CN107197623A - 采用三元无机金属硫化物M1M2S4(M1独立地为Mg、Ca、Mn、Fe或Zn；M2为Mo或W)的纳米颗粒对细胞内铜离子进行靶向以抑制血管生成来治疗转移癌 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种新型共价网络三元无机金属硫化物M1M2S4(M1独立地为Ca、Mg、Mn、Fe或Zn；M2为Mo或W)以及制备此类化合物的生物相容性纳米颗粒的方法。所述纳米颗粒用封端剂和/或生物相容聚合物进行表面改性，并且大小为几个纳米至几千纳米。这些纳米颗粒是非细胞毒性的，并可被细胞内化以通过细胞内铜离子和结合在所述纳米颗粒中的二价离子间的高度选择性的离子交换反应来消耗铜离子，以用于抑制癌症和其它疾病的血管生成应用。

Description

采用三元无机金属硫化物M1M2S4(M1独立地为Mg、Ca、Mn、Fe或 Zn；M2为Mo或W)的纳米颗粒对细胞内铜离子进行靶向以抑制血 管生成来治疗转移癌
技术领域
本发明总体涉及新型共价网络三元无机金属硫化物，该新型共价网络三元无机金属硫化物包含二价金属如Mg、Ca、Mn、Fe或Zn和六价金属如钼或钨，以及硫，其对于抑制癌症和其它疾病的血管生成应用可用于降低细胞内铜浓度。
背景技术
血管生成(Angiogenesis)，是新血管生成的过程，也称为新血管形成(neovascularization)，是新血管形成的过程。在健康的成人中，该过程由各种血管生成因子和抑制剂严格调控和协调以达到平衡。相反，血管生成在肿瘤发生中为速率限制事件(rate-limiting event)，因而是肿瘤生长和转移的标志。这个概念在过去的三十年中已激发研究人员寻找用于癌症治疗的血管生成抑制剂。目前，在美国有超过50种用于癌症治疗的抗血管生成药物，它们或在市场上销售或处于临床实验的各个阶段。所有的这些药物曾经被认为在癌症治疗方面非常有前景，但并没有达成这种高预期。这些血管生成抑制剂的主要问题是其疗效有限，在不同种类的肿瘤中具有选择性但不确定的效果，并且它们产生固有的或获得性耐药性。关于采用现有抑制剂的癌症抗血管生成治疗是否会引发更具侵袭性和转移性的肿瘤在癌症研究社区中一直在争辩。这是因为肿瘤血管生成是涉及若干平行信号通路(signaling pathway)的复杂和多步骤过程。越来越多的证据显示，当一个血管生成信号通路被封堵时，肿瘤可能利用不同的血管生成促进子 (promoter)引发其它的信号通路来使血管生长。用来解决肿瘤血管生成的复杂性以及基于对其它信号通路的更好理解来开发新一代药物的研究将会继续。同时，存在可能从更多创新路径获益的在目前的抗血管生成疗法中尚未能应对的医疗挑战。本发明旨在通过在肿瘤生长中对铜离子进行靶向而不是对多个细胞信号传导生物分子进行靶向，作为抗血管生成癌症治疗的新策略，从不同的角度来解决问题。
1980年，在体外，McAuslan和Reilly发现了铜盐是会促进内皮细胞迁移的肿瘤提取物中最简单的血管生成成分。十多年后，在体外，铜被发现促进内皮细胞的增殖和迁移。当铜丸被植入血管生成兔角膜模型的基质中时，其将引起基于剂量的新血管生成。最近，研究人员已发现铜是超过20几种血管生成中涉及的主要血管生成促进子或蛋白质的共同辅助因子，这些血管生成促进子或蛋白质包括：1)血管生成素(angiogenin)；2) 血管营养素(angiotropin)；3)血浆铜蓝蛋白(ceruloplasmin)；4)胶原酶； 5)FGF-1(酸性)；6)FGF-2(碱性)；7)FGF受体-1；8)纤连蛋白；9) 神经节甘脂；10)肝素；11)甘氨酸-组氨酸-赖氨酸(Gly-His-Lys)；12) IL-1；13)IL-6；14)IL-8；15)核因子KB(NFkB)；16)前列腺素；17) E-1；18)突触结合蛋白(synaptotagamin)；19)SPARC；20)转化生长因子β；21)肿瘤坏死因子α；以及22)血管内皮生长因子(VEGF)。在这些促进子分子被激活后，在迁移、内皮细胞的分裂和分化以及基质蛋白改形至微细管的管状结构的每一步，对铜都有特定要求。因此，在肿瘤和血管内皮细胞中以及在肿瘤基质微环境(stromal microenvironment，SMT) 中铜的消耗(depletion)将使不止一个血管生成信号通路沉寂，从而达到一石多鸟的目的。
Brem和同事将肿瘤移植到大鼠和兔的脑内并发现轻微D-青霉胺 (D-penicillamine)引起的铜缺乏极大降低肿瘤的生长以及它们的侵袭性。但是，当随后将D-青霉胺治疗延伸到有脑肿瘤的病人时，没有发现存活的改善，部分原因是作为小分子，D-青霉胺不能穿过血脑屏障(blood brain barrier，BBB)以及其与铜离子较低的结合能力的事实。D-青霉胺，即(2S) -2-氨基-3-甲基-3-磺酰基-丁酸((2S)-2-amino-3-methyl-3-sulfanyl-butanoic acid)(图式1)是一种FDA批准的用来降低在患有威尔森氏病(WD)的患者的肝脏内过量的铜积聚的药物。
图式1临床和实验药抗铜药的分子结构
该病也被称为肝豆状核变性，其是一种隐性遗传病，特征是在肝脏和其它重要器官中的过量铜积聚。由于WD是使人衰弱的疾病，并且如果不治疗，它可导致严重的残疾、需要肝脏移植以及死亡。在过去70年，在开发用来治疗WD的螯合疗法形式的临床药物方面投入了巨大的研究努力。在1951 年，英国抗路易士药剂(British anti-Lewisite，BAL)被引入作为用于WD 的第一个临床药物。该螯合剂在二战期间最初被开发作为化学战剂路易士药剂的解毒药，而后来被用于由砷、金、锑、铅或汞引起的重金属中毒的解毒(参见图式1)。由于BAL、D-PEN的一些严重的副作用，包括中毒性肾损害和高血压，在1956年引入了一种青霉素的代谢物作为用于WD 的更好的临床用药。在1982年，引入了一种新的用于WD的临床用药三乙烯四胺(triethylenetetraamine)(曲恩汀，参见图式1)，其是一种相比 D-PEN效果较差的铜螯合剂，主要用于对D-PEN表现出不能忍受的患者。目前，在美国，三乙烯四胺的临床使用受到限制，因为此种应用在欧洲尚未被批准。在1997年，美国食品药物管理局(FDA)批准了使用醋酸锌作为用于WD的临床用药。不像用于WD的其它三种临床用药，该化合物不是螯合剂，但来自该药物的锌离子可刺激肠细胞中金属硫蛋白 (metallothionein)的产生，金属硫蛋白继而结合铜离子以抑制其吸收和输送至肝脏。已经证明醋酸锌针对WD仅作为维持治疗有效。最近，四硫钼酸盐(tetrathiomolybdate，TTM，参见图示1)被引入作为针对WD的试验药。研究已经证明TTM在消化道中与铜和食物蛋白形成三元复合物的非生物可吸收形式，以阻止自膳食的铜肠道吸收，因而在体内创建阴性铜平衡(negative copperbalance)。在所有这些用于WD的药物中，D-PEN具有最高的疗效，因此目前是全世界针对WD的最广泛使用的药物。然而，D-PEN的副作用很多，并且其中的几种是严重的。它们包括骨髓和免疫抑制、皮疹、口腔溃疡、恶心以及多种神经功能的退化。后面的副作用据信由D-PEN调动储存在身体组织里的铜离子并使它们重新进入循环从而提高脑中的铜浓度的能力引起。据估计大约一半用D-PEN治疗的患者将表现出神经退化，并且由于使用D-PEN，四分之一的此类患者将遭受不可逆转的神经损害。所有的这些副作用都可归因于该药是系统性地递送而没有器官特异性的事实，因而由于该药的系统毒性引起多种副作用。在另一方面，已知TTM易于水解，在胃的酸性条件下经由反应MoS4 2-+4H2O→MoO4 2-+ 4H2S释放硫化氢(H2S)。虽然由食物的厌氧消化在人的消化道内时常产生少量的H2S并可由若干酶解毒，但该气体被认为比氰化氢(HCN)对神经和循环系统的毒性更大。该事实表示TTM不适于作为药物静脉递送。而且，TTM的制造、储存和临床使用将是一个安全问题。应当指出的是，所有这些抗铜药物都基于小分子或离子(即TTM)。虽然小分子或离子更可能是可水溶的，以通过口服或静脉施用进行药物递送，但它们都有一个共同的问题，即由此类小分子或离子形成的铜复合物是不稳定的，并且在生物体液和各种固体组织之间可被再分割，使从体内清除螯合铜又慢又不完全。已知采用D-PEN治疗WD常常可调动储存在身体组织内的铜离子并将它们重新投入循环，从而增加脑中的铜浓度，导致多种神经退化性疾病。而且，这些基于小分子的药物欠缺穿透细胞对细胞内铜离子进行靶向用于消毒的能力或合适机制。它们通常用于降低体内铜离子的系统浓度，从而使组织或器官特异性的铜消耗成为不可能。总之，消耗系统铜离子而非特定组织或器官的铜离子使在患者中引起铜缺乏相关副作用的趋势增加。
发明内容
本发明总体涉及新型共价网络三元无机金属硫化物，该新型共价网络三元无机金属硫化物包含二价金属如Mg、Ca、Mn、Fe或Zn和六价金属如钼或钨，以及硫，其对于抑制癌症和其它疾病的血管生成应用可用于降低细胞内铜浓度。
共价网络化合物或共价网络固形物指这样的化合物，其中在延伸贯穿整个物质的连续网络中原子通过共价键结合。在共价键网络固形物中，没有个体分子，并且整个结构可被认为是一大分子。另外，它们不是芯壳纳米颗粒。通常的共价网络化合物在水中或任何有机溶剂中是不溶的，它们在溶液中也不离解释放可溶阳离子或阴离子。
共价网络化合物的例子包括具有连续碳原子网络的金刚石，以及具有SiO2单元的连续三维网络的二氧化硅或石英。具有共价网络结构的二元无机金属硫化合物的例子包括在自然界中发现作为矿物质闪锌矿或纤维锌矿的硫化锌、在自然界中发现作为矿物质黄铁矿的二硫化铁、在自然界中发现作为辉钼矿并在工业中广泛用作固体润滑剂的二硫化钼，以及在自然界中发现作为tustenite并在石油工业中广泛用作氢脱硫化催化剂的二硫化钨。
采用三元无机金属硫化物M1M2S4(M1独立地为Ca、Mg、Mn、Fe 或Zn；M2为Mo或W)作为对细胞内铜离子进行靶向以治疗转移癌(如膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、甲状腺癌和子宫癌)的驱铜药物(anti-copperdrugs)的最大的优点是通过二价金属离子(即Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+或Zn2+)与铜离子之间的离子交换反应，形成另一种三元金属硫化物Cu2MoS4，并释放生物上必须的二价金属离子Mg2 +、Ca2+、Mn2+、Fe2+或Zn2+，从而实现在向细胞中输送生物上必须的二价金属离子的同时降低细胞内铜浓度的最终结果。三元金属硫化物Cu2MoS4也是一种其中的铜离子被完全锁定在其晶格位置的共价网络化合物。该特征与上面提到的采用可溶小分子或离子来与铜离子螯合(其导致形成通常不稳定且可在生物体液和各种固体组织之间被重新分隔的铜络合物，使络合铜从体内的清除慢且不完全)形成鲜明对比。
本发明的另一个目的是提供适用于细胞内消耗铜以抑制血管生成的新型纳米颗粒。由于这些三元金属硫化物在水中是不溶的，带有合适表面涂层的此类化合物的纳米颗粒形式将为这些物质赋予水分散性，因而使得它们经由口服或静脉注射能够在患者体内递送。
纳米颗粒包含式M1MoS4或M1WS4，其中M1独立地为Mg、Ca、 Mn、Fe或Zn；并且所述纳米颗粒独立地具有约4纳米至约900纳米的直径。
一种制备用于治疗癌症和其它疾病的血管生成抑制剂的方法，包括向动物施用化学式为M1MoS4的二价金属M1的四硫钼酸盐 (tetrathiomolybdate)或化学式为M1WS4的二价金属M1的四硫钨酸盐 (tetrathiotungstate)，或两者，其中M1独立地为Mg、Ca、Mn、Fe或Zn。
一种减少具有癌细胞和/或人血管内皮细胞的人的细胞内铜浓度的方法，包括以下步骤：形成水分散性M1MoS4或M1WS4纳米颗粒的共价网络，其中M1独立地为Mg、Ca、Mn、Fe或Zn；以及向所述人体施用有效量的所述M1MoS4或M1WS4纳米颗粒，所述纳米颗粒能够引起离子交换反应，从而所述铜被并入所述纳米颗粒，进而从所述癌细胞和/或人血管内皮细胞消耗所述铜离子并抑制血管生成。
一种减少具有癌细胞和/或人血管内皮细胞的人的细胞内铜浓度的方法，包括以下步骤：形成水分散性M1MoS4或M1WS4纳米颗粒的共价网络，其中M1独立地为Mg、Ca、Mn、Fe或Zn，或它们的任何组合；以及施用有效量的所述M1MoS4或M1WS4纳米颗粒，以实现所述M1MoS4或M1WS4纳米颗粒的细胞摄取进入所述癌细胞和/或人血管内皮细胞，并从所述癌细胞和/或人血管内皮细胞放出铜。
一种减少人体内癌细胞和/或人血管内皮细胞的方法，包括以下步骤：形成水分散性M1MoS4或M1WS4纳米颗粒的延伸共价网络，其中M1独立地为Mg、Ca、Mn、Fe或Zn，或它们的任何组合；以及用所述M1MoS4或M1WS4化合物处理所述癌细胞和/或人血管内皮细胞并减少所述癌细胞和/或人血管内皮细胞的迁移。
一种制备M1M2S4纳米颗粒的方法，包括以下步骤：将在酰胺溶液中的碱性硫化钼或碱性硫化钨单独地与在包含巯基烷基酸和碱性氢氧化物的水溶液中的镁盐、钙盐、锰盐或铁盐反应，并生成所述M1M2S4化合物，其中M1独立地为Mg、Ca、Mn或Fe，且M2为Mo或W。
附图说明
图1示出PVP-涂覆的ZnMoS4纳米颗粒(NPs)的透射电镜(TEM) 图像；
图2示出染料标记的ZnMoS4纳米颗粒处理的HuVEC细胞的共焦荧光(右)和明场(左)图像；
图3示出PVP-涂覆的ZnMoS4纳米颗粒处理的HuVEC细胞的细胞存活率曲线；
图4示出采用ZnMoS4纳米颗粒抑制FGF-2诱导的HuVEC细胞形成管，其中上面的板(panel)：在基础培养基中用FGF-2处理的HuVEC 细胞的明场图像和钙黄绿素染色的图像，显示出形成管；下面的板：对应的图像，示出纳米颗粒的抑制效果。
图5示出了ZnMoS4纳米颗粒在HuVEC中对VEGF诱导的管形成的抑制效果；
图6示出了ZnMoS4纳米颗粒抑制了VEGF和FGF-2诱导的HuVEC 细胞；
图7示出了ZnMoS4纳米颗粒降低了HuVEC迁移能力(migration potential)；
图8示出了ZnMoS4纳米颗粒对HuVEC内皮细胞和前列腺癌细胞是非细胞毒性的；
图9示出了ZnMoS4纳米颗粒下调了VEGF在PC3前列腺癌细胞中的mRNA和蛋白质水平表达；以及
图10示出了ZnMoS4纳米颗粒降低了VEGF表达，而不影响PC3 异种移植物的肿瘤生长。
具体实施方式
本发明的纳米颗粒的制备可按下述方式进行。
本发明的一个主要目的是提供适用于细胞内消耗铜以抑制血管生成的新型纳米颗粒。通常的制备可按下述进行：将约0.1mL至约300mL、理想地约1mL至约100mL、优选地约25mL的具有1至约50个总碳原子、理想地1至约12个碳原子的巯基烷基酸(mercapto alkylacid)，优选3-巯基丙酸(3-mercaptopropionic)加入到约1mL至约200mL、理想地约2mL 至约100mL、优选地10mL的约0.01N至约18N、理想地0.1N至约10N、优选地1N的NH4OH溶液中。其它适用的氢氧化物包括NaOH、KOH、 Ca(OH)2或Na2CO3。然后将有效量的M1盐加入水中。适用的M1盐包括乙酸锌、氯化锌、硫酸锌、高氯酸锌、硝酸锌，以及非锌盐例如乙酸镁、氯化镁、硫酸镁、高氯酸镁、硝酸镁；乙酸钙、氯化钙、硫酸钙、高氯酸钙、硝酸钙；乙酸锰、氯化锰、硫酸锰、高氯酸锰、硝酸锰；乙酸亚铁、氯化亚铁、硫酸亚铁、高氯酸亚铁、硝酸亚铁；或它们的任意组合。M1盐适用的量的范围为约1mg至约250mg，理想地约100mg至约200mg，优选地约110mg至约150mg。因此，约130mg的Zn(O2CCH3)2(H2O)2被加入到约 0.1mL至约300mL、理想地约1mL至约100mL、优选地6mL的水逐滴加入上述混合物中。然后，将约1.0mg至约400mg，理想地约10mg至约300mg，优选地约130mg的碱性钼硫化物(NH4)2MoS4或(NH4)2WS4加入到约0.1mL至约500mL、理想地约1mL至约100mL、优选地约28mL的甲酰胺和水的混合物中(体积比为约0.1至约100，理想地约1至约20，优选地从1：14)。所述硫化物与水和甲酰胺的溶液在强烈搅拌下逐滴加入上述混合物，导致颜色变为土黄色。最后，将约1g至约10g、理想地约2g至约6g、优选地3.00g的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或分子量为大约8000的其它相当的分散性聚合物加入到反应混合物中，并在室温下连续搅拌约0.1 小时至约72小时，理想地约1至约24小时，优选地搅拌6小时。然后，将反应混合物用分子量为约800至约20000，理想地约1200至约12000，优选地约3000的细胞膜在蒸馏水中透析，并且冻干以提供浅棕色粉末。
在一种类似的方式中，其它血管生成抑制无机硫化物基化合物可采用钼或钨与各种所述的盐如镁、钙、锰或铁(代替锌)。即，采用基本上相同的所述加工步骤、各种化合物彼此之间的相似比将获得新的、迄今为止未曾制取过的M1M2S4化合物，其中M1为Mg、Ca、Mn、Fe，且M2为 Mo或W。因而，在本说明书的任何其它部分，当使用Zn时，包含Ca、 Mg、Mn或Fe的化合物可进行替代并使用。本发明的M1M2S4纳米颗粒的尺寸通常的范围为约4至约900纳米，理想地约10至约300纳米，且优选地为约15至约200纳米。
本发明的M1M2S4纳米颗粒理想地被封端或包含覆盖剂(即封端剂)，诸如生物相容聚合物，或水溶性聚合物，或它们的任意组合。生物相容性聚合物的例子包括右旋糖酐、聚乙二醇以及其它葡萄糖的聚合物。水溶性聚合物的例子包括聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇等等。优选的聚合物是多元醇 (N-乙烯吡咯烷酮)(polyol(N-vinylpyrrolidone))。
为了评估包括MgMoS4、MgWS4,、CaMoS4、CaWS4、MnMoS4、 MnWS4、FeMoS4以及FeWS4的不同金属三元硫化物M1M2S4在水溶液中对Cu2+离子的选择性，首选将100mg的上述化合物的样品研磨为细粉末，并密封在透析袋中，然后将透析袋浸在含50ppm水平的Cu2+离子的溶液中。在24小时的温育时间后，取出一份溶液，用2％的HNO3稀释，并用原子吸收光谱法(atomicadsorption spectrometry)进行分析，以确定铜金属离子的浓度。移除前和移除后铜金属离子的浓度的差别以铜金属离子的移除百分比表示。结果在表1中给出。
表1.各种M1MoS4和M1WS4(M1＝Mg、Ca、Mn、Fe；M2＝Mo或W)铜金属离子的移除百分比
化合物 Cu移除百分比
MgMoS4 33
MgWS4 30
CaMoS4 31
CaWS4 30
MnMoS4 36
MnWS4 32
FeMoS4 47
FeWS4 49
上述铜离子的移除百分比通常范围为约30％至约50％的铜离子移除。这些值被认为非常好，因为大量的铜离子被移除，这与从人体移除相关。即，它们移除有害的、过量的铜。更高的移除量是不期望的，因为铜对生存是必须的，而高移除量可使人受到伤害，甚至可能导致死亡。
本发明的M1MoS4或M1WS4铜消耗化合物通常可通过常规的方式加入到人体中。因此，此类物质可以如包含在水中的方式口服加入。作为另外一种选择，它们可被静脉注射到例如血管中，或者注射到肌肉中。一旦已从癌细胞和/或血管内皮细胞提取了人体内的细胞内铜浓度，它们将以自然的方式排出，如通过排尿或排便排出。
生物测定结果
所述反应混合物采用细胞膜袋在蒸馏水中进行透析(MWCO＝3000)，并冻干以提供淡褐色粉末。PVP涂覆的纳米颗粒的透射电镜(Transmission electronic microscopy，TEM)图像显示出具有窄尺寸分布(约8±2nm(图 1))的球形纳米颗粒。
在人体血管内皮细胞(HuVEC)中的PVP涂覆的ZnMoS4的细胞摄入采用共焦荧光显微技术进行了确认。在与细胞温育之前，首先将纳米颗粒与荧光染料羧基荧光素进行缀合。用所述染料标记的纳米颗粒处理过的活HuVEC细胞的荧光图像在细胞的细胞核周围区域显示出强的荧光信号，表明在细胞质中纳米颗粒的非靶分布，对该区域中的任何小细胞器不存在特异性结合。该观察结果提示出这些纳米颗粒的细胞摄入是通过内吞作用进行的(图2)。
实施例1
采用MTT方法进行细胞存活测定。HuVEC细胞接种于96孔板中，密度为每孔1×104个细胞，孔中有包含10％FBS(胎牛血清(fatal bovine serum))和1％青霉素-链霉素的内皮细胞基础生长介质-2(EBM-2)，在 37℃、5％CO2和95％空气的气氛中温育5小时以附接至表面。然后，每个孔中的细胞用包含各种浓度的纳米颗粒的100μL新鲜介质温育24小时和48小时。对照孔包含相同的介质但没有纳米颗粒。每种浓度重复三次进行测试。在上述温育期结束时，将10μL的5mg/mL的3-(4,5-二甲基噻唑 -2)-2,5-二苯基四氮唑溴(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT))加入至每个孔中并另外温育3小时。然后，将100μL的清洁剂加入至每个孔中在37℃继续温育另外4小时。最后采用BIORAD ELISA酶标仪在570nm确定吸光度。测定结果显示为活细胞百分比。存活百分比(Viability percentage)由经受处理的细胞的吸光度与未处理控制样的吸光度之比确定。结果表明在采用50μM纳米颗粒温育48小时后，细胞存活率保持在高位(>79％)(图3)。
通过ZnMoS4纳米颗粒抑制血管生成由采用血管生成的体外模型得以证明。具体地，由培养在基膜(basement membrane)提取物上的HuVEC 导管形成的诱导被用作该模型。在由纤维母细胞生长因子2(FGF2)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)处理诱导后，HuVEC细胞的长出和分枝在存在或不存在ZnMoS4纳米颗粒的情况下进行了测量。结果清楚地表明铜消耗用ZnMoS4纳米颗粒压制FGF2诱导管形成以及由HuVEC细胞的分枝 (图4)。
实施例2
M1MoS4和M1M2S4(M1独立地为Mg、Ca、Mn或Fe；M2为Mo 或W)化合物在体外血管生成模型中阻止内皮细胞管形成。所有的这些化合物都能通过下面的反应经由与三元化合物里的二价离子的离子交换降低在该模型研究中采用的内皮细胞中的铜浓度以及培养基中的铜浓度：
Cun+(n＝1或2)+M1M2S4→CuM2S4+M1 2+。
由于铜在内皮细胞管形成过程中是许多血管生成因子(包括VEGF、bFGF、血管生成素)所需的辅助因子，因此血管生成被抑制。
其它的测试进行如下：
管形成实验(tube formation assay)是一种常用来测定内皮细胞形成“管”(即，类似于血管壁的三维结构)能力的体外血管生成模型。管形成实验在采用来自马里兰州盖士堡艾美捷公司(Trevigen,Gaithersburg,MD) 的体外血管生成实验盒的96孔板形式中进行。在管形成实验前，HuVEC 细胞在培养皿中的EGM-2基础培养基中受饿过夜。为了准备试验用腔室，基膜提取物(BME)溶液放在冰箱中过夜在2-4℃的冰水浴(ice-water bath) 中变暖，然后将50μL的BME溶液分份到96孔板的每一个孔中并在37℃温育一小时以进行凝胶。收集细胞并进行计数，并制备1×106细胞/mL的单细胞悬液。在存在或不存在血管生成诱导剂VEGF(50ng/mL)或FGF2 (50ng/mL)以及M1M2S4或sulfophorane(5μM)纳米颗粒抑制剂的情况下在EBM基础培养基中稀释上述细胞。在不妨碍凝胶的BME的情况下以 1×104个细胞/每100μL的浓度将细胞加入到每个孔中，并在37℃于CO2温育器中温育16小时。在37℃将HuVEC细胞用钙黄绿素AM(2μM) 温育30分钟以对活细胞进行染色，用于成像。采用200倍的总放大倍数的荧光显微镜(485nm激发/520nm发射)使管形成可视化。对随机选择的六个视场中的每一个的分枝点数目进行计数，并对每种情况进行平均。该实验重复两次。统计显著性采用学生T-实验进行确定。
由于管形成实验是采用HuVEC细胞在VEGF处理下内皮细胞形成类似于人血管的三维结构的能力的测定，因此证明了在三元金属硫化物M1M2S4中与Mo或W结合的包括Mg、Ca、Mn、Fe和Zn的所有二价金属在上述生物实验中在抑制内皮细胞形成管方面有效。例如，采用ZnMoS4纳米颗粒的更多抑制效应的定性测定表明以下结果：相比于单独的基础培养基，VEGF(50ng/mL)导致内皮细胞管形成和分枝点的显著增加(图5A 和图5B)。但是，相比之下，当HuVEC细胞用VEGF和高剂量(50ng/mL) 或低剂量(10ng/mL)的ZnMoS4纳米颗粒处理时，在两种剂量下都具有对管形成的抑制(图5C和5D)以及分枝点的减少(图5F)。类似地，sulfophorane(一种已知的血管形成抑制剂)也阻止管形成，并在我们的试验中用作阴性对照(图5E)。管形成被定量化并表达为用ZnMoS4纳米颗粒高剂量处理的图5F所示的每个视场分枝点的平均数。
如图5所示，融合性HuVEC在EBM-2基础培养基中过夜，没有成长因子。收获HuVEC细胞、计数并在存在(板B-E)或不存在(板A) VEGF(50ng/mL)以及50ng/mL的ZnMoS4纳米颗粒(板C)和10ng/mL 的ZnMoS4纳米颗粒(板D)的情况下在EGM-2基础培养基中稀释。所述细胞在96孔板中接种在胶凝的BME上，并在37℃于5％CO2温育器中温育24小时。板E示出用血管生成抑制剂sulfophorane(5μM)处理的VEGF 诱导的细胞。管形成在明视野显微镜下可见，并得到了显微照片。示出了代表性的显微照片(放大100倍)。通过对每个视场分枝点的平均数进行计数对管形成进行定量评价。其中条表示平均值±SD(n＝6)；相比VEGF的统计显著性采用学生T-实验进行确定(p<0.05)。
实施例3：ZnMoS4和M1M2S4(M1独立地为Mg、Ca、Mn或Fe； M2为Mo或W)化合物减少HuVEC内皮细胞的迁移。内皮细胞的迁移对血管生成是必须的。内皮细胞的迁移受驱化性(chemotactic)、形合性 (hapotactic)和驱机性(mechanotactic)的刺激因子定向调控，且进一步涉及细胞外基质的降解以能够使迁移细胞进展。采用一种称为博伊登室实验(Boyden chamber assay)的体外迁移生物实验来研究纳米颗粒对HuVEC 内皮细胞迁移的影响。具体地，HuVEC细胞于35mm组织培养皿内的 EGM-2生长介质中生长直到80-90％融合。在收获之前使细胞在EBM-2基础培养基中受饿24小时，计数，并以1×106个细胞/mL在EBM-2基础培养基中重新悬浮。将50μL的细胞悬浮液与任何所列出的血管生成抑制剂低剂量纳米颗粒(10ng/mL)、高剂量纳米颗粒(50ng/mL)添加至顶室，或者将采用萝卜硫素(5μM)的对照引入到细胞培养物中。在每个孔的底室中添加150μL包含化学引诱物(VEGF(50μg/μL)或FGF-2(50μg/μL)) 的介质和上述的相同抑制剂。在37℃的CO2温育器中允许细胞迁移24小时。用100μL(1×)清洗缓冲液(艾美捷迁移实验实验盒)清洗顶室和底室，然后将100μL的结晶紫加入到底室来染色迁移细胞，并将细胞在37℃的CO2温育器温育30分钟。将100μL的细胞分离液添加到实验盘的底室并温育30分钟。在底室中的染色细胞的吸光率在OD 560nm处读取。通过测量已知数量的HuVEC细胞数量在OD560nm处的吸光率针对HuVEC细胞先前确定的标准曲线将相对吸光率转换成细胞数。迁移的细胞的百分比通过将迁移细胞数除以装载到上部腔室中总细胞数进行确定。条表示平均值±SD(n＝3)；统计显著性采用学生T-实验进行确定(p<0.05)。
在该生物实验中当采用三元金属硫化物M1M2S4中与Mo或W结合的包括Mg、Ca、Mn、Fe和Zn的二价金属时观察到HuVEC内皮细胞迁移的减少。此处，焦点是由使用ZnMoS4纳米颗粒获得的定量测量结果。首先，评估了在存在或不存在用高剂量(50ng/mL)或低剂量(10ng/mL) 处理的情况下VEGF(50μg/mL)诱导的接种HuVEC细胞的细胞迁移特性。迁移的细胞用结晶紫染色，且分离细胞的吸光率在OD560处进行测量，针对三个孔确定迁移细胞的百分比，对每个处理示出平均值。如图6A所示，相比未经处理的细胞而言，高剂量ZnMoS4处理和低剂量ZnMoS4处理两者都减少了HuVEC细胞迁移的数量。该抑制剂类似于由5μM的萝卜硫素产生的结果。该结果通过采用FGF2(50μg/mL)作为另一种血管生成诱导剂得到了证实(图6B)。还采用了一种替代方法来测试ZnMoS4对HuVEC 迁移的影响，该方法采用所谓的“创伤愈合(wound healing)”实验，其中细胞填充单层细胞中的刮伤。用无菌1000μL吸管端穿过HuVEC细胞融合单层的中心刮出伤口。在有或没有ZnMoS4纳米颗粒处理的情况下将细胞在单独的基础培养基中温育16小时(图7A)或具有VEGF(50μg/mL) 的基础培养基中温育16小时(图7B)。在刮伤时(左板)和16小时时(右板)照相，并用Image J对图像进行分析以确定在16小时时保持开放的伤口的百分比。结果表明VEGF处理的HuVEC细胞迁移并且填充了受伤区域的绝大部分。相比之下，低剂量ZnMoS4纳米颗粒比仅有VEGF降低了 HuVEC细胞的迁移(图7C)，而在高剂量时，迁移被完全阻止(图7D)。这些结果证明了ZnMoS4纳米颗粒能够降低由VEGF引发的HuVEC细胞的迁移能力。
图6-ZnMoS4纳米颗粒处理抑制了VEGF和FGF-2诱导的HuVEC 细胞迁移。在基础培养基中的HuVEC细胞(5×104个细胞/孔)与血管生成抑制剂萝卜硫素(5μM)一起或与低剂量(10ng/mL)或高剂量(50ng/mL) ZnMoS4纳米颗粒处理一起被接种到顶室内。在具有或不具有FGF-2(图 6B)或VEGF(图6A)的情况下将介质加入至底室，并包含高剂量(50ng/mL) 或低剂量(10ng/mL)的ZnMoS4纳米颗粒。根据本文所描述计算迁移细胞的平均百分比。实验重复三次。统计显著性采用学生T-实验进行确认 (p<0.05)。
图7-ZnMoS4纳米颗粒降低了HuVEC迁移能力。融合的HuVEC 细胞用吸管端刮伤(板A-D)。将细胞在单独的基础培养基中温育16小时 (板A)或具有VEGF(50ug/mL)(板B-D)并由低剂量(10ng/mL)ZnMoS4纳米颗粒处理(板C)或高剂量(50ng/mL)ZnMoS4纳米颗粒处理(板D)的基础培养基中温育16小时(图7B)。刮伤的区域在0小时和16小时处照相。每种情况示出一张代表性显微照片(放大100倍)。保持开放的“伤口”的面积由Image J测量，并确定四个图像的平均开口面积。板E以迁移的平均开口面积百分比示出了细胞迁移的定量评价。其中的条代表平均值±SD(n＝4)；与VEGF相比，p<0.05。
实施例4：ZnMoS4和M1M2S4(M1独立地为Mg、Ca、Mn或Fe； M2为Mo或W)化合物对血管内皮细胞和前列腺癌细胞(即PC3和LNCaP 细胞)是无毒的。采用MTT细胞增值实验来测量细胞存活性和细胞增值以定量化细胞群对ZnMoS4和M1M2S4(M1独立地为Mg、Ca、 Mn或Fe；M2为Mo或W)化合物纳米颗粒的响应。测试了这些纳米颗粒是否对上述三种细胞系的增值和存活性有负面影响。MTT细胞存活性实验基于在活的新陈代谢活跃细胞中形成的溶解的MTT(四唑盐3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)甲臜晶体，其正比于活细胞的数量。将106个/mL的单细胞悬浮液(每孔104个细胞)接种在96孔板中。以不同的浓度(0-150μM)将纳米颗粒加入到基础培养液中以将每孔的总体积变成 100μL。作为控制，将细胞毒性剂量的依托泊苷(etoposide)加至一些孔中以代替纳米颗粒。将细胞温育过夜，然后将MTT剂和清洁剂加入到每个孔中，并将细胞在暗处再温育2小时。每个孔中的吸光率在酶标仪中 570nm处进行测量，并且三个孔的平均值通过减去每种处理条件下的空白的平均值来确定。活细胞的百分数通过将纳米颗粒处理的孔的吸光率除以未处理的孔的吸光率计算确定。进行学生T-实验来确定显著性。
发现ZnMoS4和M1M2S4(M1独立地为Mg、Ca、Mn或Fe；M2为 Mo或W)化合物的纳米颗粒对实验的三个细胞系是无毒的。下面给出的代表性数据由采用ZnMoS4纳米颗粒获得。首先，ZnMoS4纳米颗粒在宽广的浓度范围内没有降低HuVEC细胞存活率。尤其引人注目的是，当细胞被150μM的ZnMoS4纳米颗粒处理时，发现高于80％的细胞存活率。第二，ZnMoS4纳米颗粒不降低PC3和LNCaP细胞的细胞存活率。类似地，在150μM的ZnMoS4纳米颗粒的情况下，对于PC3和LNCaP细胞两者，发现高于80％的细胞是存活的(图8B和图8C)。总之，ZnMoS4纳米颗粒对HuVEC和前列腺癌细胞系都是无毒的，从而提示出ZnMoS4纳米颗粒抑制管形成，而不杀死细胞。
图8：ZnMoS4纳米颗粒对血管内皮细胞和前列腺癌细胞是非细胞毒性的。A.用ZnMoS4纳米颗粒或依托泊苷温育24小时后的HuVEC细胞的存活率由MTT实验进行测量。示出的是相比于仅由溶剂(0μM的ZnMoS4纳米颗粒)处理的细胞的存活百分比。还测量了用ZnMoS4纳米颗粒或依托泊苷温育24小时后的PC3存活率(板B)和LNCaP的存活率(板 C)。描述如A。用细胞毒素浓度的依托泊苷的处理用作细胞毒性阳性对照。其中的条表示±SD(n＝3)；通过学生T-实验来确定统计显著性，在ZnMoS4纳米颗粒处理的细胞的生存能力与未经处理的对照之间不存在统计学上的差异。
实施例5：ZnMoS4和M1M2S4(M1独立地为Mg、Ca、Mn或Fe； M2为Mo或W)化合物的纳米颗粒下调VEGF的mRNA和蛋白质表达。为了确定VEGF mRNA表达是否因ZnMoS4纳米颗粒处理而降低，融合的单层PC3细胞经受血清饥饿整夜，然后用高剂量(50ng/mL)或低剂量 (10ng/mL)的ZnMoS4纳米颗粒处理24小时。图9A示出了由TaqMan 定量聚合酶链反应(Taqmanquantitative PCR)测量的VEGF mRNA表达对ZnMoS4纳米颗粒的响应并归一化至18S mRNA。如图9A所示，相比于未处理的对照，在低剂量和高剂量的ZnMoS4纳米颗粒处理时，VEGF表达都显著降低。考虑到在ZnMoS4纳米颗粒处理后mRNA降低，还通过在低剂量和高剂量处的ZnMoS4纳米颗粒处理在PC3细胞中检验了VEGF蛋白质表达。如图9B所示，在低剂量ZnMoS4纳米颗粒处理时，VEGF蛋白质表达降低，且在高剂量处理24小时后检测不到。
图9：ZnMoS4纳米颗粒下调VEGF在PC3前列腺癌细胞中的mRNA 和蛋白质表达。(A)VEGF在用低剂量(10ng/mL)或高剂量(50ng/mL) 的ZnMoS4纳米颗粒处理的PC3前列腺癌细胞中的mRNA表达采用Taqman 实时荧光定量PCR(Taqman q RT PCR)测量。采用18S rRNA表达来使VEGF表达归一化。数值表示出相对于未处理的对照的成倍变化。进行学生T-实验来确定统计显著性。(*p<0.05)。(B)VEGF在用低剂量(10ng/mL) 或高剂量(50ng/mL)的ZnMoS4纳米颗粒处理24小时的PC3细胞中的蛋白质表达。带有40μg蛋白质的免疫印迹(Westernblot)用多克隆VEGF 抗体和抗兔HRP结合的二级抗体进行探测。由ECL温育和Fuji LAS3000 检测系统进行可视化。将印迹剥离并采用b-肌动蛋白抗体(b-actin antibody) 作为加载对照进行重新探测。
实施例6：ZnMoS4纳米颗粒降低VEGF表达而不影响PC3异种移植物的肿瘤生长。ZnMoS4纳米颗粒的肿瘤治疗通过监控免疫功能不全雄性小鼠(nu/nu品系，杰克逊实验室(Jackson Laboratory))中的肿瘤生长和血管生成进行了检验。将大约6×106个PC3细胞悬浮在0.1mL的无菌不含血清的培养基中，然后皮下注射到24个雄性裸鼠的右腰胁(rightflank) 内。在肿瘤注射48小时后，裸鼠分三组处理，第一组腹腔注射0.1mL无菌PBS对照，第二组注射高剂量(2mg/裸鼠)的ZnMoS4纳米颗粒和PBS 的混合物，第三组注射低剂量(0.2mg/裸鼠)的ZnMoS4纳米颗粒。每周用千分尺测量肿瘤尺寸，并且肿瘤体积由下式计算：长×宽2×0.5236。28 天后，或如果肿瘤体积大于500mm3，对裸鼠施行安乐死，收集肿瘤并称重。结果显示ZnMoS4纳米颗粒没有降低平均或中值肿瘤重量(图10A) 或肿瘤体积(图10B)。但是，观察到两个处理组(10mg/kg低剂量组和 100mg/kg高剂量组)中肿瘤重量有大变化。对于用高剂量的ZnMoS4纳米颗粒处理的裸鼠，相比对照组更频繁地观察到更小重量的肿瘤。肿瘤重量的偏差可能与处理有关。然而，用千分尺测量的肿瘤体积并未显示出这种变化。这些观察结果与ZnMoS4纳米颗粒对PC3细胞无毒的事实一致，因此不能作为抗癌药发挥作用。然而，由VEGF表达指示的血管生成水平受到处理的影响，即，根据实时PCR定量，ZnMoS4在低剂量处理组和高剂量处理组中都降低了VEGF mRNA表达(图10C)，从而确认了该药物在动物模型中可抑制血管生成，因而具有治疗癌转移的潜力。
图10：ZnMoS4纳米颗粒降低VEGF表达而不影响PC3异种移植物的肿瘤生长。在每一处理中，测量8只裸鼠的肿瘤重量(板A)和体积(板 B)，并与每组的中值一起显示。板C示出了在13个肿瘤样品中测得的 VEGF基因表达。RNA提取自冷冻裸鼠肿瘤样品。按照文本中的描述采用 VEGF和18S(归一化子)引物进行TaqMan Q RT-PCR。所显示的是在用 ZnMoS4纳米颗粒(高剂量和低剂量)处理的裸鼠的PC3肿瘤组织中的18S 归一化的VEGF表达相对于未经处理的肿瘤组织中的18S归一化的VEGF 表达之比。统计显著性由学生T-实验进行确定，相比未经处理的控制组， p<0.05。
尽管根据专利法的规定，本发明已经描述了最佳实施方式和优选的实施例，但是本发明的保护范围并不局限于此，而是由所附的权利要求书的范围进行限定。

Claims (20)

1.纳米颗粒，所述纳米颗粒包括：
式M1MoS4或M1WS4，其中M1独立地为Mg、Ca、Mn或Fe，并且所述纳米颗粒独立地具有约4纳米至约900纳米的直径。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒是由共价键延伸的连续网络结构。
3.根据权利要求2所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒用封端剂进行表面改性，所述封端剂包括生物相容性聚合物，或水分散性聚合物，或两者。
4.一种用于癌细胞和/或血管内皮细胞处理的组合物，所述组合物包含权利要求3所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的颗粒大小为约10纳米至约300纳米，并且其中所述M1MoS4或M1WS4通过消耗来自所述癌细胞和/或血管内皮细胞的铜来抑制血管生成。
5.一种制备用于治疗癌症或其它疾病的血管生成抑制剂的方法，所述方法包括：向动物施用化学式为M1MoS4的二价金属M1的四硫钼酸盐或化学式为M1WS4的二价金属M1的四硫钨酸盐，或两者，其中M1独立地为Mg、Ca、Mn、Fe或Zn。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述二价金属的四硫钼酸盐或所述二价金属的四硫钨酸盐的纳米颗粒的大小独立地为约4纳米至约900纳米。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述纳米颗粒为连续的共价键结合网络，
将所述纳米颗粒施用给带有癌细胞和/或血管内皮细胞的人，以及
抑制所述癌细胞和/或血管内皮细胞的血管生成。
8.一种减少带有癌细胞和/或人血管内皮细胞的人的细胞内铜浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
形成水分散性M1MoS4或M1WS4纳米颗粒的共价网络，其中M1独立地为Mg、Ca、Mn、Fe或Zn；以及
向所述人施用有效量的所述M1MoS4或M1WS4纳米颗粒，所述纳米颗粒能够引起离子交换反应，从而所述铜被并入所述纳米颗粒，进而从所述癌细胞和/或人血管内皮细胞消耗过量的铜离子，并抑制血管生成。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述纳米颗粒的颗粒大小为约4纳米至约900纳米。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述纳米颗粒的颗粒大小为约10纳米至约300纳米，并且所述纳米颗粒对于人血管内皮细胞是非细胞毒性的。
11.一种减少带有癌细胞和/或人血管内皮细胞的人的细胞内铜浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
形成水分散性M1MoS4或M1WS4纳米颗粒的共价网络，其中M1独立地为Mg、Ca、Mn、Fe或Zn，或它们的任何组合；以及
向所述人施用有效量的所述M1MoS4或M1WS4纳米颗粒，以实现所述M1MoS4或M1WS4纳米颗粒的细胞摄取进入所述癌细胞和/或人血管内皮细胞，并从所述癌细胞和/或人血管内皮细胞放出铜。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述纳米颗粒的颗粒大小为约4纳米至约900纳米。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述纳米颗粒的颗粒大小为约10纳米至约300纳米。
14.一种减少人体内癌细胞和/或人血管内皮细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
形成M1MoS4或M1WS4纳米颗粒的水分散性延伸共价网络，其中M1独立地为Mg、Ca、Mn、Fe或Zn，或它们的任何组合；以及
用所述M1MoS4或M1WS4化合物处理所述癌细胞和/或人血管内皮细胞并减少所述癌细胞和/或人血管内皮细胞的迁移。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述纳米颗粒的颗粒大小为约4纳米至约900纳米。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述纳米颗粒的颗粒大小为约10纳米至约300纳米，并且其中所述纳米颗粒对于人血管内皮细胞是非细胞毒性的。
17.一种制备M1M2S4纳米颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：
将在酰胺溶液中的碱性硫化钼或碱性硫化钨独立地与在包含巯基烷基酸和碱性氢氧化物的水溶液中的镁盐、钙盐、锰盐或铁盐反应，并生成所述M1M2S4化合物，其中M1独立地为Mg、Ca、Mn、或Fe，且M2为Mo或W。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述碱性氢氧化物为NaOH、KOH、Ca(OH)2或Na2CO3，并且所述盐为非锌盐，所述非锌盐包括乙酸镁、氯化镁、硫酸镁、高氯酸镁、硝酸镁；乙酸钙、氯化钙、硫酸钙、高氯酸钙、硝酸钙；乙酸锰、氯化锰、硫酸锰、高氯酸锰、硝酸锰；乙酸亚铁、氯化亚铁、硫酸亚铁、高氯酸亚铁、硝酸亚铁，或它们的任意组合。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述巯基烷基酸为3-巯基丙酸。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述碱性硫化钼为(NH4)2MoS4或(NH4)2WS4。
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