1,3-偶极环加成)、还原烷基化、肟和肼形成、硫醇加成反应和氧化偶联。

在一实施方案中，第一切割位点由革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌，优选革兰氏阳性细菌，更优选来自葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)和芽孢杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、梭菌属(Clostridium)、放线菌(Actinobacteria)和李斯特菌属(Listeria)提供的化合物切割。

根据本发明的物体表面涂料的优点是可以以使得涂料仅对某一组微生物有响应的方式设计涂料。例如，在优选的实施方案中，第一切割位点由革兰氏阳性细菌(例如葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属和芽孢杆菌属、棒状杆菌属、诺卡氏菌属、梭菌属、放线菌属和李斯特菌属)提供的化合物切割。在特别优选的实施方案中，革兰氏阳性细菌选自葡萄球菌属、链球菌属，更优选地选自葡萄球菌属。

在一实施方案中，第一切割位点由革兰氏阴性细菌(如大肠杆菌(Escherichiacoli)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)和空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni))提供的化合物切割。

在一实施方案中，第一化合物是选自来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)V8的胞内蛋白酶Glu-C、IgA1蛋白酶、溶金菌素(aureolysin)的蛋白酶。

对革兰氏阳性细菌为特异的化合物的实例是来自金黄色葡萄球菌的V8蛋白酶，也称为胞内蛋白酶Glu-C、Glu-C蛋白酶、葡萄球菌丝氨酸蛋白酶、葡萄球菌V8丝氨酸内肽酶。该蛋白酶在天冬氨酸残基和谷氨酸残基的羧基侧特异性切割。

在一实施方案中，第一切割位点包含特异性氨基酸基序，所述氨基酸基序优选地选自EFRIV、EFRIK、DFRIK、GIGEFRIK、GIGDFRIK。

在优选的实施方案中，切割位点包含选自以下的氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸，优选天冬氨酸和谷氨酸，切割包含在来自选自以下至少一种细菌的化合物中：葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属和芽孢杆菌属、棒状杆菌属、诺卡氏菌属、梭菌属、放线菌属和李斯特菌属。

在优选的实施方案中，切割位点包含选自丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和脯氨酸的氨基酸，切割包含在来自选自以下至少一种细菌的化合物中：大肠杆菌、弗式志贺氏菌和空肠弯曲菌。

因此，切割位点被理解为具有其众所周知的含义，即物体表面涂料的分子结构的一部分，其被特定化合物切割，由此切割位点包含一个或多个酰胺键。

切割位点可以具有结构XYZ，其中X是至少一个氨基酸，Y是由代表第一切割位点的至少两个氨基酸组成的分子结构的一部分，和Z是至少一个氨基酸。使用的氨基酸可以是任何氨基酸，优选地选自天然存在的氨基酸的组或选自合成氨基酸的组，特别是天然氨基酸的衍生物。氨基酸优选为能够结合实现第一切割位点切割的化合物的那些氨基酸。

在一实施方案中，第一切割位点包含是微生物(如革兰氏阳性细菌，例如葡萄球菌、链球菌、肠球菌和芽孢杆菌、棒状杆菌、诺卡氏菌、梭菌、放线菌和李斯特菌)分泌的蛋白酶的底物和/或结合位点的氨基酸。在特别优选的实施方案中，革兰氏阳性细菌选自葡萄球菌属、链球菌属，更优地选自葡萄球菌属。

在一实施方案中，第一切割位点包含是微生物(如革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌、弗式志贺氏菌和空肠弯曲菌)分泌的蛋白酶的底物和/或结合位点的氨基酸。

切割位点所在的肽可以包含例如4至14个氨基酸，例如5至12个氨基酸，例如6至11个氨基酸，例如7至10个氨基酸和例如8至9个氨基酸。优选地，肽包含6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸或10个氨基酸。

如标准手册生物化学，Ed.L Stryer，第7版，2012，WH Freeman，第一部分第2章蛋白质的组成和结构(Biochemistry,Ed.L Stryer,7^th Edition,2012,WH Freeman,Part 1,Chapter 2Protein Composition and Structure)中所述，切割位点优选地包含若干个氨基酸，例如至少两个氨基酸，优选地至少三个氨基酸，更优选地至少四个氨基酸，甚至更优选地至少五个氨基酸。切割位点的分子结构部分也可以称为“氨基酸基序”。在本发明中，切割位点被设计成使得其由属于由有限数量的微生物菌株、种或属组成的组的微生物提供的化合物识别。

在优选的实施方案中，第一荧光剂是式II的化合物：

其中Z是O，其中R¹是SO3^-Na⁺；R²、R³、R⁹、R¹⁰是烃基，R⁴和R¹¹是H，R⁵和R¹²是磺酸基，R⁶、R⁷、R¹³、R¹⁴是H，R⁸是(CH₃)_qSO₃ ^-和R¹⁵是(CH₂)₅-H-羟基琥珀酰亚胺酯，第一荧光剂是6-(2-{(E)-2-[(3E)-3-{(2E-2-[3,3-二甲基-5-磺酸基-1-(4-磺酸基丁基)-1,3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]亚乙基}-2-(4-磺酸基苯氧基)-1-环己烯-1-基]乙烯基}-3,3-二甲基-5-磺酸基-3H-吲哚鎓(indolium)-1-基)己酸四钠及其衍生物。

在一实施方案中，6-(2-{(E)-2-[(3E)-3-{(2E-2-[3,3-二甲基-5-磺酸基-1-(4-磺酸基丁基)-1,3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]亚乙基}-2-(4-磺酸基苯氧基)-1-环己烯-1-基]乙烯基}-3,3-二甲基-5-磺酸基-3H-吲哚鎓-1-基)己酸四钠的衍生物是酰胺、羧酸或马来酰亚胺。

在一实施方案中，第一荧光剂(例如花青染料)和/或第一非荧光剂通过酰胺键、酯或迈克尔加成反应产物连接(Michael addition product linkage)与肽连接。

在一实施方案中，第一荧光剂是根据式III的化合物：

其中R²³和R²⁵各自独立地为H或烃基，R²⁴和R²⁶各自独立地选自H、烃基和(CH₂)_qFG，其中q是1至20的整数，并且FG是不直接与羧基、羟基、氨基或硫醇基反应的官能团；R²⁷是各自独立地选自H、烃基和芳基，其中芳基被氯、卤素或酰基任选取代。

可以在本发明中使用的合适的第一荧光剂的实例包括但不限于Alexa

350、Alexa

430、Alexa

488、Alexa

555、Alexa

594、Alexa

647、Alexa

660、Alexa

680、Alexa

700、Alexa

750、ATTO 680、ATTO 700、DY-647、DY-650、DY-673、DY-675、DY-676、DY-680、DY-681、DY-682、DY-690、DY-700、DY-701、DY-730、DY-731、DY-732、DY-734、DY-750、DY-751、DY-752、DY-776、DY-781、DY-782、DY-831、La Jolla Blue、Cy5、Cy5.5、Cy7、

800CW、

38、

800RS、

700DX、

680等等。“Alexa Fluor”染料可从MolecularProbes Inc.，Eugene，OR，U.S.A(www.probes.com)获得。“ATTO”染料可从ATTO-tec GmbH,Siegen,Germany(www.atto-tec.com)获得。“DY”染料可从Dyomics GmbH，Jena，Germany(www.dyomics.com)获得。La Jolla Blue可从Hyperion Inc.获得。“Cy”染料可从AmershamBiosciences，Piscataway，NJ，U.S.A，(www.amersham.com)获得。“

红外线染料”可从

Bioscience,Inc.,Lincoln,NE,U.S.A(www.licor.com)获得。

在一实施方案中，第一非荧光剂是具有650-900nm吸收波长的花青染料。花青染料在近红外波长中的优点是近红外检测降低了被测量样品中其他化合物引起的背景、散射和干扰，提高了本发明方法在离体系统和体内系统中的可靠性。此外，此类波长能够穿透组织，使得此类染料特别适用于体内应用。

在优选的实施方案中，非荧光剂是二乙氨基-5-苯基吩嗪-7-重氮苯-4"-(N-乙基-2-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基))-N-乙基-2-O(BHQ3)(Biosearch)、QC-1、

800RS(Li-COR.com)、金纳米颗粒和铁纳米颗粒。

在一实施方案中，第一非荧光剂是式IV的化合物：

其中Z是O，其中R¹是SO3^-Na⁺；R²、R³、R⁹、R¹⁰是烃基，R⁴和R¹¹是，R⁵和R¹²是H，R⁶、R⁷、R¹³、R¹⁴是H，R⁸是(CH₃)_qSO₃ ^-和R¹⁵是(CH₂)₅-H-羟基琥珀酰亚胺酯。

在优选的实施方案中，当第一荧光剂与第一非荧光剂相同时，所述第一荧光剂是根据式IV的化合物

800RS。在该实施方案中，

800RS具有在涂料中自淬灭发射光的性质。当从涂料中去除一部分

800RS时，

800RS分子之间的距离会增加，从而发生较低程度的自淬灭，因此从涂料发出光。

可选择地，第一非荧光剂是式V的化合物：

其中X选自H、氯、氟、溴、O-芳基，其中芳基被选自磺酸基、卤素、羟基和胺的基团对位取代；R²、R³、R⁹、R¹⁰各自独立地为H或烃基，R⁴、R⁵、R¹¹、R¹²各自独立地选自H、烃基、磺酸基和N-烃基或与它们所键合的原子一起形成芳香环；R⁶、R⁷、R¹³、R¹⁴各自独立地选自H、磺酸基烃基或与它们所键合的原子一起形成芳香环；R⁸和R¹⁵各自独立地为烃基、(CH₂)_qFG或(CH₂)_PLN，其中R⁸和R¹⁵中的至少一个是(CH₂)_qFG，其中q是1至20的整数，并且FG是不直接与羧基、羟基、氨基或硫醇基反应的官能团，其中p是1至20的整数，并且LN是与羧基、羟基、氨基或硫醇基反应的连接基团；R¹⁵是H或烃基。

优选地，式V化合物是如下化合物，其中X是氯；R²、R³、R⁹、R¹⁰是烃基，R⁴、R⁶、R⁷、R¹¹、R¹²、R¹⁴是H，R⁵是N-烃基；R¹³是磺酸基，R⁸是(CH₃)_qSO₃ ^-和R¹⁵是(CH₂)₅-H-羟基琥珀酰亚胺酯，所述第一非荧光剂是4-((E)-6-((E)-2-[3,3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)-吲哚啉-2-亚基]亚乙基}-2-((E)-2-(1-6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-6-氧基己基)-3,3-二甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基)环己-1-烯基氧基)苯磺酸钠。

在另一实施方案中，第一非荧光剂是根据式VI的化合物：

其中R¹⁷、R¹⁸、R¹⁹和R²⁰各自独立地为烃基或取代的烃基，其中烃基被羟基、卤素、磷基或磺酸基取代。

在另一实施方案中，第一非荧光剂是根据式VII的化合物：

其中R¹⁷、R¹⁸和R¹⁹各自独立地为烃基或取代的烃基，其中烃基被羟基、卤素、磷基或磺酸基取代；R²⁰和R²¹是H、烃基、烷氧基或卤素基团。

在一实施方案中，第一非荧光剂具有300-450nm的吸收波长，优选地450-650nm的吸收波长，甚至更优选地650-90 0nm的吸收波长。选择第一非荧光剂以便获得与第一荧光剂良好的光谱重叠，使得当所述第一非荧光剂和所述第一荧光剂非常接近时，所述第一荧光剂发射的信号被淬灭。

在第二方面，本发明提供了制备前述权利要求中任一项所述的物体表面涂料的方法，其包括以下步骤：

a)提供包含第一荧光剂、第一非荧光剂、第一切割位点和活性炔的肽，

b)使步骤a)中获得的肽与包含叠氮基的C5-C25二丙烯酸酯接触，

c)将步骤b)中获得的肽-二丙烯酸酯缀合物与一种或多种聚合物交联。

本发明人已经发现，将在二丙烯酸酯改性肽上的第一荧光剂和第一非荧光剂掺入涂料中，物体表面涂料的合成比现有技术方法中的更有效。在现有技术中，已知将荧光标记的聚合物混合，然后将混合的聚合物交联。在根据本发明的方法中，不需要直接标记聚合物。这导致了比现有技术具有更高原子效率和时间效率的合成。

在第三方面，提供了包含根据本发明的物体表面涂料的物体，所述物体选自医疗植入物、医疗器械、医用拭子、微孔板、食物制备表面、家具。

本发明的物体表面涂料适用于宽范围的基底。本发明的优点在于其可以用于检测医疗植入物、医疗器械和家具上的细菌感染的存在。合适的家具是例如医院用床、医院桌子操作台，其表面需要保持清洁，并且如果存在致病菌，则可快速检测到。

在一实施方案中，物体选自针、导管、导丝、螺钉、植入板和植入针。

本发明的物体表面涂料特别适用于要植入体内的物体。通过使用涂覆有本发明涂料的植入物，可以容易地检测细菌感染，并且因此医师可以容易地决定下一疗程。

在第四方面，提供了涂覆物体的方法，其包括以下步骤：

a)提供根据本发明的物体表面涂料，

b)浸涂选自医疗植入物和医疗器械的物体以使其涂覆有来自步骤a)的所述表面涂料，

c)干燥步骤b)中获得的所述物体。

可以使用诸如浸涂、喷涂、旋涂或溶剂浇铸的技术用聚合物涂料涂覆根据本发明的物体。涉及将分子化学接枝到生物材料表面上的涂覆技术也是可用的。基于自组装单分子层(SAM)、表面束缚的聚合物(聚合物刷)的纳米薄涂料或基于逐层组装的多层涂料提供精确控制涂料表面上化学基团和生物分子的位置和取向，是本领域众所周知的，由于各种原因将各种涂料施加到矫形部件和其他医疗装置，参见Handbook of Materials forMedical Devices,Davis,J.R.(Ed.),Chapter 9,"Coatings"2003。

在第五方面，提供涂覆物体的方法，其包括以下步骤：

a)提供根据本发明的物体表面涂料，和

b)使选自医用拭子、微孔板、食品制备表面、家具的物体与来自步骤a)的表面涂料接触。

在特别优选的实施方案中，物体表面涂料提供在溶剂，例如水溶剂或有机溶剂中，可以将其施加于表面，例如医用拭子、微孔板、食品制备表面、家具。涂料可以通过例如涂装来施加。可选择地，可以在胶带中包含涂料。通过涂装或通过胶带施加涂料的优点是提供了提供具有用于检测病原微生物的表面涂料的物体的简单的和有时间效率的方法。

在第六方面，提供了制备根据本发明的物体表面涂料的方法，其包括以下步骤：

a)提供包含一种或多种聚合物的物体表面，所述一种或多种聚合物包含反应性基团A和

b)使根据步骤a)的物体表面与包含第一荧光剂、第一非荧光剂、第一切割位点和与反应性基团A互补的反应性基团B的肽接触以制备所述物体表面涂料。

发明人已经发现，涂覆有炔基的表面(例如涂覆有炔基PEG聚合物的玻璃表面或微量滴定板)可以与肽反应，所述肽包含叠氮基，所述叠氮基与所述炔基互补。出人意料的是，该方法能够容易地产生肽涂覆的表面，这些表面在细菌存在下释放荧光剂或非荧光剂。

在一实施方案中，所述反应性基团A选自醇(OH)、硫醇(SH)、胺(NH₂)、酸(CO₂H)、炔烃、烯烃、叠氮化物，优选炔烃或叠氮化物，更优选炔烃。

在一实施方案中，所述反应性基团B选自醇(OH)、硫醇(SH)、胺(NH₂)、酸(CO₂H)、炔烃、烯烃、叠氮化物，优选炔烃或叠氮化物，更优选叠氮化物。

在一实施方案中，反应性基团A和反应性基团B的反应的产物是选自酯、酰胺、氨基甲酸酯、硫酯、马来酰亚胺和迈克尔加成反应产物连接的组。

在一实施方案中，包含第一切割位点以及第一荧光剂和第一非荧光剂的肽还包含反应性基团A。所述反应性基团A选自醇、硫醇、胺、羧酸、叠氮化物或不饱和烃基(例如炔烃或烯烃)。使所述肽与包含与反应性基团A互补的反应性基团B的物体表面涂料接触。反应性基团B选自醇、硫醇、胺、羧酸、叠氮化物和/或不饱和烃基(例如炔烃或烯烃)。优选地，肽包含叠氮化物，并且物体表面包含炔烃。反应性基团B可以与物体表面的一种或多种聚合物共价结合。在本发明中，聚合物可以是有机或无机的。有机聚合物的合适实例是聚乙二醇、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚交酯、聚乙烯醇、聚DL-丙交酯-共-乙交酯/聚乙二醇共聚物及其组合。无机聚合物的合适实例是二氧化硅聚合物，例如硅氧烷，例如具有(-O-SiR₂-O)_n重复单元的硅氧烷，其中R是烃基链，优选C1-C20烃基。

在一实施方案中，所述物体表面进行预处理。所述预处理可以是机械的或化学的。所述预处理改善了表面形态，例如金属或塑料表面的粗糙度、质地和孔隙率以改善聚合物涂料的粘结。

在一实施方案中，提供了检测来自根据本发明的物体的光子发射的方法，其包括用具有650-900nm波长的光子辐射所述物体并检测发射光子的步骤。

当用具有650-900nm波长的光照射物体表面涂料并且病原微生物存在时，这些微生物释放针对物体表面涂料中切割位点特异的化合物，合适的检测器将检测来自涂料的光子。此类方法提供了容易的方法来确定病原微生物的存在。本发明的方法优于现有技术的方法，因为为了确认例如感染的存在，劳动密集型的、昂贵的和耗时的微生物培养是没有必要的。

在一实施方案中，提供了检测来自涂覆有根据本发明的物体表面涂料的容器的光子发射的方法，其包括使所述容器与体液样品接触，并检测发射光子的步骤。

当使物体表面涂料与体液，例如通常为唾液、尿液或细胞外液接触，随后用具有650-900nm波长的光照射，并且病原微生物存在时，这些微生物释放针对物体表面涂料中切割位点特异的化合物，合适的检测器将检测来自涂料的光子。此类方法提供了容易的方法来确定获取体液的个体中病原微生物的存在。本发明的方法优于现有技术的方法，因为为了确认例如感染的存在，劳动密集型的、昂贵的和耗时的微生物培养是没有必要的。

另一方面，提供了根据本发明的物体在检测感染性细菌存在中的用途。

本发明的方法优于现有技术的方法，因为为了确认例如感染的存在，劳动密集型的、昂贵的和耗时的微生物培养是没有必要的。

实施例

与现有技术相比，以下非限制性实施例显示了本发明的具体实施方案。

肽合成

从Cambridge Research Biochemicals(UK)获得肽1和肽2，并且不经进一步纯化使用。

肽1：Ac-X-[K(IRDye800RS)]-GLLEFRIVAK(IRDye800RS)-酰胺，其中X是δ-叠氮基-正缬氨酸

肽2：Ac-X-GLLEFRIVAC(IRDye800CW)酰胺，其中X是δ-叠氮基-L-正缬氨酸，也称为(S)-5-叠氮基-2-(Fmoc-氨基)戊酸)。

V8蛋白酶

从Sigma-Aldrich获得细菌蛋白酶(来自金黄色葡萄球菌V8的胞内蛋白酶Glu-C，P2922 SIGMA)，在本文中也称为“蛋白酶V8”或“V8”。

颗粒酶B蛋白酶

从MerckMillepore获得人重组蛋白酶(368043颗粒酶B，人类，重组，大肠杆菌)。

炔烃官能化载玻片

从Microsurfaces，Inc.获得炔烃官能化玻璃制的显微镜载片(1013-1014个炔基/cm²，75mm×25mm)，并通过金刚石玻璃刀将其切割成一定尺寸。将载片储存在-20℃下于黑暗中的密封袋中。在实验中，将载片保存在黑暗中的经P₂O₅的干燥器中。

实施例1

将肽附着在载玻片上

将肽1和肽2附着在玻璃表面。

阴性对照实验，无CuSQ₄(无共价缀合可能)

将10μL肽1的肽储备液(10mg/mL；在DMSO中)与26.5μL抗坏血酸钠溶液(1mg/mL；在DMSO/水1/1中)混合，并加入13.5μLDMSO以增加肽的溶解度。DMSO/水的最终比例为73:27。最终的肽浓度为0.65mM，最终的抗坏血酸钠浓度为2.7mM。

肽1；与CuSO₄缀合

将10μL肽3的肽储备液(10mg/mL；在DMSO中)与12.5μL CuSO₄溶液(1mg/mL；在DMSO/水1/1中)和14μL抗坏血酸钠溶液(1mg/mL；在DMSO/水1/1中)混合，并加入13.5μLDMSO以增加肽的溶解度。DMSO/水的最终比例为73:27。最终的肽浓度为0.65mM，最终的CuSO₄浓度为1mM，最终的抗坏血酸钠浓度为1.4mM。

将所得溶液(50μL)移液到载玻片上，并将载玻片保持在湿润环境中1小时。通过用1mL DMSO：H₂O 80/20漂洗3次洗掉液滴；其后将载玻片置于DMSO:H₂O 80/20的洗涤溶液中，并轻轻摇动1分钟。用水(5×1mL)漂洗洗涤溶液，并用氮气流干燥载玻片。

使用UV-VIS光谱表征载玻片，其中仅用肽和CuSO₄处理的载玻片在600-800nm的预期波长范围内显示出通常0.01-0.05的残余吸收最大值。

实施例2

通过发光光谱法监测肽1的消化

通过发光光谱法在溶液中监测V8蛋白酶和颗粒酶B蛋白酶存在下肽1的切割。在Perkin-Elmer发光光谱仪LS50B上测量光致发光光谱。使用720nm的激发波长并且施加15nm的狭缝宽度，从250-900nm记录光谱。

在玻璃小瓶中进行溶液中的消化。将100μL肽1的储备液(10mg/mL)用625μL H₂O和250μL 100mM磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.8)稀释。在t＝0时取10μl样品。然后，加入50μL V8蛋白酶或颗粒酶B蛋白酶储备液(25个单位，±25μg)，摇动混合物并室温保存。在实验期间，孵育溶液保持清澈(染色肽没有沉淀)。在不同时间点(30秒、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟和180分钟，并在18H)取10μL孵育样品并用3mL水稀释。通过发光光谱法测量制备的稀释样品以监测肽1的消化切割。使用具有水和与样品溶液相同量的DMSO的比色皿作为空白。

在没有V8蛋白酶的情况下，观察到约1AU的背景荧光。在加入V8蛋白酶30秒后，荧光强度增加到4AU，并在6分钟内荧光强度为6AU。这显示根据本发明的肽能够在几分钟内检测细菌，这是相对于现有技术方法(如针对有机材料(通常为4-8小时)或细菌培养物(24小时)的基于ATP的测试)相当大的改进。

在颗粒酶B的存在下，肽1不被切割，并且在整个实验中维持1AU的背景荧光。颗粒酶B是以20-4-pg/ml的正常浓度存在于血浆中的丝氨酸蛋白酶。结果显示，肽对于存在的细菌蛋白酶是选择性的，并且在人体释放的蛋白酶存在下不被切割，作为自身免疫应答的一部分。

实施例3

通过发光光谱法监测表面结合的肽1的消化

在Westburg(Leusden，NL；Timo Kreike，Moniek Kors)现场使用Li-Cor OdysseyCLX设备。所有Odyssey CLX测量都是通过在800nm激发下进行的。

在V8蛋白酶存在下，强度从大约6000个单位增加到25000个单位，表明V8引发来自肽1的淬灭基团的释放。

在V8蛋白酶存在下，对于肽2，没有观察到强度变化。观察到的强度保持在8000个单位，表明尽管荧光基团可能被切割，但荧光基团没有扩散离开表面，因此观察不到信号降低，从而获得假阴性结果。

结果显示根据本发明的涂料能够检测细菌的存在并且不容易产生假阴性结果。

实施例4

导管涂料

物体涂料由PEG聚合物(MeO-PEG-炔烃，IRIS biotech)与具有切割位点以及第一荧光剂和第一非荧光剂的肽组成。比较例不包含第一非荧光剂。

使用标准试剂、偶联和纯化技术通过标准固相肽合成(SPPS)合成肽。

肽与第一荧光剂和第一非荧光剂的偶联在肽纯化之后进行，并通过马来酰亚胺偶联至半胱氨酸或酰胺偶联至赖氨酸促进。

使用标准叠氮化物炔烃Huisgen环加成反应条件进行具有切割位点以及第一荧光试剂和第一非荧光试剂的肽的偶联。

使用的导管是14F硅胶弗利导管(Foley Catheter)，其以6mm的长度提供，并具有4.2mm的直径。制备每种聚合物涂料的含水浆液，并将每根导管插入到浆液混合物中。将涂覆的导管在20℃下于黑暗中储存15分钟，然后重复浸渍过程。过程总共重复了四次。在最终涂覆之后，将涂覆的导管在35℃下储存48小时以促进涂料的干燥。

实施例5

将每个涂覆的导管和一个作为对照的未涂覆的导管在2×10⁶个菌落形成单位(CFU)ml^-1的金黄色葡萄球菌存在下孵育4小时。然后从培养箱中取出涂覆的导管，并暴露于使用IVIS光谱(激发：710nm，发射：800nm，采集时间5s，binning 4，F-stop 2，FOV 21.2)的临床多光谱荧光相机(T3-成像系统，SurgOptix BV，Groningen,The Netherlands)。

使用Living Image 4.2(Caliper LS，Hopkinton MA，USA)分析从IVIS光谱和IVISLumina II获得的结果。最佳检测限被设置为最低信号，在该最低信号，阳性信号毫不费力地与阴性对照区别开。通过绘制目标区域(ROI)和测量这些区域的平均计数来确定信号强度。通过从目标信号中减去背景信号来校正背景信号，在文中称为净计数。强近红外信号归因于第一荧光剂。

结果如表1所示。

表1

其中Pol是MeO-PEG-炔烃，以及X是(S)-5-叠氮基-2-(Fmoc-氨基)戊酸

结果显示根据本发明的包含具有与第一荧光剂的发射光谱重叠的吸收光谱的非荧光剂的涂料(实施例5.4)导致非常好地检测病原微生物例如在这种情况中金黄色葡萄球菌的存在。通过第一非荧光剂的淬灭严格地依赖于距离第一荧光剂的距离，因此一旦第一非荧光剂被切割，检测到发射光。

实施例5.4还显示使用根据本发明的涂料可以获得与通过常规微生物培养物(实施例5.1)相同的检测水平，但是更快地获得结果，其中在4小时内而不是如同利用微生物培养物的24-36小时获得结果。

实施例5.3显示也起到第一非荧光剂作用的第一荧光剂也提供了检测微生物的合适方法。然而，由于切割的第一荧光剂的有限的扩散，仅检测到弱信号。

仅包含第一荧光剂的涂料不能提供良好的微生物检测(比较例5.2)。这归因于第一荧光剂离开表面的慢扩散速率，因此仅检测到发射光中小的强度变化。

序列表

<110> 奥里基诺G有限公司

<120> 淬灭涂料

<130> 62497PC

<150> NL2013786

<151> 2014-11-13

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 1

Glu Phe Arg Ile Lys

1 5

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 2

Asp Phe Arg Ile Lys

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 3

Gly Ile Gly Glu Phe Arg Ile Lys

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 4

Gly Ile Gly Asp Phe Arg Ile Lys

1 5

Claims

1.物体表面涂料，其包含一种或多种聚合物和与所述一种或多种聚合物中的至少一种共价连接的肽，所述肽包含：

b)具有650-900nm发射波长的第一荧光剂，

其中所述第一切割位点的切割导致所述第一非荧光剂从所述涂料释放，所述第一非荧光剂的释放指示属于所述第一组的微生物的存在，

其中在从所述涂料释放所述第一非荧光剂后，所述第一荧光剂保持共价结合到所述物体表面涂料。

2.如权利要求1所述的物体表面涂料，其中所述一种或多种聚合物选自聚乙二醇、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚交酯、聚乙烯醇、聚DL-丙交酯-共-乙交酯/聚乙二醇共聚物及其组合。

3.如权利要求1所述的物体表面涂料，其中由C₄-C₃₀烃基接头通过N末端或C末端或侧链将所述肽与所述一种或多种聚合物中的至少一种共价连接，其中所述C₄-C₃₀烃基接头包含环状烃基基团或环状杂环基团。

4.如权利要求3所述的物体表面涂料，其中所述杂环基团为三唑基。

5.如权利要求1所述的物体表面涂料，其中由C₄-C₃₀烃基接头通过C末端或侧链将所述肽与所述一种或多种聚合物中的至少一种共价连接，其中所述C₄-C₃₀烃基接头包含环状烃基基团或环状杂环基团。

6.如权利要求5所述的物体表面涂料，其中所述杂环基团为三唑基。

7.如权利要求1所述的物体表面涂料，其中由C₄-C₃₀烃基接头通过侧链将所述肽与所述一种或多种聚合物中的至少一种共价连接，其中所述C₄-C₃₀烃基接头包含环状烃基基团或环状杂环基团。

8.如权利要求7所述的物体表面涂料，其中所述杂环基团为三唑基。

9.如权利要求1-8中任一项所述的物体表面涂料，其中所述第一切割位点由革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌提供的化合物切割。

10.如权利要求1-8中任一项所述的物体表面涂料，其中所述第一切割位点由选自葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)和芽孢杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、梭菌属(Clostridium)、放线菌属(Actinobacteria)和李斯特菌属(Listeria)的革兰氏阳性细菌提供的化合物切割。

11.如权利要求1-8中任一项所述的物体表面涂料，其中所述第一切割位点由第一化合物切割，所述第一化合物是选自V8蛋白酶、IgA1蛋白酶、溶金菌素的蛋白酶。

12.如权利要求1-8中任一项所述的物体表面涂料，其中所述第一切割位点包含特定氨基酸基序，所述氨基酸基序选自EFRIK(SEQ ID NO：1)、DFRIK(SEQ ID NO：2)、GIGEFRIK(SEQID NO：4)、GIGDFRIK(SEQ ID NO：5)。

13.如权利要求1-8中任一项所述的物体表面涂料，其中所述第一荧光剂是具有650-900nm发射波长的花青，以及其中所述第一非荧光剂是具有650-900nm吸收波长的花青染料。

14.包含权利要求1-13中任一项所述的表面涂料的物体，所述物体是医疗器械。

15.包含权利要求1-13中任一项所述的表面涂料的物体，所述物体是医疗植入物。

16.包含权利要求1-13中任一项所述的表面涂料的物体，所述物体选自医用拭子、微孔板、食物制备表面和家具或所述物体选自针、导管、导丝、螺钉和植入板。

17.包含权利要求1-13中任一项所述的表面涂料的物体，所述物体是植入针。

18.制备权利要求1-13中任一项所述的物体表面涂料的方法，其包括以下步骤：

a)提供包含第一荧光剂、第一非荧光剂、第一切割位点和叠氮基的肽，

b)使步骤a)中获得的所述肽与包含炔烃基团的C5-C25二丙烯酸酯接触，

19.涂覆物体的方法，其包括以下步骤：

a)提供权利要求1-13中任一项所述的物体表面涂料，b)浸涂选自医疗植入物的物体以使其涂覆有来自步骤a)的所述表面涂料，

c)干燥步骤b)中获得的所述物体，或者

a)提供权利要求1-13中任一项所述的物体表面涂料，

b)使选自医用拭子、微孔板、食物制备表面和家具的物体与来自步骤a)的所述表面涂料接触。

20.涂覆物体的方法，其包括以下步骤：

a)提供权利要求1-13中任一项所述的物体表面涂料，

b)浸涂选自医疗器械的物体以使其涂覆有来自步骤a)的所述表面涂料，

c)干燥步骤b)中获得的所述物体，或者

a)提供权利要求1-13中任一项所述的物体表面涂料，

21.制备权利要求1-13中任一项所述的物体表面涂料的方法，其包括以下步骤：

a)提供包含一种或多种聚合物的物体表面，所述一种或多种聚合物还包含反应性基团A，和

b)使根据步骤a)的所述物体表面与包含第一荧光剂、第一非荧光剂、第一切割位点和与反应性基团A互补的反应性基团B的肽接触，使得反应性基团A和反应性基团B形成共价连接以制备所述物体表面涂料，

所述反应性基团A选自醇(OH)、硫醇(SH)、胺(NH₂)、酸(CO₂H)、炔烃、烯烃、叠氮化物，

所述反应性基团B选自醇(OH)、硫醇(SH)、胺(NH₂)、酸(CO₂H)、炔烃、烯烃、叠氮化物。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述反应性基团A选自炔烃或叠氮化物。

23.如权利要求21所述的方法，其中所述反应性基团A是炔烃。

24.如权利要求21所述的方法，其中所述反应性基团B选自炔烃或叠氮化物。

25.如权利要求21所述的方法，其中所述反应性基团B是叠氮化物。

26.检测来自权利要求14-17中任一项所述的物体的光子发射的方法，其包括用具有650-900nm波长的光子辐射所述物体并检测发射光子的步骤。

27.检测来自涂覆有权利要求14-17中任一项所述的表面涂料的物体的光子发射的方法，其包括使所述物体与体液样品接触并检测发射光子的步骤。

28.权利要求14-17中任一项所述的物体在检测感染性细菌存在中的用途。