BR112017009948B1

BR112017009948B1 - Revestimento da superfície de objetos, objeto, método para preparar um revestimento da superfície de objetos, método para revestir um objeto, método para detectar a emissão de fótons a partir de um objeto e uso de um objeto

Info

Publication number: BR112017009948B1
Application number: BR112017009948-9A
Authority: BR
Inventors: Jurjen GAZENDAM
Original assignee: Original G B.V.
Priority date: 2014-11-13
Filing date: 2015-11-05
Publication date: 2021-06-15
Also published as: US20200237966A1; ES2711790T3; BR112017009948A2; JP6673597B2; JP2018501830A; US20180055974A1; NL2013786B1; EP3218024A2; CA2965812A1; EP3218024B1; CN107206128A; CN107206128B; WO2016076707A3; AU2015347424A1; US10668186B2; MY183598A; WO2016076707A2

Abstract

descreve-se um revestimento de superfícies de objetos que compreende um ou mais polímeros e um peptídeo ligado de forma covalente a pelo menos u dos ditos um ou mais polímeros, sendo que o dito peptídeo compreende a) um primeiro local de clivagem, pelo que o dito primeiro local de clivagem é clivado por meio de um primeiro composto proporcionado especificamente por um micróbio pertencente a um primeiro grupo que consiste de um número limitado de cepas, espécies ou gêneros microbianos, e não clivado por qualquer composto proporcionado por qualquer micróbio não pertencente ao dito primeiro grupo, b) um primeiro agente fluorescente que é dotado de um comprimento de onda de emissão de 650-900 nm, c) um primeiro agente não fluorescente que é dotado de um comprimento de onda de absorção de 650-900 nm, para extinção da dita emissão do dito primeiro agente fluorescente, em que a clivagem do dito primeiro local de clivagem resulta no desprendimento do dito primeiro agente não fluorescente a partir do dito revestimento, sendo o desprendimento do dito primeiro agente não fluorescente uma indicação da presença de um micróbio pertencente ao dito primeiro grupo.

Description

Descrição

[001] A presente invenção se refere a um revestimento da superfície de objetos, um método de preparação de um revestimento da superfície de objetos, bem como ao uso de um revestimento da superfície de objetos para a detecção de microrganismos.

[002] O crescimento de microrganismos patogênicos em superfícies, por exemplo, dispositivos médicos e superfícies de preparação de alimentos, conduz ao desenvolvimento de infecções. Atualmente não existem meios para detectar rapidamente a presença de microrganismos patogênicos em dispositivos médicos e superfícies de preparação de alimentos. O padrão atual para detectar a presença de microrganismos nas superfícies é através de uma cultura microbiológica extraída a partir de uma amostra que se suspeita que esteja contaminada. Os dispositivos médicos implantados precisam de ser removidos antes da coleta de uma amostra para cultura. As desvantagens de tais testes consistem no fato de que eles são demorados, onerosos e de trabalho intensivo, e por exigirem a remoção do implante.

[003] São conhecidas na técnica anterior as tentativas para superar tais problemas com respeito a dispositivos médicos. Por exemplo, o documento US 6.306.422 descreve um implante revestido com uma matriz de hidrogel, que compreende agentes ativos suscetíveis de ser desprendidos, embebidos, tais como agentes terapêuticos e / ou de diagnóstico, devido a alterações ambientais. Por meio de uma alteração de pH no hospedeiro no local do implante, os agentes ativos incluídos são desprendidos.

[004] Uma desvantagem de tais implantes é que o implante não é sensível a um micróbio patogênico específico e deste modo falsos positivos são possíveis devido a causas puramente ambientais e não microbianas.

[005] O revestimento da superfície de objetos para a detecção de microorganismos é conhecido na técnica anterior. O documento W02014098603 descreve o desprendimento de agentes terapêuticos e / ou de diagnóstico a partir de um revestimento da superfície de objetos na presença de micróbios patogênicos específicos. Um inconveniente de um revestimento deste tipo é que um agente fluorescente é desprendido na matriz ou área circundante. A detecção do desprendimento do agente fluorescente é, deste modo, dependente da difusão para fora a partir do revestimento de superfície. Nos casos de difusão lenta, pode resultar em um falso negativo.

[006] Constitui um objetivo da presente invenção solucionar os problemas do revestimento da superfície de objetos no campo da técnica.

[007] A presente invenção proporciona um_revestimento da superfície de objetos que compreende um ou mais polímeros e um peptídeo ligado de forma covalente a pelo menos um dos ditos um ou mais polímeros, sendo que o dito peptídeo compreende: (a) um primeiro local de clivagem, em que o dito primeiro local de clivagem é clivado por um primeiro composto proporcionado especificamente por um micróbio pertencente a um primeiro grupo que consiste de um número limitado de variedades, espécies ou gêneros microbianos, e não clivado por qualquer micróbio não pertencente ao dito primeiro grupo, (b) um primeiro agente fluorescente que é dotado de um comprimento de onda de emissão de 650-900 nm, (c) um primeiro agente não fluorescente que é dotado de um comprimento de onda de absorção de 650-900 nm, para extinguir a referida emissão do dito primeiro agente fluorescente, em que a clivagem do dito primeiro local de clivagem resulta no desprendimento do dito primeiro agente de extinção para fora do revestimento, sendo o desprendimento do dito primeiro agente uma indicação da presença de um micróbio pertencente ao dito primeiro grupo.

[008] A presente invenção proporciona um revestimento da superfície de objetos que compreende: (a) um ou mais polímeros, (b) um primeiro agente fluorescente que é dotado de um comprimento de onda de emissão de 650-900 nm, (c) um primeiro agente não fluorescente que é dotado de um comprimento de onda de absorção de 650-900 nm, para extinguir a referida emissão do dito primeiro agente fluorescente, (d) um peptídeo ligado de forma covalente a pelo menos um dos dito um ou mais polímeros, sendo que o dito peptídeo compreende o primeiro agente não fluorescente que é dotado de um comprimento de onda de absorção de 650-900 nm, para extinguir a referida emissão do dito primeiro agente fluorescente e um primeiro local de clivagem em que o dito primeiro local de clivagem é clivado por meio de um primeiro composto proporcionado especificamente por um micróbio pertencente a um primeiro grupo que consiste de um número limitado de variedades, espécies ou gêneros microbianos, e não clivado por qualquer composto proporcionado por qualquer micróbio não pertencente ao dito primeiro grupo, em que a clivagem do dito primeiro local de clivagem resulta no desprendimento do dito primeiro agente não fluorescente para fora do revestimento, sendo o desprendimento do dito primeiro agente não fluorescente uma indicação quanto à presença de um micróbio pertencente ao dito primeiro grupo.

[009] A invenção proporciona um revestimento da superfície de objetos em que a clivagem do primeiro local de clivagem resulta simultaneamente na clivagem do primeiro agente não extintor do revestimento da superfície de objetos para que a emissão do primeiro agente fluorescente possa ser detectada.

[010] De acordo com uma concretização preferida, a clivagem do primeiro local de clivagem não resulta em desprendimento do primeiro agente fluorescente do revestimento da superfície de objetos. Em outras palavras, depois da clivagem do primeiro local de clivagem, o primeiro agente fluorescente permanece covalentemente ligado ao revestimento da superfície do objeto.

[011] O efeito de desprender apenas o primeiro agente não fluorescente a partir do revestimento da superfície de objetos é o de que o revestimento da superfície de objetos altera o seu estado da condição de "escuro", isto é, não emite luz de comprimento de onda 650-900 nm, para uma condição de estado "de luz", que emite luz de comprimento de onda 650-900 nm, luz emitida essa que pode ser gravada por um detector adequado. Uma vantagem dessa alteração de um estado "escuro (desligado)" para um estado "de luz (ligado)"é que a possibilidade de falsos positivos é reduzida.

[012] Por exemplo, nos revestimentos da técnica anterior que não compreendem uma fração não fluorescente de acordo com a presente invenção, um revestimento da superfície de objetos emite luz na ausência de microrganismos, mas na presença de microrganismos o agente fluorescente é desprendido libertado para fora do revestimento e o revestimento muda para um estado escuro no qual nenhuma luz é emitida. No entanto, neste caso, o revestimento da superfície de objetos poderia ainda emitir luz se o primeiro agente fluorescente não fosse dissipado para fora do revestimento, pelo que seria observado um resultado falso. No revestimento de acordo com a presente invenção, a possibilidade de tais positivos falsos é reduzida porque, assim que ocorre a clivagem, a distância entre o primeiro agente de fluorescência e primeiro agente não fluorescente aumenta de tal modo que a emissão não é mais extinta.

[013] Sem com isso se desejar ficar restringidos pela teoria, o desprendimento do primeiro agente não fluorescente em relação a um revestimento da superfície de objetos significa que a extinção da luz emitida a partir do primeiro agente fluorescente não é dependente da difusão do primeiro agente fluorescente para fora em relação ao revestimento da superfície de objetos como nos revestimento da técnica anterior.

[014] Esta clivagem é realizada por meio de um composto, proporcionado por um micróbio, pertencente a um grupo que consiste de um número limitado de variedades, espécies ou gêneros microbianos. Os membros deste grupo, como uma facilidade indicada como o primeiro grupo, de variedades, espécies ou gêneros microbianos são capazes de proporcionar especificamente um composto, que cliva o dito primeiro local de clivagem. O termo “especificamente” significa que estirpes, espécies ou gêneros microbianos que não pertencem ao referido primeiro grupo não são capazes de proporcionar um composto que possa reconhecer a clivagem do referido local de clivagem, em contraste com os membros do dito primeiro grupo. O composto pode ser proporcionado, por exemplo, por desprendimento do dito composto a partir de um micróbio, ou pode, por exemplo, estar presente na sua superfície externa. Neste último caso, a clivagem será realizada por meio do contato do micróbio com o revestimento, enquanto que quando o composto é desprendido a partir do micróbio, o micróbio pode estar a uma distância do objeto revestido, desde que o composto de desprendimento seja capaz de chegar ao revestimento após o desprendimento do micróbio.

[015] É igualmente possível que o micróbio pertencente a um determinado grupo, após a infecção de um hospedeiro, induza o desprendimento ou a produção de um composto particular pelo hospedeiro. Neste último caso, este composto não é produzido ou desprendido pelo hospedeiro por infecção de outro micróbio, não pertencente ao referido grupo. A clivagem pode ser efetuada pelo composto, ou pode, por exemplo, ser induzida pela ligação do referido composto formando um complexo, complexo esse que é reconhecido por um fator de clivagem, presente no ambiente do revestimento, isto é, proporcionado pelo micróbio ou por um hospedeiro infectado pelo micróbio que compreende o objeto. Para que os micróbios pertençam a um determinado grupo, como o primeiro grupo de estirpes, espécies ou gêneros, a presença desses micróbios deve induzir a clivagem do sítio de clivagem, enquanto a clivagem não é induzida por micróbios de outro grupo. Esta clivagem pode ocorrer por parte do mesmo composto, mas também por meio de uma pluralidade de diferentes compostos, desde que estes compostos induzam a clivagem do referido sítio de clivagem. Por exemplo, o primeiro grupo compreende três espécies bacterianas diferentes, sendo que a primeira e segunda espécies proporcionam o mesmo composto mediante clivagem do local de clivagem do revestimento, com a terceira espécie proporcionando um composto, diferindo do composto da primeira e segunda espécies, mas também clivando especificamente o mesmo local de clivagem no revestimento. O termo "limitado" significa que esse grupo não compreenderá todos os micróbios, ou todas as bactérias, mas a menos, ou seja, um número limitado, de modo que o desprendimento do primeiro agente é de fato indicativo para um ou mais micróbios, mas não para todos ou quaisquer micróbios ou bactérias, e assim por diante.

[016] De acordo com uma concretização, o primeiro agente fluorescente é dotado de um comprimento de onda de emissão de 300-450 nm, de preferência 450-650 nm, ainda com maior preferência 650-900 nm.

[017] O primeiro agente fluorescente que é dotado de um comprimento de onda de emissão de 650-900 nm pode ser qualquer composto que emita luz sob o comprimento de onda de 650-900 nm requerido e que é dotado de sobreposição espectral com o primeiro agente não fluorescente de modo que quando o primeiro agente fluorescente e o primeiro agente não fluorescentes estão os dois presentes no peptídeo não clivado no revestimento da superfície de objetos, nenhuma luz é emitida.

[018] De acordo com uma concretização, o primeiro agente fluorescente que é dotado de um comprimento de onda de emissão de 450-650 nm pode ser qualquer composto que emita luz sob o comprimento de onda de 450-650 nm requerido e que seja dotado de uma sobreposição espectral com o primeiro agente não fluorescente de modo que quando o primeiro agente fluorescente e o primeiro agente não fluorescentes estão os dois presentes no peptídeo não clivado no revestimento da superfície de objetos, nenhuma luz é emitida.

[019] De acordo com outra concretização, o primeiro agente fluorescente que é dotado de um comprimento de onda de emissão de 300-350 nm pode ser qualquer composto que emita luz sob o comprimento de onda de 300-350 nm requerido e que seja dotado de sobreposição espectral com o primeiro agente não fluorescente de forma tal que quando o primeiro agente fluorescente e o primeiro agente não fluorescentes estão os dois presentes no peptídeo não clivado no revestimento da superfície de objetos, nenhuma luz seja emitida.

[020] O primeiro agente não fluorescente que é dotado de um comprimento de onda de absorção de 650-900 nm, compreendido por um composto que é dotado de pouca ou nenhuma fluorescência intrínseca e que possa extinguir eficientemente a fluorescência a partir de um fluoróforo NIR próximo com a necessidade de pouco ou nenhum fundo. De acordo com uma concretização o primeiro corante não fluorescente compreendido por uma molécula de cianina. As moléculas de cianina, também referidas como corantes de cianina, incluem compostos que é dotado de dois anéis heterocíclicos que contêm nitrogênio substituído ou não substituído unidos por uma cadeia de polimetina (Fórmula I):

[021] De acordo com uma concretização, o primeiro agente fluorescente compreendido por um corante de cianina que é dotado da fórmula geral tal como ilustrada na fórmula I, em que R1é selecionado a partir do grupo que consiste de H, hidrocarbila, halo, carboxila, amino e SO3-Cat+ em que Cat+ compreendido por um cátion, de preferência um metal alcalino-terroso, de preferência sódio, potássio ou lítio; Z é selecionado a partir do grupo que consiste de H 0, S, NH e N-hidrocarbil; R2, R3 R9, R10são cada um deles selecionados independentemente a partir do grupo que consiste de H e hidrocarbil, R4, R5, R11, 12são cada um deles selecionados independentemente a partir do grupo que consiste de H, hidrocarbil e sulfonato ou em conjunto com os átomos aos quais eles estão ligados formam um anel aromático; R6, R7, R13, R14são cada um deles selecionados independentemente a partir do grupo que consiste de H e hidrocarbil, ou em conjunto com os átomos aos quais eles estão ligados formam um anel aromático; R8 e R15são cada um deles selecionados independentemente a partir do grupo que consiste de hidrocarbil, (CH2)qFG ou (CH2)pLN, em que pelo menos um de R8 e R15 compreendido por (CH2)qFG, em que q compreendido por um inteiro que varia de 1 a 20 e FG compreendido por um grupo funcional que não reage diretamente com os grupos carboxila, hidroxila, amino ou tiol, em que p compreendido por um inteiro que varia desde 1 a 20 e LN compreendido por um grupo ligante que reage com os grupos carboxila, hidroxila, amino ou tiol; R15 compreendido por H ou hidrocarbil.

[022] O primeiro agente não fluorescente também pode ser, por exemplo, BHQ3, (Biosearch) QC-1 (Li-COR.com), ou partículas que compreendem esses compostos, por exemplo, nanopartículas de ouro e nanopartículas de ferro.

[023] De acordo com uma concretização, um ou mais polímeros são selecionados a partir do grupo que consiste em polietileno glicol, diacrilato de polietileno glicol, polilactida, álcool polivinílico, copolímero de poli-DL-lactida-co- glicolido / polietileno glicol e as suas combinações.

[024] Verificou-se que os polímeros vantajosos para o revestimento da superfície de objetos são compreendidos por polímeros à base de polietileno glicol devido à natureza bio-compatível dos polímeros à base de polietileno glicol.

[025] De acordo com uma concretização, o peptídeo está ligado covalentemente através do terminal N ou C ou uma cadeia lateral a pelo menos um dos ditos um ou mais polímeros pelo ligante hidrocarbil C4-C30, de preferência através do terminal C ou de uma cadeia lateral, com mais preferência através do término C.

[026] O termo hidrocarbil, tal como utilizado na presente descrição, significa um ligante que contém átomos de carbono e hidrogênio; ele é linear, ramificado ou cíclico, saturado ou insaturado, tal como um alquila, alquenila e alquinila; substituinte alicíclico tal como cicloalquila, cicloalquenilacenil; aromático. Pode estar substituído com um ou mais grupos substituintes não hidrocarbila, por exemplo, um heteroátomo. Um ligante preferido é selecionado a partir do grupo que consiste em 4, 5, 6 e 7 átomos de carbono.

[027] Os inventores descobriram que pela ligação covalente do peptídeo por intermédio do término C a um ou mais polímeros do revestimento da superfície de objetos, o local de clivagem é apresentado em uma orientação que facilita a clivagem por meio de um microorganismo.

[028] De acordo com uma concretização, o revestimento da superfície de objetos de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o ligante C4-C30 compreende um grupo hidrocarbil cíclico ou um grupo heterocíclico cíclico, de preferência o dito grupo heterocíclico compreendido por um grupo triazol.

[029] De acordo com uma concretização da presente invenção o ligante pode ser instalado por intermédio da reação de um grupo reativo no término N ou C ou cadeia lateral do peptídeo com um grupo reativo complementar no polímero. Um grupo reativo particularmente preferido compreendido pelo grupo azida e um grupo reativo complementar preferido compreendido pelo grupo alquino. A reação da azida e do alquino desenvolve-se na presença do primeiro agente fluorescente e do primeiro agente não fluorescente sem a ocorrência de reações colaterais indesejáveis.

[030] Outros exemplos incluem várias reações de acoplamento catalisadas por Pd(0), ligação de Staudinger, reações de ciclo adição (Diels- Alder, ciclo adição 1,3-dipolar), alquilação redutora, formação de oxima e hidrazina, reações de adição de tiol, e acoplamento oxidante.

[031] De acordo com uma concretização, o primeiro local de clivagem é clivado por meio de um composto proporcionado por bactérias gram positivas ou bactérias gram negativas, de preferência bactérias gram positivas, com maior preferência a partir dos gêneros Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, e Bacillus, Corynebacterium, Nocardia, Clostridium, Actinobacteria, e Listeria.

[032] Uma vantagem do revestimento da superfície de objetos de acordo com a invenção é a de que o revestimento pode ser projetado de uma forma tal que o revestimento é capaz de reagir somente a um determinado grupo de microorganismos. Por exemplo, de acordo com uma concretização preferida, o primeiro local de clivagem é clivado por meio de um composto proporcionado por meio de bactérias gram positivas, tais como Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, e Bacillus, Corynebacterium, Nocardia, Clostridium, Actinobacteria, e Listeria. De acordo com uma concretização particularmente preferida, as bactérias gram positivas são selecionadas a partir dos gêneros Staphylococcus, Streptococcus, com maior preferência Staphylococcus.

[033] De acordo com uma concretização, o primeiro local de clivagem é clivado por meio de um composto proporcionado por bactérias gram negativas, tais como Escherichia coli, Shigella flexneri, e Campylobacter jejuni.

[034] De acordo com uma concretização, o primeiro composto compreendido por uma protease selecionada a partir do grupo que consiste de Endoproteinase Glu-C a partir de Staphylococcus aureus V8, IgAl protease, aureolisina.

[035] Um exemplo de um composto que é específico para as bactérias gram positivas compreendido pela forma protease V8 Staphylococcus aureus, também conhecida como endoproteinase Glu-C, Glu-C protease, staphylococcal serine proteinase, Staphylococcus V8 serine endopeptidase. Esta protease promove a clivagem especificamente no lado carboxila do aspartato e resíduos de glutamato.

[036] De acordo com uma concretização, o primeiro local de clivagem compreende um motivo de aminoácido específico, sendo selecionado de preferência a partir do grupo que consiste de EFRIV, EFRIK, DFRIK, GIGEFRIK, GIGDFRIK.

[037] De acordo com uma concretização preferida, o local de clivagem compreende um aminoácido selecionado a partir do grupo de serina, treonina, arginina, lisina, ácido aspártico e ácido glutâmico, de preferência ácido aspártico e ácido glutâmico, sendo a referida clivagem compreendida em um composto de pelo menos uma bactéria selecionada a partir do grupo que consiste de Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, e Bacillus, Corynebacterium, Nocardia, Clostridium, Actinobacteria, e Listeria.

[038] De acordo com uma concretização preferida, o local de clivagem compreende um aminoácido selecionado a partir do grupo de alanina, leucina, valina, isoleucina e prolina, compreendendo clivagem em um composto de pelo menos uma bactéria selecionada a partir do grupo que consiste de Escherichia coli, Shigella flexneri, e Campylobacter jejuni.

[039] Entende-se deste modo que o local de clivagem tem o seu significado bem conhecido, que é uma porção de estrutura molecular do revestimento da superfície de objetos, que é clivada por um composto específico pelo que o local de clivagem compreende uma ou mais ligações de amida.

[040] O local de clivagem pode ser dotada da estrutura XYZ, em que X é compreendido por pelo menos um aminoácido, Y é compreendido por uma porção de estrutura molecular composta de pelo menos dois aminoácidos que representam o primeiro local de clivagem, e Z é compreendido por pelo menos um aminoácido. Os aminoácidos utilizados podem ser compreendidos por qualquer aminoácido, de preferência selecionado a partir do grupo de aminoácidos que ocorrem naturalmente ou do grupo de aminoácidos sintéticos, em particular derivados de aminoácidos naturais. Os aminoácidos são de preferência aqueles que permitem a ligação do composto que realiza a clivagem do primeiro local de clivagem.

[041] De acordo com uma concretização, o primeiro local de clivagem compreende aminoácidos que são substratos e / ou locais de ligação para proteases secretadas por microorganismos tais como bactérias gram positivas, tais como Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, e Bacillus, Corynebacterium, Nocardia, Clostridium, Actinobacteria, e Listeria. De acordo com uma concretização particularmente preferida, as bactérias gram positivas são selecionadas a partir dos gêneros Staphylococcus, Streptococcus, com maior preferência Staphylococcus.

[042] De acordo com uma concretização, o primeiro local de clivagem é compreendido por aminoácidos que são substratos e ou locais de ligação para as proteases segregadas pelos microorganismos tais como bactérias gram negativas, tais como Escherichia coil, Shigella flexneri, e Campylobacter jejuni.

[043] O peptídeo no qual o local de clivagem está localizado pode compreender, por exemplo, entre 4 e 14, por exemplo, aminoácidos, por exemplo, entre 5 e 12 aminoácidos, por exemplo, entre 6 e 11 aminoácidos, por exemplo, entre 7 e 10 aminoácidos e, por exemplo, entre 8 e 9 aminoácidos. De preferência, o peptídeo compreende 6 aminoácidos, 7 aminoácidos, 8 aminoácidos, 9 aminoácidos ou 10 aminoácidos.

[044] Um local de clivagem compreende de preferência um número de aminoácidos, por exemplo, pelo menos dois, de preferência pelo menos três aminoácidos, com maior preferência pelo menos quatro aminoácidos, ainda com maior preferência pelo menos cinco aminoácidos, tal como se encontra descrito no manual padrão Biochemistry, Ed. L Stryer, 7th Edition, 2012, WH Freeman, Part 1, Chapter 2 Protein Composition e Structure. A porção de estrutura molecular em um local de clivagem também pode ser referida como um “motivo de aminoácido”. Na presente invenção, o local de clivagem é concebido de tal modo que é reconhecido por um composto proporcionado por um micróbio pertencente a um grupo que consiste de um número limitado de variedades, espécies ou gêneros microbianos.

[045] De acordo com uma concretização preferida, o primeiro agente fluorescente é da fórmula

[046] em que Z é compreendido por 0, em que R1 SO3-Na+; R2, R3, R9, R10são compreendidos por hidrocarbil, R4 e R11são compreendidos por H, R5 e R12 sulfanato R6, R7, R13, R14são compreendidos por H, R8 (CH3)gSO3- e R15 éster de (CH2)5-H-hidroxi succinimida, sendo o primeiro agente fluorescente compreendido por tetra sódio 6 -(2 -{(E) -2 -[(3E) -3 -{(2E) -2 -[3,3 -dimetil -5 - sulfonato -1 -(4 -sulfonatobutil) -1,3 -diidro -2H -indol -2 -ilideno]etilideno} -2 -(4 - sulfonatofenoxi) -1 -ciclohexen -1 -il]vinil} -3,3 -dimetil -5 -sulfonato -3H -indólio - 1 -il)hexanoato e os seus derivados.

[047] De acordo com uma concretização, o derivado de tetra sódio 6 -(2 -{(E) -2 -[(3E) -3 -{(2E) -2 -[3,3 -dimetil -5 -sulfonato -1 -(4 -sulfonatobutil) -1,3 - diidro -2H -indol -2 -ilideno]etilideno} -2 -(4 -sulfonatofenoxi) -1 -ciclohexen -1 - il]vinil} -3,3 -dimetil -5 -sulfonato -3H -indólio -1 -il)hexanoato é compreendido por uma amida, ácido carboxílico ou maleimida.

[048] De acordo com uma concretização, o primeiro agente fluorescente, por exemplo, um corante de cianina, e / ou o primeiro agente não fluorescente é ligado ao peptídeo por intermédio de uma ligação de amida, éster ou uma ligação de produto de adição de Michael.

[049] De acordo com uma concretização, o primeiro agente fluorescente é compreendido por um composto de acordo com a fórmula III:

[050] em que R23 e R25são cada um independentemente H ou hidrocarbil, R24 e R26são cada um independentemente selecionados a partir do grupo que consiste de H, hidrocarbil, e (CH2)qFG, em que q é compreendido por um inteiro a partir de 1 a 20 e FG é compreendido por um grupo funcional que não reage diretamente com os grupos carboxila, hidroxila, amino ou tiol; R27 é cada um selecionado independentemente a partir do grupo que consiste de H, hidrocarbil e aril, em que aril é opcionalmente substituído por grupos cloro, halo ou acil.

[051] Exemplos de primeiros agentes fluorescentes adequados que podem ser usados com a presente invenção incluem, sendo que não se fica limitado aos mesmos, Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 430, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, Alexa Fluor® 700, Alexa Fluor® 750 ATTO 680, ATTO 700, DY-647, DY-650, DY-673, DY-675, DY-676, DY-680, DY-681, DY- 682, DY-690, DY-700, DY-701, DY-730, DY-731, DY-732, DY-734, DY-750, DY-751, DY-752, DY-776, DY-781, DY-782, DY-831, La Jolla Blue, Cy5, Cy5.5, Cy7, IRDye® 8000W, IRDye® 38, IRDye® 800RS, IRDye® 700DX, IRDye® 680, entre outros. Os corantes “Alexa Fluor” são encontrados disponíveis a partir da Molecular Probes Inc., Eugene, OR, U.S.A. (www.probes.com). Os corantes “ATTO” são encontrados disponíveis a partir da ATTO-tec GmbH, Siegen, Germany (www.atto-tec.com). Os corantes “DY” são encontrados disponíveis a partir da Dyomics GmbH, Jena, Germany (www.dyomics.com). La Jolla Blue é encontrado disponível a partir da Hyperion Inc. Os corantes “Cy” são encontrados disponíveis a partir da Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, U.S.A., (www.amersham.com). Os corante infravermelhos “IRDye®” são encontrados disponíveis a partir da LkCOR® Bioscience, Inc., Lincoln, NE, U.S.A (www.Iicor.com).

[052] De acordo com uma concretização, o primeiro agente não fluorescente é compreendido por um corante de cianina que é dotado de um comprimento de onda de absorção de 650-900 nm. Uma vantagem dos corantes de cianina nas proximidades dos comprimentos de onda de infravermelho é que a detecção próximo do infravermelho reduz o fundo, dispersão e interferência causada por outros compostos na amostra a ser medida, aperfeiçoando a confiabilidade do método da invenção nos dois sistemas ex vivo e in vivo. Além disso, esses comprimentos de ondas têm a capacidade de penetrar o tecido tornando esses corantes particularmente adequados para as aplicações in vivo.

[053] De acordo com uma concretização preferida, o agente não fluorescente é compreendido por Dietilamino -5 -fenil fenazio -7 -diazobenzeno - 4" -(N -etil -0 -(4,4' -dimetoxitritil)) -N -etil -2 -O (BHQ3) (Biosearch), QC-1, IRDye® 800RS (Li-COR.com), nanopartículas de ouro e nanopartículas de ferro.

[054] De acordo com uma concretização, o primeiro agente não fluorescente é compreendido por um composto de fórmula IV:

em que Z é compreendido por 0, em que R1 SO3-Na+; R2, R3, R9, R10são compreendidos por hidrocarbil, R4 e R11são R5 e R12são compreendidos por H, R6, R7, R13, R14são compreendidos por H, R8 (CH3)gSO3- e R15éster de (CH2)5- H-hidroxi succinimida.

[055] De acordo com uma concretização preferida, quando o primeiro agente fluorescente é o mesmo que o primeiro agente não fluorescente, o referido primeiro agente fluorescente é o composto de acordo com a fórmula IV, IRDye® 800RS. Nesta concretização o IRDye® 800RS é dotado da propriedade de auto-extinção de luz emitida no revestimento. Quando uma proporção do IRDye® 800RS é removida para fora do revestimento, há um aumento na distância entre as moléculas IRDye® 800RS de modo que um grau mais baixo de auto-extinção ocorre e assim a luz é emitida para fora do revestimento.

[056] De uma forma alternativa, o primeiro agente não fluorescente é compreendido por um composto da fórmula V:

em que X é selecionado a partir do grupo que consiste em H, cloro, flúor, bromo, O-aril em que aril é para-substituído por um grupo selecionado a partir do grupo que consiste em sulfato, halogênio, hidroxil e amina; R2, R3, R9, R10são compreendidos cada um deles independentemente por H ou hidrocarbil, R4, R5, R11, R12são cada um selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em H, hidrocarbil, sulfanato e N-hidrocarbil ou em conjunto com os átomos aos quais eles são ligados formam um anel aromático; R6, R7, 'R13, R14 são cada um deles independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em H, sulfanato hidrocarbil, ou em conjunto com um anel aromático; R8 e R15são cada um deles independentemente hidrocarbil, (CH2) qFG ou (CH2) pLN, em que pelo menos um de R8 e R15é compreendido por (CH2) qFG, em que q é compreendido por um número inteiro de 1 a 20 e FG é compreendido por um grupo funcional que não reage diretamente com grupos carboxila, hidroxila, amino ou tiol, em que p é compreendido por um número inteiro de 1 a 20 e LN é compreendido por um grupo ligante que reage com grupos carboxila, hidroxila, amino ou tiol; R15é compreendido por H ou hidrocarbil.

[057] De preferência, o composto de fórmula V é compreendido por um composto em que X é compreendido por cloro; R2, R3 R9, R10 hidrocarbil, R4, R6 R7, R11 , R12, R14são compreendidos por H, R5é compreendido por N-hidrocarbil; R13é compreendido por sulfanato, R8 (CH3)gSO3- e R15éster de (CH2)5 -H - hidroxi succinimida, sendo o dito primeiro agente não fluorescente compreendido por sódio 4 -((E) -6 -((E) -2 -[3,3 -dimetil -1 -(4 -sulfonatobutl) -indolin -2 - ilideno]etilideno} -2 -((E) -2 -(1 -6 -(2,5 -dioxo pirrolidin -1 -iloxi) -6 -oxihexil) -3,3 -dimetil -3H -indolio -2i1)vinil) ciclohex -1 -eniloxi) benzeno sulfonato.

[058] Ainda de acordo com outra concretização, o primeiro agente não fluorescente é compreendido por um composto de acordo com a fórmula VI:

em que R17, R18, R19 e R20são cada um deles independentemente hidrocarbil ou hidrocarbil substituído, em que o hidrocarbil é substituído por grupos hidroxila, halo, fósforo ou sulfanato.

[059] De acordo com outra concretização, o primeiro agente não fluorescente é compreendido por um composto de acordo com a fórmula VII:

em que R17, R18 e R19são cada um independentemente hidrocarbil ou hidrocarbil substituído em que o hidrocarbil é substituído por grupos hidroxila, halo, fósforo ou sulfanato; R20 e R21são compreendidos por grupos H, hidrocarbil, alcoxi ou halo.

[060] De acordo com uma concretização, o primeiro agente não fluorescente é dotado de um comprimento de onda de absorção de 300-450 nm, de preferência 450-650 nm, ainda com maior preferência 650-900 nm. O primeiro agente não fluorescente é selecionado de forma tal que é obtida uma boa sobreposição espectral com o primeiro agente fluorescente de forma tal que quando o primeiro agente não fluorescente e o referido primeiro agente fluorescente estão em estreita proximidade, a emissão de um sinal a partir do referido primeiro agente fluorescente é extinta.

[061] De acordo com um segundo aspecto, a presente invenção proporciona um método de preparação de um revestimento da superfície de objetos de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que compreende as etapas de: (a) proporcionar um peptídeo que compreende o primeiro agente fluorescente, o primeiro agente não fluorescente, o primeiro local de clivagem e um alquina reativo; (b) contatar o peptídeo obtido na etapa a) com um diacrilato C5C25 que compreende um grupo azida; (c) reticular o conjugado peptídeo - diacrilato obtido na etapa b) com um ou mais polímeros.

[062] Os inventores descobriram que ao incluir-se no revestimento o primeiro agente fluorescente e o primeiro agente não fluorescente em um GED - 4609478v1 peptídeo modificado por acrilato, a síntese do revestimento da superfície de objetos é mais eficiente do que nos métodos da técnica anterior. Na técnica anterior é conhecido misturarem-se polímeros marcados de forma fluorescente e depois reticular os polímeros misturados. No método de acordo com a invenção, não é necessário marcar o polímero diretamente. Isto resulta em uma síntese mais eficaz em termos de tempo do que naqueles da técnica anterior.

[063] De acordo com um terceiro aspecto, é proporcionado um objeto que compreende um revestimento de superfície de objeto de acordo com a invenção, sendo o dito objeto selecionado a partir do grupo que consiste de implantes médicos, instrumentos médicos, mechas médicas, placas de micro poços, superfícies de preparação de alimentos, móveis.

[064] O revestimento da superfície de objetos da presente invenção é adequado para o uso em uma ampla gama de substratos. A vantagem da presente invenção reside no fato de que ela pode ser usada para detectar a presença de infecção por bactérias em implantes médicos, instrumentos médicos e móveis. Móveis adequados são compreendidos, por exemplo, por leitos hospitalares, mesas hospitalares, mesas de operações com superfícies que se deseja que permaneçam limpas e se uma bactéria patogênica estiver presente seja prontamente detectada.

[065] De acordo com uma concretização, o objeto é selecionado a partir do grupo que consiste de agulhas, cateteres, fios de guia, parafusos, placas de implante e pinos de implante.

[066] O revestimento da superfície de objetos da presente invenção é particularmente adequado para ser usado em objetos que se destinam a ser implantados no corpo. Pela utilização de implantes que são revestidos com o revestimento da presente invenção, uma infecção bacteriana pode ser facilmente detectada e deste modo o médico pode decidir prontamente sobre o próximo curso do tratamento.

[067] De acordo com um quarto aspecto, proporciona-se um método para revestir um objeto que compreende as etapas de: (a) proporcionar um revestimento da superfície de objetos de acordo com a invenção, (b) revestir por imersão o objeto selecionado a partir do grupo que consiste de implantes médicos e instrumentos médicos a ser revestido com o revestimento de superfície a partir da etapa a), (c) secar o dito objeto obtido na etapa b).

[068] Um objeto de acordo com a presente invenção pode ser revestido com o referido revestimento de polímero utilizando-se técnicas tais como revestimento por imersão, revestimento por pulverização, revestimento por centrifugação ou por fusão de solvente. Também estão disponíveis técnicas de revestimento que envolvem o enxerto químico de moléculas na superfície do biomaterial. Os revestimentos nano-finos baseados em monocamadas auto- montadas (SAMs), polímeros de superfície amarrados (escovas de polímeros), ou revestimentos multicamadas com base montagem camada por camada oferecem controle preciso sobre a localização e orientação de grupos químicos e de biomoléculas na superfície do revestimento são comumente conhecidos na técnica para aplicar vários revestimentos a componentes ortopédicos e outros dispositivos médicos por uma variedade de razões, vide, Handbook of Materials for Medical Devices, Davis, J. R. (Ed.), Chapter 9, "Coatings" 2003.

[069] De acordo com um quinto aspecto, proporciona-se um método de revestimento de um objeto o qual compreende as etapas de: (a) proporcionar um revestimento da superfície de objetos de acordo com a invenção, e (b) contatar um objeto selecionado a partir do grupo que consiste de mechas médicas, placas de micro poços, superfícies de preparação de alimentos, móveis, com o revestimento de superfície proveniente da etapa a).

[070] De acordo com uma concretização particularmente preferida o revestimento da superfície de objetos é proporcionado em um solvente, por exemplo, um solvente aquoso ou orgânico, o qual pode ser aplicado a uma superfície, por exemplo, mechas médicas, placas de micro poços, superfícies de preparação de alimentos, móveis. _O revestimento pode ser aplicado, por exemplo, por meio de pintura. De uma forma alternativa, o revestimento pode ser compreendido em uma fita adesiva. A vantagem da aplicação do revestimento por meio de pintura ou por meio de fita adesiva reside no fato de que é proporcionado um meio fácil e de tempo eficiente para proporcionar um objeto com um revestimento de superfície para a detecção de microrganismos patogênicos.

[071] De acordo com um sexto aspecto, é proporcionado um método de preparação de um revestimento da superfície de objetos de acordo com a invenção, que compreende as etapas de: (a) proporcionar uma superfície de objeto que compreende um ou mais polímeros, sendo que o referido um ou mais polímeros compreendem um grupo reativo A, e (b) contatar a superfície do objeto de acordo com a etapa a) com o peptídeo que compreende o agente reativo B complementar ao grupo reativo A, para preparar o referido revestimento da superfície de objetos.

[072] Os inventores descobriram que as superfícies revestidas com grupos alquinila, por exemplo, as superfícies de vidro ou placas de micro titulação revestidas com polímeros de PEG de alquinila, podem reagir com peptídeos, peptídeo esse que compreende um grupo azida, sendo o referido grupo azida complementar ao referido grupo alquinila. Surpreendentemente, este método permite a fácil produção de superfícies revestidas com peptídeos, superfícies essas que desprendem um agente fluorescente ou não fluorescente na presença de bactérias.

[073] De acordo com uma concretização, o referido grupo reativo A é selecionado a partir do grupo que consiste de álcool (OH), tiol (SH), amina (NH2), ácido (CO2H), alquina, alqueno, azida, de preferência alquina ou azida, com maior preferência alquina.

[074] De acordo com uma concretização, o dito grupo reativo B é selecionado a partir do grupo que consiste de álcool (OH), tiol (SH) amina (NH2), ácido (CO2H), alquina, alqueno, azida, de preferência alquina ou azida, com maior preferência azida.

[075] De acordo com uma concretização, o produto da reação do grupo reativo A e do grupo reativo B é compreendido por um grupo selecionado a partir do grupo que consiste numa ligação de produto de adição de éster, amida, carbamato, tio éster, maleimida e um sistema de ligação de produto de adição de Michael.

[076] De acordo com uma concretização, o peptídeo que compreende o primeiro local de clivagem e o primeiro agente fluorescente e primeiro agente não fluorescente compreende ainda um grupo reativo A. O dito grupo reativo A é selecionado a partir do grupo que consiste de álcool, tiol, amina, ácido carboxílico, azida ou grupo de hidrocarbonetos insaturados, por exemplo, alquina ou alqueno. O dito peptídeo é levado ao contato com um revestimento da superfície de objetos que compreende o grupo reativo B que é complementarão grupo reativo A. O grupo reativo B é selecionado a partir do grupo de álcool, tiol, amina, ácido carboxílico, azida e ou grupo de hidrocarbonetos insaturados, por exemplo, alquina ou alqueno. De preferência, o peptídeo compreende uma azida e a superfície do objeto compreende um alquina. O grupo reativo B pode ser ligado de forma covalente a um ou mais polímeros da superfície do objeto. Na presente invenção, o polímero pode ser orgânico ou inorgânico. Exemplos adequados de polímeros orgânicos são compreendidos por polietileno glicol, diacrilato de polietileno glicol, polilactida, álcool polivinílico, copolímero de DL-lactida-co-glicolídeo / polietileno glicol e combinações destes. Exemplos adequados de polímeros inorgânicos são compreendidos por polímeros de sílica, por exemplo siloxanos, por exemplo, siloxanos com uma unidade repetitiva (-O-SiR2-0)n, onde R é compreendido por uma cadeia hidrocarbil, de preferência hidrocarbil C1-C20.

[077] De acordo com uma concretização, a referida superfície do objeto é submetida a um pré-tratamento. O referido pré-tratamento pode ser mecânico ou químico. O referido pré-tratamento aperfeiçoa a morfologia da superfície, tal como rugosidade, textura e porosidade de, por exemplo, superfícies metálicas ou plásticas, para aperfeiçoar a ligação do revestimento polimérico.

[078] De acordo com uma concretização, é proporcionado um método para detectar a emissão de fótons a partir de um objeto de acordo com a invenção, que compreende a etapa de irradiar o objeto com fótons com um comprimento de onda de 650-900 nm e detectar os fótons emitidos.

[079] Quando o revestimento da superfície de objetos é iluminado com luz dotada de um comprimento de onda de 650-900 nm, e está presente um microrganismo patogênico, microorganismo esse que desprendem um composto específico para o local de clivagem no revestimento da superfície de objetos, um detector adequado irá detectar os fótons a partir do revestimento. Esse método proporciona um meio fácil para se determinar a presença de um microrganismo patogênico. O método da invenção é vantajoso em relação aos métodos da técnica anterior, uma vez que não é necessária uma cultura microbiológica de trabalho intenso, dispendiosa e demorada para se estabelecer a presença, por exemplo, de uma infecção.

[080] De acordo com uma concretização é proporcionado um método para detectar a emissão de fótons a partir de um receptáculo revestido com um revestimento da superfície de objetos de acordo com uma invenção, que compreende as etapas de contatar o receptáculo com uma amostra de fluido corpóreo e detectar os fótons emitidos.

[081] Quando o revestimento da superfície de objetos é levado ao contato com um fluido corpóreo, por exemplo, saliva ou urina ou fluido extracelular em geral, e subsequentemente iluminado com luz com um comprimento de onda de 650-900 nm, e está presente um microrganismo patogênico, microorganismo esse que libera um composto específico para o local de clivagem no revestimento da superfície de objetos, um detector adequado irá detectar os fótons provenientes do revestimento. Este método proporciona um meio fácil de determinar a presença de um microrganismo patogênico na pessoa a partir da qual foi colhida a amostra corpórea. O método da invenção é vantajoso em relação aos métodos da técnica anterior, pelo fato de que não é necessária uma cultura microbiológica trabalhosa, demorada e dispendiosa para se estabelecer a presença, por exemplo, de uma infecção.

[082] De acordo com outro aspecto, proporciona-se uma utilização de um objeto de acordo com a invenção para se detectar a presença de bactérias infecciosas.

[083] O método da invenção é vantajoso em relação aos métodos da técnica anterior, uma vez que não é necessária uma cultura microbiológica de trabalho intenso, dispendiosa e demorada para se estabelecer a presença, por exemplo, de uma infecção.

Exemplos

[084] Os exemplos não limitativos que se seguem mostram concretizações particulares da presente invenção em comparação com a técnica anterior.

Síntese de peptídeos

[085] Os peptídeos 1 e 2 foram obtidos a partir da Cambridge Research Biochemicals (UK) e usados sem qualquer outra purificação.

[086] Peptídeo 1: Ac-X-[K(IRDye800RS)]-GLLEFRIVAK (IRDye800RS)- amida, onde X é compreendido por δ-azida-norvalina.

[087] Peptídeo 2: Ac-X-GLLEFRIVAC(IRDye8000W) amida, onde X é compreendido por δ-azida-L-norvalina, também denominado (S)-5-azida-2- (Fmoc-amino) ácido pentanóico). Protease V8

[088] A protease bacteriana foi obtida a partir da Sigma-Aldrich (Endoproteinase Glu-C from Staphylococcus aureus V8, P2922 SIGMA), também denominada “protease V8” ou “V8” no presente documento.

Protease GranzymB

[089] Obteve-se a protease recombinante humana a partir da MerckMillepore (368043 Granzyme B, Human, Recombinant, E. coli).

Lâminas de vidro funcionalizadas de alquina

[090] As lâminas de microscópio de vidro funcionalizadas com alquina (1013-1014 grupos alquina / cm2, 75 mm x 25 mm) que foram obtidas a partir da Microsurfaces, Inc. foram cortadas para a dimensão por meio de um cortador de vidro de diamante. As lâminas foram armazenadas em uma bolsa vedada no escuro sob -20°C._ Durante as experiências as laminas foram mantidas no escuro em um dessecador sobre P2O5.

Exemplo 1 Aplicação de peptídeos às laminas de vidro

[091] Os peptídeos 1 e 2 foram aplicados às superfícies de vidro.

Experiência de controle negativo, nenhum CuSO4 (não é possível qualquer conjugação covalente)

[092] Misturaram-se 10 μL de solução de estoque de peptídeo 1 (10 mg / mL em DMSO) com 26,5 pL de solução de ascorbato de sódio (1 mg / mL em DMSO / água 1/1) e 13,5 pL de DMSO adicionado para aumentar a solubilidade do peptídeo. A proporção de DMSO / água final foi de 73:27. A concentração final de peptídeo foi de 0,65 mM, a concentração final de ascorbato de sódio foi de 2,7 mM.

Peptídeo 1; conjugação com CuSO4

[093] Misturaram-se 10 pL de solução de estoque de peptídeo 3 (10 mg / mL em DMSO) com 12,5 pL de solução de CuSO4 (1 mg / mL, em DMSO / água 1/1) e 14 μL de solução de ascorbato de sódio (1 mg / mL em DMSO / água 1/1) e 13,5 pL de DMSO foram adicionados para aumentar a solubilidade do peptídeo. A proporção de DMSO / água final foi de 73:27. A concentração final de peptídeo era de 0,65 mM, a concentração final de CuSO4 era de 1 mM, a concentração final de ascorbato de sódio era de 1,4 mM.

[094] A solução resultante (50 pL) foi pipetada sobre a lâmina de vidro, e a lâmina foi mantida em um ambiente umidificado para 1H. A gota foi lavada por enxaguamento 3x com 1 mL de DMSO: H20 80/20; em seguida, colocou-se a lamela em uma solução de lavagem de DMSO: H20 80/20 e foi submetida a GED - 4609478v1 agitação suavemente durante 1 minuto. A solução de lavagem foi enxaguada com água (5 x 1 mL) e a lâmina foi submetida a secagem por meio de um fluxo de hidrogênio. As lâminas de vidro foram caracterizadas utilizando-se espectroscopia UV-VIS, onde apenas as lâminas que tinham sido tratadas com peptídeo e com CuSO4 apresentaram um máximo de absorção residual de tipicamente 0,01-0,05 na região esperada de comprimento de onda de 600-800 nm..

Exemplo 2 Monitoração da digestão do peptídeo 1 por meio de espectrometria de luminescência

[095] A clivagem do peptídeo 1 na presença da protease V8 e da protease GranzymB foi monitorada em solução por meio de espectrometria de luminescência. Mediram-se espectros de foto-luminescência em um Perkin- Elmer Luminescence Spectrometer LS50 B. Os espectros foram gravados a partir de 250 a 900 nm, utilizando-se um comprimento de onda de excitação de 720 nm e aplicando-se uma largura de ranhura de 15 nm.

[096] A digestão na solução foi realizada em um frasco de vidro. Diluíram-se 100 pL de solução estoque de peptídeo 1 (10 mg/mL) com 625 pL H2O e 250 pL 100 mM de solução tampão de fosfato (pH = 7,8). Coletou-se uma amostra de 10 pL sob t = 0. Então, adicionaram-se 50 pL de solução estoque de protease V8 ou Granzyme B (25 unidades, ± 25 pg), a mistura foi submetida a agitação e foi mantida sob a temperatura ambiente. Durante o período da experiência a solução de incubação permaneceu límpida (nenhuma precipitação do peptídeo de corante). Em vários horários (30 s, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 90, 120, 150 e 180 min., e sob 18H) foi coletada uma amostra de 10 pL de material de incubação e foi a mesma diluída com 3 mL de água. As amostras diluídas preparadas foram medidas por meio de espectroscopia de luminescência, de modo a monitorar a clivagem digestiva do peptídeo 1. Como simulações utilizaram-se cubetas com água e a mesma quantidade de DMSO igual à da solução de amostra.

[097] Na ausência da protease V8, observou-se uma fluorescência de fundo em torno de 1 AU. Depois de 30 s da adição de protease V8, a intensidade de fluorescência aumenta para 4 AU e dentro de 6 min. a intensidade de fluorescência é de 6 AU. Isto demonstra que o peptídeo de acordo com a invenção é capaz de detectar bactérias dentro de minutos, o que constitui um aperfeiçoamento considerável sobre os métodos da técnica anterior, tais como o teste baseado em ATP para material orgânico (tipicamente 4-8 horas) ou culturas bacterianas (24 horas).

[098] Na presença de Granzyme B, o Peptídeo 1 não é cortado e a fluorescência de fundo de 1 AU foi mantida durante toda a experiência. A Granzyme B é uma protease de serina presente sob uma concentração normal de 20-4-pg/ml no plasma sanguíneo. Os resultados demonstram que o peptídeo é seletivo quanto à presença de proteases bacterianas e não é clivado na presença de proteases desprendidas pelo corpo humano como parte das respostas autoimunes.

Exemplo 3 Monitoração da digestão do peptídeo de ligação de superfície 1 por espectroscopia de luminescência

[099] Utilizou-se equipamento Li-Cor Odyssey CLX no local em Westburg (Leusden, NL; Timo Kreike, Moniek Kors). Todas as medições de Odyssey CLX foram obtidas por excitação sob 800 nm.

[100] Na presença da protease V8, a intensidade aumentou de cerca de 6000 unidades para 25000 unidades, indicando que a V8 provoca o desprendimento do grupo de extinção a partir do peptídeo 1.

[101] Na presença da protease V8, não foi observada qualquer mudança na intensidade para o peptídeo 2. A intensidade observada permanece em 8000 unidades, indicando que muito embora o grupo fluorescente possa ser clivado, o grupo fluorescente não se difunde para fora da superfície, portanto não é observada qualquer diminuição no sinal, pelo que se obtém como resultado um falso negativo.

[102] Os resultados demonstram que o revestimento de acordo com a invenção é capaz de detector a presença de bactérias e tem propensão para falsos resultados negativos.

Exemplo 4 Revestimento de cateteres

[103] Os revestimentos de objetos são compostos de um polímero PEG (MeO-PEG-alquina, IRIS biotech) e um peptídeo portador de um local de clivagem e primeiro agente fluorescente e um primeiro agente não fluorescente. O exemplo comparativo não contém o primeiro agente não fluorescente.

[104] Os peptídeos foram sintetizados por meio de síntese de fase sólida padrão (SPPS) utilizando-se reagentes, técnicas de acoplamento e de purificação padrão.

[105] O acoplamento do peptídeo ao primeiro agente fluorescente e primeiro agente não fluorescente foi realizado após purificação de peptídeo e facilitado por acoplamento de maleimida à cisteína ou acoplamento de amida à lisina.

[106] O acoplamento do peptídeo portador de um local de clivagem e primeiro agente fluorescente e um primeiro agente não fluorescente foi realizado utilizando-se condições de reação de ciclo adição de Huisgen alquina azida padrão.

[107] O cateter utilizado foi um Catheter Foley de silicone 14F o qual foi proporcionado em comprimentos de 6 mm e dotado de um diâmetro de 4,2 mm. Preparou-se uma pasta fluida aquosa de cada revestimento de polímero e cada pedaço de cateter mergulhado dentro da mistura de pasta fluida. Os cateteres revestidos foram armazenados sob 20°C no escuro durante 15 min. antes de se repetir o procedimento de imersão. Repetiu-se o processo em um total de quatro vezes. Depois do revestimento final, os cateteres revestidos foram armazenados sob 35°C durante 48 horas para facilitar a secagem do revestimento.

Exemplo 5

[108] Cada cateter revestido e um cateter não revestido como controle, foram incubados na presença de 2 x 106 unidades de formação de colônia (CFU) ml' de S. auereus durante 4 horas. Depois disso os cateteres revestidos foram removidos da incubadeira e expostos a uma câmara de fluorescência multi espectral clínica (sistema de formação de imagem T3, SurgOptix By, Groningen, The Netherlands) com um IVIS Spectrum (excitação: 710 nm, emissão: 800 nm, tempo de aquisição 5 s, compartimentação 4, F-stop 2, FOV 21.2).

[109] Os resultados obtidos a partir do IVIS Spectrum e IVIS Lumina II foram analisados com Living Image 4.2. (Caliper LS, Hopkinton MA, USA). Os limites de detecção ótimos foram estabelecidos para o sinal mais baixo sob o qual o sinal positivo foi discriminado sem esforço a partir dos controles negativos. A intensidade de sinal foi determinada pelo traçado das regiões de interesse (ROI's) e medindo-se as contagens médias nestas regiões. O sinal foi corrigido para o fundo pela subtração do sinal de fundo a partir do sinal de interesse, referido no texto como contagens líquidas. Um sinal de infravermelho quase forte foi atribuído ao primeiro agente fluorescente.

[110] Os resultados estão expostos na Tabela 1. Tabela 1

onde Po/ é compreendido por MeO-PEG-alquina e X é compreendido por (S)-5- Azida-2-(Fmoc-amino)ácido pentanóico

[111] Os resultados demonstram que o revestimentos de acordo com a invenção que compreende um agente não fluorescente com um espectro de absorção em sobreposição com o espectro de emissão do primeiro agente fluorescente (Exemplo 5.4) conduz a uma detecção muito boa da presença de microorganismos patogênicos, por exemplo, neste caso S. aureus. A extinção por meio do primeiro agente não fluorescente é estritamente dependente da distância a partir do primeiro agente fluorescente pelo que tão logo o primeiro agente não fluorescente é clivado, a luz emitida é detectada.

[112] O Exemplo 5.4 também demonstra que o mesmo nível de detecção pode ser obtido mediante utilização do revestimentos de acordo com a invenção da mesma forma que pela cultura microbiana convencional (exemplo 5.1) mas os resultados são obtidos muito mais rapidamente, dentro de 4 horas em vez de 24-36 horas como acontece com as culturas microbianas.

[113] O Exemplo 5.3 mostra um primeiro agente fluorescente que também funciona como um primeiro agente não fluorescente também proporciona meios adequados para a detecção de microorganismos. Não obstante, devido à difusão limitada do primeiro agente fluorescente clivado, apenas é detectado um sinal fraco.

[114] Os revestimentos que compreendem somente um primeiro agente fluorescente não proporcionam boa detecção de microorganismos (exemplo comparativo 5.2). Isto é atribuído à taxa de difusão lenta do primeiro agente fluorescente para fora da superfície pelo que somente é detectada uma leve alteração na intensidade da luz emitida.

Claims

1. REVESTIMENTO DA SUPERFÍCIE DE OBJETOS, caracterizado por compreender um ou mais polímeros e um peptídeo ligado de forma covalente a pelo menos um dos ditos um ou mais polímeros, sendo que o dito peptídeo compreende: (a) um primeiro local de clivagem, em que o dito primeiro local de clivagem é clivado por um primeiro composto proporcionado especificamente por um micróbio pertencente a um primeiro grupo que consiste de um número limitado de variedades, espécies ou gêneros microbianos, e não clivado por qualquer composto proporcionado por qualquer micróbio não pertencente ao dito primeiro grupo, (b) um primeiro agente fluorescente que é dotado de um comprimento de onda de emissão de 650-900 nm, (c) um primeiro agente não fluorescente que é dotado de um comprimento de onda de absorção de 650-900 nm, para extinguir a referida emissão do dito primeiro agente fluorescente, em que a clivagem do dito primeiro local de clivagem resulta no desprendimento do dito primeiro agente não fluorescente para fora do revestimento, sendo o desprendimento do dito primeiro agente não fluorescente um indicativo da presença de um micróbio pertencente ao dito primeiro grupo.

2. REVESTIMENTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo desprendimento do dito primeiro agente não fluorescente para fora do revestimento o primeiro agente fluorescente permanece ligado de forma covalente ao revestimento da superfície de objetos.

3. REVESTIMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo dito um ou mais polímeros serem selecionados a partir do grupo que consiste de polietileno glicol, diacrilato de polietileno glicol, polilactida, álcool polivinílico, copolímero de poli DL-lactida-co-glicolida / polietileno glicol e as suas combinações.

4. REVESTIMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo referido peptídeo ser ligado de forma covalente por intermédio do término N- ou C- ou uma cadeia lateral a pelo menos um dos ditos um ou mais polímeros por meio de ligante de hidrocarbil C4-C30, de preferência por intermédio do término C- ou uma cadeia lateral, com maior preferência por intermédio da cadeia lateral; em que o ligante C4-C30 compreende um grupo hidrocarbil cíclico ou um grupo heterocíclico cíclico, de preferência o dito grupo heterocíclico é compreendido por um grupo triazol.

5. REVESTIMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo primeiro local de clivagem ser clivado por meio de um composto proporcionado por bactérias gram positivas ou bactérias gram negativas, de preferência bactérias gram positiva, com maior preferência a partir dos gêneros Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, e Bacillus, Corynebacterium, Nocardia, Clostridium, Actinobacteria, e Listeria.

6. REVESTIMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo primeiro local de clivagem ser clivado por meio de um primeiro composto, sendo uma protease selecionada a partir do grupo que consiste de protease V8, protease IgAl, aureolisina.

7. REVESTIMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo primeiro local de clivagem compreender um motivo de aminoácido específico, selecionado a partir do grupo que consiste de EFRIK (SEQ ID NO: 1) , DFRIK (SEQ ID NO: 2), GIGEFRIK (SEQ ID NO: 4), GIGDFRIK (SEQ ID NO: 5).

8. REVESTIMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo referido primeiro agente fluorescente ser compreendido por uma cianina que é dotada de um comprimento de onda de emissão de 650900 nm, e em que o referido primeiro agente não fluorescente é compreendido por um corante de cianina que é dotado de um comprimento de onda de absorção de 650-900 nm.

9. OBJETO, caracterizado por compreender um revestimento de superfície, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por dito objeto ser selecionado a partir do grupo que consiste de implantes médicos, instrumentos médicos, mechas medicinais, placas de micro poros, superfícies de preparação de alimentos e móveis ou sendo o dito objeto selecionado a partir do grupo de agulhas, cateteres, fios de guia, parafusos, placas de implantes e pinos de implantes.

10. MÉTODO PARA PREPARAR UM REVESTIMENTO DA SUPERFÍCIE DE OBJETOS, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por compreender as etapas de: (a) proporcionar um peptídeo que compreende o primeiro agente fluorescente e o primeiro agente não fluorescente, o primeiro local de clivagem e um grupo azida, (b) contatar o peptídeo obtido na etapa a) com um diacrilato C5C25 que compreende um grupo alquina, (c) reticular o conjugado de peptídeo-diacrilato obtido na etapa n) com um ou mais polímeros.

11. MÉTODO PARA REVESTIR UM OBJETO, caracterizado por compreender as etapas de: (a) proporcionar um revestimento da superfície de objetos, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou (b) revestir por imersão o objeto selecionado a partir do grupo que consiste de implantes médicos e instrumentos médicos a serem revestidos com o revestimento de superfície proveniente da etapa a), (c) secar o dito objeto obtido na etapa b), ou (d) proporcionar um revestimento da superfície de objetos, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e (e) contatar um objeto selecionado a partir do grupo que consiste de mechas medicinais, placas de micro poços, superfícies de preparação de alimentos e móveis com o revestimento de superfícies proveniente da etapa a).

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por compreender as etapas de: (a) proporcionar uma superfície de objeto que compreende um ou mais polímeros, sendo que o dito um ou mais polímeros compreende ainda um grupo reativo A, e (b) contatar a superfície de objeto de acordo com a etapa a) com o peptídeo que compreende o primeiro agente fluorescente, o primeiro agente não fluorescente, o primeiro local de clivagem e um grupo reativo B complementar ao grupo reativo A de modo que o grupo reativo A e o grupo reativo B formam uma ligação covalente para preparar o dito revestimento da superfície de objetos, sendo o dito grupo reativo A selecionado a partir do grupo que consiste de álcool (OH), tiol (SH), amina (NH2), ácido (CO2H), alquina, alqueno, azida, de preferência alquina ou azida, com maior preferência alquina, sendo o dito grupo reativo B selecionado a partir do grupo que consiste de álcool (OH), tiol (SH), amina (NH2), ácido (CO2H), alquina, alqueno, azida, de preferência alquina ou azida, com maior preferência azida.

13. MÉTODO PARA DETECTAR A EMISSÃO DE FÓTONS A PARTIR DE UM OBJETO, conforme definido na reivindicação 9, caracterizado por compreender a etapa de irradiar o objeto com fótons que são dotados de um comprimento de onda de 650-900 nm e detectar os fótons emitidos.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por compreender as etapas de contatar o objeto com uma amostra de fluido corpóreo e detectar a emissão de fótons.

15. USO DE UM OBJETO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por ser para detectar a presença de bactérias infecciosas.