CN107188937B - 一种抗多重耐药葡萄球菌感染药物rip1183的制备方法 - Google Patents

一种抗多重耐药葡萄球菌感染药物rip1183的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种抗多重耐药葡萄球菌感染药物RIP1183的制备方法，以RinkAmideMBHAResin、MBHA Resin、Rink Amide‑AM Resin以上树脂中的任何一种为起始原料，按照固相合成的方法，通过制备Fmoe‑Phe‑MBHAResin、制备Fmoc‑Asn（Trt）‑Phe‑MBHAResin和制备Fmoc‑Thr（tBu）‑Asn（Trt）‑Phe‑MBHAResin等步骤，制备出粗品并纯化，获得所需的RIP1183纯品。本发明制备方法具有以下特点：工艺稳定，质量可控，产品纯度高，可规模化生产。

Description

一种抗多重耐药葡萄球菌感染药物RIP1183的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域发明，涉及抗多重耐药葡萄球菌感染药物多肽RIP1183的制备方法，尤其适用于规模化生产。
背景技术
RNAIII抑制肽(RNAIII inhibiting pepnde，缩写RIP)是近年来发现的葡萄球菌群体感应机制的有效抑制剂，可以阻断葡萄球菌细胞间的信号传导通路，从而抑制葡萄球菌的生物被膜形成，防止葡萄球菌感染。天然的RNAIII抑制肽由凝固酶阴性葡萄球菌菌株产生，而人工制备该类多肽多采用固态合成方法。但是，以往的制备方法存在很多缺点，如工艺不稳定，收率较低，质量可控性较差，产品纯度不高，生产周期长，不利于工业化生产；制备过程中使用氟化氢，对环境造成严重污染等。申请人在实验室采用新的固态合成方法，自主合成了具有抗多重耐药葡萄球菌感染作用的RNAIII抑制肽，命名为RIP1183。
发明内容
本发明的目的是利用多肽固相合成和纯化技术，建立一种RNAIII抑制肽RIP1183的制备方法，为RNAIII抑制肽的大规模应用提供原料保障。
本发明的目的是这样实现的：一种抗多重耐药葡萄球菌感染药物RIP1183的制备方法，RIP1183是由7个氨基酸组成的多肽，其化学名称：乙酰-L-酪氨酰-L-赖氨酰-L-脯氨酰-L-缬胺酰-L-苏氨酰-L-谷氨酰胺-L-苯丙酰胺；化学结构：Ac-Tyr-Lys-Pro-Val-Thr-Asn-Phe-NH2
其特征在于：制备抗多重耐葡萄球菌感染药物RIP1183的方法，包括RIP1183的固相合成和纯化方法，合成的主要原料为合成树脂和前述7种含有芴甲氧羰酰基(Fmoc-)保护基团氨基酸；制备RIP1183方法包括如下基本步骤：
(1)以Rink Amide MBHA Resin、MBHA Resin、Rink Amide-AM Resin其中的任何一种树脂为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有芴甲氧羰酰基保护的氨基酸；
(2)依次脱去合成用氨基酸上的芴甲氧羰酰基保护基团，用DIEA/HOBt、DIEA/HOAt、TBTU/HOBt、TBTU/HOAt、HBTU/HOBt、HBTU/HOAt、HATU/HOBt、HATU/HOAt或HCTU中的一种为缩合剂进行接肽反应，获得保护的树脂；
(3)同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得粗品；
(4)任选经C18或C8色谱柱进行分离纯化，获得RIP1183。
本发明的目的还可以这样实现：进行接肽反应，获得保护的树脂的方法为：
(1)制备Fmoc-Phe--树脂：
以Rink Amide MBHA Resin树脂，用N,N-二甲基甲酰胺或二氯甲烷浸泡溶胀，加入脱帽试剂脱帽(脱去氨基酸上的保护基团，此处为Fmoc-)，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂脱帽，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测呈阳性，抽干，再加入用DMF溶解的Fmoc-Phe-OH及缩合剂进行接肽反应，洗涤树脂获得Fmoc-Phe-树脂；
树脂的重量体积浓度为5-20ml/g；
缩合剂的摩尔数为树脂的2～20倍；
Fmoc-Phe-OH的摩尔数为树脂的1～10倍；
(2)制备Fmoc-Asn(Trt)-Phe-树脂：
在步骤(1)的Fmoc-Phe-树脂中，加入脱帽试剂脱帽，抽干，再次加入脱帽试剂脱帽，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测呈阳性，抽干，加入用DMF溶解的Fmoc-Asn(Trt)-OH及缩合剂进行接肽反应，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Asn(Trt)-Phe-树脂；
Fmoc-Asn(Trt)-OH的摩尔数为树脂的1-5倍；
Fmoc-Asn(Trt)-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；
缩合剂的摩尔数为树脂的2-5倍；
(3)制备Fmoc-Tyr(tBu)-Lys(Boc)-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-树脂；
重复步骤(2)的方法，按照RIP1183的氨基酸序列(Ac-Tyr-Lys-Pro-Val-Thr-Asn-Phe-NH2)依次接入剩余的5个氨基酸，获得Fmoc-Tyr(tBu)-Lys(Boc)-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-树脂；
具体操作方法：按照步骤(2)的方法，在上一步的肽-树脂中，加入脱帽试剂脱帽两次，茚三酮检测呈阳性，抽干，按照RIP1183的氨基酸序列，依次加入用DMF溶解的相应Fmoc-氨基酸和缩合剂进行接肽反应，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干，获得相应的Fmoc-氨基酸-Asn(Trt)-Phe-树脂；重复进行此氨基酸接入反应，按照RIP1183的氨基酸序列，将剩余的氨基酸接完，获得Fmoc-Tyr(tBu)-Lys(Boc)-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-树脂；
依次接入的相应Fmoc-氨基酸为Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH和Fmoc-Tyr(tBu)-OH，
所接入Fmoc-氨基酸的摩尔数为树脂的2～5倍：
(4)Ac-Tyr-Lys-Pro-Val-Thr-Asn-Phe-树脂的制备：
在步骤(3)的Fmoc-Tyr(tBu)-Lys(Boc)-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-树脂中，加入脱帽试剂脱帽，抽干，再次脱帽，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测呈阳性，抽干，依次用异丙醇、DMF洗涤，加入乙酸酐、DIEA、DCM混合液进行乙酰化反应，抽干，依次用异丙醇、DMF、，甲醇洗涤，再用甲醇浸泡，抽干，用氮气吹干树脂成很干的颗粒，所得到的树脂为Ac-Tyr(tBu)-Lys(Boc)-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe树脂；
(5)制备Fmoc-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-树脂：
在步骤(4)的Fmoc-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe--树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测呈阳性，抽干，加入用DMF溶解的Fmoc-Pro-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBt的混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-树脂
Fmoc-Pro-OH摩尔数为树脂的2～5倍：
(6)制备Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe--树脂：
在步骤(5)的Fmoc-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，异丙醇洗涤2次，用DMF洗涤2次，茚三酮检测呈阳性，抽干，加入用DMF溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBtt的混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe---树脂；
Fmoc-Lys(Boc)-OH摩尔数为树脂的2～5倍：
(7)制备Fmoc-Tyr(tBu)-Lys(Boc)-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-树脂：
在步骤(6)的Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe--树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测呈阳性，抽干，加入用DMF溶解的Fmoc-Tyr(tBu)-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBt的混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测呈阳性，抽干，用乙酸酐、DIEA、DCM混合液进行乙酰化，反应1-2小时，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，甲醇洗涤2次，用甲醇浸泡0.5～3小时，抽干，用氮气吹干树脂成很干的颗粒，所得到的树脂为Ac-Tyr(tBu)-Lys(Boc)-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe树脂。
粗品的获得步骤如下：
把吹干的Ac-Tyr(tBu)-Lys(Boc)-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe树脂倒入玻璃的切割瓶中，加入预冷至-20～10℃的切肽试剂(TFA/Tis/H2O＝90-95/5-2.5/5-2.5，体积比)，10℃-50℃反应1-5小时，过滤除去树脂，切割液加适量的二氯甲烷进行悬蒸，温度控制在39℃±1℃，将悬蒸好的切割液，放冷，迅速加入-20～10℃的冰乙醚沉淀，离心收集沉淀物，用10％的冰乙酸和30％的乙腈混合液溶解，低温冷冻干燥10～24小时，获得粗品；
粗品经C18或C8色谱柱进行分离纯化的步骤：
将粗品溶于水溶液中，水浴溶解，过滤，滤液经C18或C8色谱柱纯化，流动相有两种：A：0.1％三氟乙酸加99.9％水；B：0.1％三氟乙酸加99.9％乙腈；梯度洗脱；流速为1-150ml/min；检测波长为：215～285nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，冻干，获得成品。
本发明的有益效果是：本发明的RIP1183固相合成制备方法具有以下特点：，工艺稳定，质量可控，产品纯度高，可规模化生产。
另外，在本发明的工艺中，采用温和的Fmoc路线，每步脱Fmoc仅用20％的PIP，每步缩合反应时间短，大大缩短了生产周期；采用合理封闭技术，提高粗肽产品的纯度；切割采用TFA，避免了常用的氟化氢，减少了生产中产生的三废，有利于工业化生产。
附图说明
图1.HPLC测定RIP1183小批量纯品的纯度图谱
图2.质谱鉴定RIP1183小批量纯品分子量图谱
图3.HPLC测定RIP1183中试规模粗品纯度的图谱
图4.RIP1183中试规模粗品的纯化图谱
图5.RIP1183中试规模纯化样品的HPLC测定图谱
图6 RIP1831中试试验样品的氨基酸组成检测报告
图7 RIP1831中试试验样品的氨基酸序列检测报告
图8 RIP1183对MRSA-LAC感染所致脓毒症小鼠的生存率的影响
具体实施方式
一、RIP1183信息
RIP是RNAⅢInhibiting Peptide(RNAⅢ抑制肽)的缩写，1183为申请人实验筛选过程中选用的编号，因此将本发明抗多重耐葡萄球菌感染药物命名为RIP1183。本申请主要解决的问题是提供一种制备抗多重耐葡萄球菌感染药物RIP1183的方法，包括RIP1183的固相合成和纯化的方法。
本发明的固相合成多肽RIP1183(C44H64N10O11)，分子量为909，氨基酸序列为CH3CO-YKPVTNF-CONH2。
二、RIP1183的制备方法
本发明的固相多肽合成RIP1183肽的方法，包括以下步骤：
以Rink Amide MBHA Resin、MBHA Resin、Rink Amide-AM Resin以上树脂中的任何一种为起始原料，按照固相合成的方法，根据RIP1183的氨基酸序列，依次连接相应的具有Fmoc保护的氨基酸，其间依次脱去Fmoc保护基团，用DIEA/HOBt或DIEA或TBTU/HOAt/HOBt或HBTU/HOBt或HBTU/HOAt或HATU/HOBt或HATU/HOAt或HCTU/HOBt中的一种为缩合剂进行接肽反应，得到相应的RIP1183树脂后，同步进行脱侧链保护基团及最后切肽，获得RIP1183粗品，并经C18或C8色谱柱进行分离纯化，获得所需的RIP1183纯品。
按照本发明，制备RIP1183肽树脂和粗品的步骤如下：
(1)制备Fmoe-Phe-树脂：
以Rink Amide MBHA Resin树脂，用N,N-二甲基甲酰胺或二氯甲烷浸泡10～60分钟，混合物中，树脂的重量体积浓度为5-20ml/g；
然后在上述的树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测呈阳性，抽干，再加入用DMF溶解的Fmoc-Phe-OH，DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBt的混合物，10～50℃反应0.5～5小时，树脂用异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺洗涤，获得Fmoc-Phe-树脂；
DIEA的摩尔数为树脂的2～20倍；
Fmoc-Phe-OH的摩尔数为树脂的1～10倍：
反应溶液中，树脂的浓度为0.1～5ml/g；
反应溶液中，树脂的浓度为0.1～5ml/g；
(2)制备Fmoc-Asn(Trt)-Phe树脂：
在步骤(1)的Fmoc-Phe-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测呈阳性，抽干，加入用DMF溶解的Fmoc-Asn(Trt)-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBt的混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Asn(Trt)-Phe-树脂；
所说的脱帽试剂的组分和体积比为：PIP：DMF＝1：2-5，下同；
Fmoc-Asn(Trt)-OH的摩尔数为树脂的1-5倍；
Fmoc-Asn(Trt)-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；
TBTU/HBTU的摩尔数为树脂的2-5倍；
HOBt/HOAT摩尔数为树脂的2-5倍；
(3)制备Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-树脂：
在步骤(2)的Fmoc-Asn(Trt)-Phe-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测呈阳性，抽干，加入用DMF溶解的Fmoc-Thr(tBu)-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBt的混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-脂；
Fmoc-Thr(tBu)-OH摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上；
(4)制备Fmoc-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-树脂：
在步骤(3)的Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测呈阳性，抽干，加入用DMF溶解的Fmoc-Val-OH、DIEA、TBTUl/HOBt或HBTU/HOBt的混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe--树脂；
Fmoc-Val-OH摩尔数为树脂的2～5倍：
(5)制备Fmoc-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-树脂：
在步骤(4)的Fmoc-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe--树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测呈阳性，抽干，加入用DMF溶解的Fmoc-Pro-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBt的混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-树脂
Fmoc-Pro-OH摩尔数为树脂的2～5倍：
(6)制备Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe--树脂：
在步骤(5)的Fmoc-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，异丙醇洗涤2次，用DMF洗涤2次，茚三酮检测呈阳性，抽干，加入用DMF溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBtt的混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe---树脂；
Fmoc-Lys(Boc)-OH摩尔数为树脂的2～5倍：
(7)制备Fmoc-Tyr(tBu)-Lys(Boc)-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-树脂：
在步骤(6)的Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe--树脂中，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测呈阳性，抽干，加入用DMF溶解的Fmoc-Tyr(tBu)-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBt的混合物，10～50℃反应10～60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干，加入脱帽试剂10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测呈阳性，抽干，用乙酸酐、DIEA、DCM混合液进行乙酰化，反应1-2小时，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，甲醇洗涤2次，用甲醇浸泡0.5～3小时，抽干，用氮气吹干树脂成很干的颗粒，所得到的树脂为Ac-Tyr(tBu)-Lys(Boc)-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe树脂；
(8)粗品的获得
把吹干的Ac-Tyr(tBu)-Lys(Boc)-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe树脂倒入玻璃的切割瓶中，加入预冷至-20～10℃的切肽试剂(TFA/Tis/H2O＝90-95/5-2.5/5-2.5体积比)，10℃-50℃反应1-5小时，过滤除去树脂，切割液加适量的二氯甲烷进行悬蒸，温度控制在39℃±1℃，将悬蒸好的切割液，放冷，迅速加入-20～10℃的冰乙醚沉淀，离心收集沉淀物，用10％的冰乙酸和30％的乙腈混合液溶解，低温冷冻干燥10～24小时，获得粗品；
按照本发明，粗品经C18或C8色谱柱纯化的方法包括如下步骤：
流动相有两种：A：0.1％三氟乙酸加99.9％水；B：0.1％三氟乙酸加99.9％乙腈；梯度洗脱；流速为1-150ml/min；检测波长为：215～285nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后去盐，冻干，获得成品。
尽管理论上有HOBt或HOAt或HBTU/HOBt或HBTU/HOAt或HATU/HOBt或HATU/HOAt或HCTU/HOBt或HUTC/HOAt或TBTU/HOBt等试剂可以选择，而且理论上也没有重大区别。但是令人意想不到的是，尽管小试阶段各试剂效果差异不显著，但是进入中试阶段(即，实验放大)，我们发现用TBTU/HOBt反应粗品纯度较好，小试试验粗品纯度达到95％以上，中试批量生产粗品纯度达到92％以上(HPLC归一化法)。
表1.前述过程中所采用的原料中英文列表
Figure BDA0001255849610000091
Figure BDA0001255849610000101
实施例1 1g级别Rink Amide MBHA Resin树脂的RIP1183合成过程：
(1)制备Fmoe-Phe-MBHA Resin
称取Rink Amide MBHA Resin 1g(吉尔生化(上海)有限公司；上样：1.0mmol/g)倒入反应柱中，加入大约10mlDMF，浸泡30分钟(常温)后用真空泵抽干，加入脱帽试剂(20％哌啶的DMF溶液)10～50℃反应5～30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10～50℃反应10～60分钟，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测呈阳性，抽干，加入Fmoc-Phe-OH 0.54g，TBTU0.45g、DMF 10ml、HOBt 1ml、DIEA 0.4ml，于常温反应2小时，茚三酮检测显阴性，树脂用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Phe-MBHA Resin；
(2)制备Fmoc-Asn(Trt)-Phe-MBHA Resin
在步骤(1)的Fmoe-Phe-MBHA Resin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的DMF溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂，常温反应20分钟，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阳性，抽干，加入Fmoc-Asn(Trt)-OH 0.84g，TBTU 0.45g、HOBt 1ml、DIEA 0.4ml、DMF 10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阴性，抽干，获得Fmoc-Asn(Trt)-Phe-MBHA Resin；
(3)制备Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-MBHA Resin
在步骤(2)的Fmoc-Asn(Trt)-Phe-MBHA Resin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的DMF溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂，常温反应20分钟，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阳性，抽干，加入Fmoc-Thr(tBu)-OH 0.56g，TBTU 0.45g、HOBt 1ml、DIEA 0.4ml、DMF 10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阴性，抽干，获得Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-MBHA Resin；
(4)制备Fmoc-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-MBHA Resin
在步骤(3)的Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-MBHAResin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的DMF溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂，常温反应20分钟，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阳性，抽干，加入Fmoc-Val-OH 0.48g，TBTU 0.45g、HOBt1ml、DIEA 0.4ml、DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阴性，抽干，获得Fmoc-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-MBHA Resin
(5)制备Fmoc-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-MBHA Resin
在步骤(4)的Fmoc-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-MBHA Resin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的DMF溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂，常温反应20分钟，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阳性，抽干，加入Fmoc-Pro-OH 0.47g，TBTU 0.45g、HOBt 1ml、DIEA0.4ml、DMF 10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阴性，抽干，获得Fmoc-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-MBHAResin；
(6)制备Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-MBHA Resin
在步骤(5)的Fmoc-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-MBHA Resin中，加入脱帽试剂(20％哌啶的DMF溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂，常温反应20分钟，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阳性，抽干，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH 0.66g，TBTU0.45g、HOBt 1ml、DIEA 0.4ml、DMF 10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阴性，抽干，获得Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-MBHA Resin
(7)制备Fmoc-Tyr(tBu)-Lys(Boc)-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-MBHAResin
在步骤(6)的Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-MBHA Resin
中，加入脱帽试剂(20％哌啶的DMF溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂，常温反应20分钟，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阳性，抽干，加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH 0.7g，TBTU 0.45g、HOBt 1ml、DIEA 0.4ml、DMF 10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阴性，抽干，加入脱帽试剂(20％哌啶的DMF溶液)，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂，常温反应20分钟，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测呈阳性，抽干,用乙酸酐、DIEA、DCM混合液进行乙酰化，反应1-2小时，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，甲醇洗涤2次，用甲醇浸泡0.5～3小时，抽干，用氮气吹干树脂成很干的颗粒，所得到的树脂为AC-Tyr(tBu)-Lys(Boc)-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-MBHA Resin
(8)制备粗品
把吹干的AC-Tyr(tBu)-Lys(Boc)-Pro-Val-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Phe-MBHA Resin倒入玻璃的切割瓶中，加入预冷的切肽试剂(TFA 9.5ml、H2O 0.25ml、Tis0.25ml)，常温反应1.5小时，过滤除去树脂，切割液加适量的二氯甲烷进行悬蒸，温度控制在39℃±1℃，将悬蒸好的切割液，放冷，加冰乙醚500ml沉淀，3500转3分钟离心收集沉淀物，用10％的冰乙酸和30％的乙腈混合液溶解，低温冷冻干燥24小时，获得RIP1183粗品0.69g，经HPLC测定纯度为80％。
(9)纯化
将步骤(8)的RIP1183粗品0.69g溶于13ml水中，水浴溶解，过滤，滤液上样于C18色谱柱(Kromasil-C18，20mm*250mm,汉邦科技色谱公司)，流动相为如下A、B液体的混合物：A：0.1％三氟乙酸加99.9％水；B：0.1％三氟乙酸加99.9％乙腈。从A液体占混合物比例100％开始梯度洗脱，期间B液体占混合物比例逐渐升高，直至占100％，流速为10ml/min，检测波长为：215nm。收集目标峰(用相同条件下以实验室级别生产的少量纯品做对照指示目标峰)的流出液，浓缩冻干，获得成品，共获得成品0.47g(MW：909)，经HPLC测定纯度大于98％，质谱测定结果与RIP1183理论分子量一致，结果如图1和图2所示。
实施例2中试规模的RIP1183合成过程(以20150601批为例)
参照实施例1的具体过程，所不同的是所有试剂直接放大30倍，即称取Rink AmideMBHA Resin 30g(Loadding：1.0mmol/g)进行反应，也以实施例1的TBTU/HOBt反应，制备树脂-肽接合物，切割制备粗肽，共得粗品22.6g，HPLC检测纯度为97.85％。按实施例1中的纯化方法纯化粗肽，色谱柱可用大一号的(Kromasil-C18，30mm*250mm,汉邦科技色谱公司)，可分多次上样，分别收集目标峰的流出液，最后合并，浓缩冻干，得成品15.8g，HPLC测定纯化后RIP1183纯度大于98％。中试生产RIP1183粗品的纯度、纯化结果和纯品纯度分析，如图3-5，试验结果见表2
表2三批RIP1183中试试验结果
Figure BDA0001255849610000131
经对RIP1183中试试验样品(20160601批)的氨基酸组成和序列的分析，RIP1183由酪氨酸、赖氨酸、脯氨酸、缬胺酸、苏氨酸、谷氨酰胺和苯丙氨酸组成(谷氨酰胺，具体数值见检测报告(图6)；RIP1183的氨基酸序列为Ac-Tyr-Lys-Pro-Val-Thr-Asn-Phe-NH2，检测报告见图7。
三、RIP1183药效学结果
(1)菌液的制备：按照1：10比例将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA-LAC接种于TSB肉汤培养基中，37℃震荡培养过夜。
(2)最小致死菌量的确定：将新鲜培养的细菌菌液用TSB肉汤2倍比稀释成3个浓度，分别腹腔注射感染小鼠，每组4只，连续观察7天，记录动物死亡状况，分别确定MRSA-LAC在1-2天内导致BALB/c小鼠100％死亡的菌量，即最小致死菌量。
(3)实验分组：挑选8-10周龄、体重18-22g的健康雄性BALB/c小鼠，适应性饲养一周后，随机分组，包括①PBS对照组；②万古霉素组：10mg/kg，0.4ml；③RIP1183低剂量组：5mg/kg，0.4ml；④RIP1183中剂量组：10mg/kg，0.4ml；⑤RIP1183高剂量组：20mg/kg，0.4ml。不同实验组小鼠分别在感染1h后腹腔注射给药。
(4)小鼠生存率和生存时间：感染后，连续观察7天，观察和记录小鼠死亡时间和只数。模型(Model)组小鼠2天内13只小鼠死亡，死亡率达81％(13/16)。5mg/kg RIP1183组小鼠，2天内有3只小鼠死亡，死亡率为20％(3/15)；10mg/kg RIP1183组小鼠，2只小鼠分别于第1天和第2天死亡，随后的5天无动物死亡，死亡率为13.3％；20mg/kg RIP1183组和10mg/kg万古霉素(Van)组仅1只小鼠死亡，均存活14只小鼠，存活率为93％。结果表明，RIP1183具有体内抗感染活性，能显著提高小鼠的生存率，如图8所示。

Claims (1)

1.一种抗多重耐药葡萄球菌感染药物RIP1183的制备方法，其特征在于：RIP1183是由7个氨基酸组成的多肽，其化学名称：乙酰-L-酪氨酰-L-赖氨酰-L-脯氨酰-L-缬胺酰-L-苏氨酰-L-谷氨酰胺-L-苯丙酰胺；化学结构：
Ac-Tyr-Lys-Pro-Val-Thr-Asn-Phe-NH2
制备抗多重耐葡萄球菌感染药物RIP1183的步骤如下：
(1)制备Fmoe-Phe-MBHA Resin
称取Rink Amide MBHA Resin 1g倒入反应柱中，加入10mlDMF，常温浸泡30分钟后用真空泵抽干，加入脱帽试剂20%哌啶的DMF溶液，10~50℃反应5~30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10~50℃反应10~60分钟，抽干，用异丙醇洗涤2次， DMF洗涤2次，茚三酮检测呈阳性，抽干，加入Fmoc-Phe-OH 0.54g， TBTU 0.45g、DMF 10ml、HOBt 1ml、DIEA 0.4ml，于常温反应2小时，茚三酮检测显阴性，树脂用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Phe-MBHA Resin；
(2)制备Fmoc-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin
在步骤(1)的Fmoe-Phe-MBHA Resin中，加入脱帽试剂20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂，常温反应20分钟，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阳性，抽干，加入Fmoc-Asn（Trt）-OH 0.84g，TBTU 0.45g、HOBt 1ml、DIEA 0.4ml、DMF 10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阴性，抽干，获得Fmoc-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin；
(3)制备Fmoc-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin
在步骤(2)的Fmoc-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin中，加入脱帽试剂20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂，常温反应20分钟，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阳性，抽干，加入Fmoc- Thr（tBu）-OH 0.56g，TBTU 0.45g、HOBt 1ml、DIEA0.4ml、DMF 10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阴性，抽干，获得Fmoc-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin；
(4)制备Fmoc-Val-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin
在步骤(3)的Fmoc-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin中，加入脱帽试剂20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂，常温反应20分钟，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阳性，抽干，加入Fmoc-Val-OH 0.48g，TBTU 0.45g、HOBt 1ml、DIEA0.4ml、DMF 10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阴性，抽干，获得Fmoc-Val-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin；
(5)制备Fmoc-Pro-Val-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin
在步骤(4)的Fmoc-Val-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin中，加入脱帽试剂20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂，常温反应20分钟，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阳性，抽干，加入Fmoc- Pro-OH 0.47g，TBTU 0.45g、HOBt 1ml、DIEA 0.4ml、DMF 10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阴性，抽干，获得Fmoc-Pro-Val-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin ；
(6)制备Fmoc-Lys（Boc）-Pro-Val-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin
在步骤(5)的Fmoc-Pro-Val-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin中，加入脱帽试剂20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂，常温反应20分钟，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阳性，抽干，加入Fmoc-Lys（Boc）-OH 0.66g，TBTU 0.45g、HOBt 1ml、DIEA 0.4ml、DMF 10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阴性，抽干，获得Fmoc-Lys（Boc）-Pro-Val-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin；
(7)制备Fmoc- Tyr（tBu)-Lys（Boc）-Pro-Val-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin
在步骤(6)的Fmoc-Lys（Boc）-Pro-Val-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin 中，加入脱帽试剂20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂，常温反应20分钟，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阳性，抽干，加入Fmoc-Tyr（tBu)-OH 0.7g，TBTU 0.45g、HOBt 1ml、DIEA 0.4ml、DMF 10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阴性，抽干，加入脱帽试剂20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂，常温反应20分钟，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测呈阳性，抽干,用乙酸酐、DIEA、DCM混合液进行乙酰化，反应1-2小时，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，甲醇洗涤2次，用甲醇浸泡0.5~3小时，抽干，用氮气吹干树脂成很干的颗粒，所得到的树脂为AC-Tyr（tBu)-Lys（Boc）-Pro-Val-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHAResin；
(8)制备粗品
把吹干的AC-Tyr（tBu)-Lys（Boc）-Pro-Val-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin倒入玻璃的切割瓶中，加入预冷的切肽试剂TFA 9.5ml、H2O 0. 25ml、Tis 0.25ml，常温反应1.5小时，过滤除去树脂，切割液加适量的二氯甲烷进行悬蒸，温度控制在39℃±1℃，将悬蒸好的切割液，放冷，加冰乙醚500ml沉淀，3500转3分钟离心收集沉淀物，用10%的冰乙酸和30%的乙腈混合液溶解，低温冷冻干燥24小时，获得RIP1183粗品0.69g，经HPLC测定纯度为80%；
（9）纯化
将步骤（8）的RIP1183粗品0.69g溶于13ml水中，水浴溶解，过滤，滤液上样于C18色谱柱Kromasil-C18，20mm *250mm,流动相为如下A、B液体的混合物：A：0.1%三氟乙酸加99.9%水；B：0.1%三氟乙酸加99.9%乙腈；从A液体占混合物比例100%开始梯度洗脱，期间B液体占混合物比例逐渐升高，直至占100%，流速为10ml／min，检测波长为： 215nm；收集目标峰的流出液，用相同条件下以实验室级别生产的少量纯品做对照指示目标峰，浓缩冻干，获得成品；共获得成品0．47g，MW：909，经HPLC测定纯度大于98%，质谱测定结果与RIP1183理论分子量一致。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102286072A (zh) * 2011-06-27 2011-12-21 中国人民解放军第四军医大学 一种抗金黄色葡萄球菌AgrC群体感应系统的AIP多肽衍生物及其应用
CN102558298A (zh) * 2011-12-23 2012-07-11 中国人民解放军第四军医大学 一种利用固相多肽合成法合成四肽异构体的方法及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102286072A (zh) * 2011-06-27 2011-12-21 中国人民解放军第四军医大学 一种抗金黄色葡萄球菌AgrC群体感应系统的AIP多肽衍生物及其应用
CN102558298A (zh) * 2011-12-23 2012-07-11 中国人民解放军第四军医大学 一种利用固相多肽合成法合成四肽异构体的方法及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Oligomerization of RNAIII-Inhibiting Peptide Inhibits Adherence and Biofilm Formation of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus In Vitro and In Vivo;Ying Zhou等;《MICROBIAL DRUG RESISTANCE》;20160331;第22卷(第3期);第193-201页，尤其是第194页左栏第3段，表1 *
RNAⅢ抑制肽衍生物RIP1183抗菌作用与机理研究;周颖;《学术天下》;20160501;第1-102页，尤其是摘要，第35-36页2.2部分 *
固相合成法合成葡萄球菌RNAⅢ抑制肽的鉴定;邢庆昌等;《中国组织工程研究与临床康复》;20090326;第13卷(第13期);第2419-2422页 *

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