CN107184618A - 东哥阿里总生物碱提取物的制备方法和用途 - Google Patents

东哥阿里总生物碱提取物的制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种东哥阿里总生物碱提取物的制备方法，它包括总生物碱的提取和上反相聚合物色谱填充柱纯化两个步骤，属于制药领域。本发明制备的东哥阿里总生物碱提取物能促进大鼠尿液中肌酐的排泄，降低肝脏中黄嘌呤氧化酶的活性，同时能降低大鼠血清中尿酸、尿素氮、肌酐水平，提高大鼠尿液中尿酸水平，说明东革阿里总生物碱提取物有较强的降尿酸作用和促尿酸排泄作用，能用于制备抗尿酸药物。

Description

东哥阿里总生物碱提取物的制备方法和用途
技术领域
本发明涉及东哥阿里总生物碱提取物的制备方法，以及东哥阿里总生物碱提取物的制药新用途，属于制药领域。
背景技术
高尿酸血症是指由尿酸代谢障碍所引起的血清尿酸水平增高或尿酸盐在肾脏部位的沉积和以痛风综合症为主的临床表现。近年来，全球高尿酸血症的发病率日益增长。目前全球高尿酸血症的患病率高达10％～25％。嘌呤代谢紊乱和尿酸盐排泄减少是诱发高尿酸血症的直接原因。高尿酸血症可以直接导致痛风的发作，而且也对高脂血症、高血压、肥胖以及胰岛素抵抗等疾病的发作有一定的推动作用，故高尿酸血症已对人类健康产生了严重威胁。有研究表明，东革阿里能显著降低血清尿酸水平和24h尿液排泄尿酸的总量，可以有效缓解和抑制尿酸钠结晶引起的痛风性关节炎，对其临床表现出的关节肿胀、患处疼痛和肢体功能障碍有较好的缓解作用。
目前，东革阿里抗尿酸作用的活性成分和机理还不清楚，治疗时仍以水煎等非常传统的服药方式为主，由于东革阿里味极苦，导致服药剂量大患者难以接受，同时，这种服药方式也具有较大的副作用，常常导致患者出现性欲旺盛和其它心血管不良反应。
发明内容
本发明的目的是提供一种东哥阿里总生物碱提取物的制备方法，以探明东哥阿里抗尿酸的物质基础，进而减少服用剂量，提高顺应性，同时降低不良反应。
本发明提供的制备方法包括以下步骤：
1)总生物碱的提取：将东哥阿里切成薄片，加50～90％乙醇回流提取，提取液减压回收乙醇至无醇味，放冷后用酸调节pH为1～4，静置，离心，上清液用碱调节pH为8～12，然后加入非极性有机溶剂萃取，回收溶剂并蒸干，得总生物碱粗提取物；
2)总生物碱的纯化：将总生物碱粗提取物加乙醇溶解，上反相聚合物色谱填充柱，依次用水、20～50％乙醇、70～90％乙醇洗脱，收集70～90％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至稠膏，真空干燥，粉碎，即得东哥阿里总生物碱提取物。
优选地，所述制备方法包括以下步骤：
1)总生物碱的提取：将东哥阿里切成薄片，加70％乙醇回流提取，提取液减压回收乙醇至无醇味，放冷后用酸调节pH为2，静置，离心，上清液用碱调节pH为10，然后加入非极性有机溶剂萃取，回收溶剂并蒸干，得总生物碱粗提取物；
2)总生物碱的纯化：将总生物碱粗提取物加乙醇溶解，上反相聚合物色谱填充柱，依次用水、30％乙醇、80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至稠膏，真空干燥，粉碎，即得东哥阿里总生物碱提取物。
进一步优选地，所述酸为稀硫酸，所述碱为氨水。
进一步优选地，所述非极性有机溶剂为氯仿。
进一步优选地，所述反相聚合物色谱为CG161、CG300、MCI CHP20P、MCI CHP20Y、MCI CHP20A中的一种。
采用上述方法制备得到的东哥阿里总生物碱提取物，该提取物可用于制备抗尿酸药物。
本发明的有益效果是：
1)本发明制备得到的东哥阿里总生物碱提取物含量达65％以上，收率达0.3％以上，具有较好的产业化前景。
2)本发明制备得到的东哥阿里总生物碱提取物有降尿酸作用，能促进大鼠尿液中肌酐的排泄，降低肝脏中黄嘌呤氧化酶的活性，同时能降低大鼠血清中尿酸、尿素氮、肌酐水平，提高大鼠尿液中尿酸水平，说明东革阿里提取物有较强的降尿酸作用和促尿酸排泄作用。
3)本发明通过作用机理研究，探明了东哥阿里抗尿酸的物质基础，进而针对生物碱进行提取、纯化，通过除去大量的无效成分，使提取物更有利于制剂成型、减少服用剂量，提高用药顺应性并降低副作用。本发明制备的东哥阿里总生物碱提取物不会导致性欲旺盛和其它心血管不良反应。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细地说明。
实施例1
1)总生物碱的提取：东哥阿里5Kg切成薄片，加8倍重量的70％(重量浓度)乙醇回流提取3次，每次1小时(首次提取前浸泡50分钟)，滤过，合并三次滤液，减压回收乙醇至无醇味，放冷后用2％(重量浓度)硫酸调节提取液的pH为2，静置，离心，取上清液用氨水调节pH为10，然后加2倍体积量氯仿萃取三次，合并氯仿层，回收氯仿并蒸干，得总生物碱粗提取物0.36Kg；
2)总生物碱的纯化：将总生物碱粗提取物加少量乙醇溶解，上CG161型反相聚合物色谱填充柱(聚苯乙烯树脂，比表面积900m2/g，平均孔径150A，三菱化学)，依次用水、30％乙醇、80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至稠膏，真空干燥，粉碎，即得东哥阿里总生物碱提取物18.5g。
实施例2
1)总生物碱的提取：将东哥阿里5Kg切成薄片，加10倍重量的50％乙醇回流提取2次，每次2h，提取液减压回收乙醇至无醇味，放冷后用稀硫酸调节pH为4，静置，离心，上清液用氨水调节pH为12，然后加入4倍体积氯仿萃取2次，回收溶剂并蒸干，得总生物碱粗提取物0.45g；
2)总生物碱的纯化：将总生物碱粗提取物加乙醇溶解，上CG300型反相聚合物色谱填充柱(聚苯乙烯树脂，比表面积700m2/g，平均孔径300A，三菱化学)，依次用水、20％乙醇、70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至稠膏，真空干燥，粉碎，即得东哥阿里总生物碱提取物17.2g。
实施例3
1)总生物碱的提取：将东哥阿里5Kg切成薄片，加5倍重量的90％乙醇回流提取2次，每次1小时，提取液减压回收乙醇至无醇味，放冷后用稀硫酸调节pH为1，静置，离心，上清液用氨水调节pH为8，然后加入1倍体积氯仿萃取5次，回收溶剂并蒸干，得总生物碱粗提取物0.31Kg；
2)总生物碱的纯化：将总生物碱粗提取物加乙醇溶解，上MCI CHP20P型反相聚合物色谱填充柱(聚苯乙烯树脂，平均粒径120μm，孔径45nm，三菱化学)，依次用水、50％乙醇、90％乙醇洗脱，收集90％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至稠膏，真空干燥，粉碎，即得东哥阿里总生物碱提取物14.8g。
实施例4
1)总生物碱的提取：将东哥阿里5Kg切成薄片，加12倍重量的60％乙醇回流提取3小时，提取液减压回收乙醇至无醇味，放冷后用稀硫酸调节pH为3，静置，离心，上清液用氨水调节pH为9，然后加入3倍体积氯仿萃取2次，回收溶剂并蒸干，得总生物碱粗提取物0.40Kg；
2)总生物碱的纯化：将总生物碱粗提取物加乙醇溶解，上MCI CHP20Y型反相聚合物色谱填充柱(聚苯乙烯树脂，平均粒径30μm，孔径45nm，三菱化学)，依次用水、40％乙醇、80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至稠膏，真空干燥，粉碎，即得东哥阿里总生物碱提取物16.3g。
实施例5
1)总生物碱的提取：将东哥阿里5Kg切成薄片，加6倍重量的80％乙醇回流提取2次，每次2小时，提取液减压回收乙醇至无醇味，放冷后用稀硫酸调节pH为2，静置，离心，上清液用氨水调节pH为11，然后加入5倍体积氯仿萃取2次，回收溶剂并蒸干，得总生物碱粗提取物0.33Kg；
2)总生物碱的纯化：将总生物碱粗提取物加乙醇溶解，上MCI CHP20A型反相聚合物色谱填充柱(聚苯乙烯树脂，平均粒径20μm，孔径45nm，三菱化学)，依次用水、30％乙醇、80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至稠膏，真空干燥，粉碎，即得东哥阿里总生物碱提取物15.7g。
试验例1总生物碱含量测定：
采用非水滴定法测定，方法参照2015年版中国药典二部咖啡因项下含量测定方法制定，方法具体如下：取本品约0.3g，精密称定，加醋酐-冰醋酸(5:1)的混合液25ml，微温使溶解，放冷，加结晶紫指示液1滴，用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定至溶液显黄色，并将滴定的结果用空白实验校正。
产物收率(％) 总生物碱含量(％)
实施例1 0.370 78.6
实施例2 0.344 66.2
实施例3 0.296 68.9
实施例4 0.326 72.3
实施例4 0.314 74.1
试验例2提取物抗尿酸功效验证
1.实验方法：
将80只SD大鼠随机分成8组，每组10只，分别为空白组、模型组、阳性对照组、东革阿里总生物碱提取物组(简称为提取物组)。将大鼠适应性培养一周后开始造模，除空白对照组外，其他组按7.5g/kg·d酵母膏、100mg/(kg·d)腺嘌呤及15mg/kg·d氧嗪酸钾(简称为造模剂)进行灌胃，大鼠的灌胃体积为1.5ml/100g，连续灌胃给予造模剂两周，在第14天时对所有大鼠进行颈静脉取血，测所有大鼠血清尿酸水平，灌胃造模剂的实验组间血尿酸水平无显著差异，且显著高于空白组(P<0.05)，模型建立成功。高尿酸血症模型建立后，空白组继续灌胃0.5％CMC-Na溶液，除空白组以外的其他组继续给予造模剂，除模型组外的其他组在造模1h后分别给予相应药液。阳性对照组灌胃给予大鼠别嘌醇(71mg/kg·d)，提取物组给药剂量为1.08g/kg·d(按生药量计)，连续给药两周。
一般形态学观察：记录给药前后小鼠的皮毛、精神状态、活动情况、进食、饮水情况以及体重增长情况。
尿液中各项指标的检测：末次给药后，采用大鼠代谢笼对大鼠进行单笼饲养24h，禁食不禁水，收集24h尿液，记录大鼠尿量，3500r/min的条件下离心尿液10min，取尿液上清液，用试剂盒检测尿中Cr、UN、UA含量。根据尿UA浓度和尿量计算各组大鼠24hUA排泄量，同时进行体重校正。根据血、尿中UA、Cr浓度计算各组大鼠UA排泄分数(FEUA)。FEUA(％)＝(血Cr×尿UA)/(血UA×尿Cr)×100
血清中各项指标的测定：收集各组大鼠24h尿液后，采用0.2％异戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉，腹主动脉取血，血样室温下放置1h，3500r/min的条件下离心血样10min，分离血清，采用试剂盒测定血清UA、XOD水平，采用全自动生化分析仪测定血清Cr、UN水平。
肝脏中各项指标测定：腹主动脉取血后，迅速取大鼠肝脏，用冷生理盐水反复冲洗，称取0.2g肝尖组织，加入1.8ml预冷生理盐水，在冰水浴中制成10％肝匀浆，2500r/min的条件下离心10min，取肝匀浆上清液，检测XOD活性。
2.试验结果：
东革阿里总生物碱提取物对大鼠血清和尿液尿酸水平的影响给予造模剂14天后，模型组血清UA水平与空白组相比，升高极显著(P＜0.001)，灌胃造模剂的实验组间血尿酸水平无显著差异，且显著高于空白组(P<0.05)，这说明模型建立成功。给药14天后，结果如表1所示，模型组血清UA水平与空白组相比，升高极显著(P＜0.001)，模型组尿UA水平与空白组相比，降低极显著(P＜0.01)，阳性对照组、提取物组血清UA水平与模型组相比，显著降低(P＜0.05)，说明东革阿里提取物有明显的降尿酸作用。阳性对照组和提取物组尿UA水平与模型组相比，显著升高(P＜0.05)，说明东革阿里提取物能促进大鼠尿酸的排泄。
表1东革阿里提取物对大鼠血清和尿液尿酸水平的影响(n＝10)
组别 血尿酸水平(μmol/L) 尿尿酸水平(μmol/L)
空白组 187.05±27.24 296.74±29.55
模型组 253.57±38.08*** 238.64±12.48**
阳性对照组 207.22±23.03# 308.54±34.16#
提取物组 219.56±33.05 313.44±31.66#
相对于空白组，***表示P<0.001，**表示P<0.01，*表示P<0.05；相对于模型组，##表示P<0.01，#表示P<0.05(下同)。
东革阿里提取物对血清和尿液肌酐水平的影响表2表明，模型组血Cr水平与空白组相比，升高极显著(P＜0.01)，模型组尿Cr水平与空白组相比，明显降低(P＜0.05)，阳性对照组、提取物组血Cr水平与模型组相比，血清Cr水平均降低，但无显著性差异(P＞0.05)，说明造模剂对肾功能有一定的损害。阳性对照组、提取物组尿Cr水平与模型组相比，升高极显著(P＜0.01)。说明东革阿里提取物能促进大鼠肌酐的排泄。
表2东革阿里各种提取物对大鼠血清和尿液肌酐水平的影响(m＝10)
组别 血清肌酐水平(μmol/L) 尿肌酐水平(μmol/L)
空白组 41.33±3.75 194.26±33.77
模型组 60.29±10.17** 136.43±12.31*
阳性对照组 51.42±7.94 214.17±27.97##
提取物组 53.73±5.48 217.28±30.37##
东革阿里各种提取物对大鼠血清和尿液尿素氮水平的影响表3表明，模型组血UN水平与空白组相比，升高显著(P＜0.05)，模型组尿UN水平与空白组相比，降低显著(P＜0.05)，阳性对照组、提取物组血UN水平均低于模型组，但无显著性差异(P＞0.05)，阳性对照组、提取物组尿UN水平均高于模型组，但无显著性差异(P＞0.05)，说明造模剂能抑制尿素氮的排泄。
表3东革阿里各种提取物对大鼠血清和尿液尿素氮水平的影响(n＝10)
组别 血清尿素氮水平(mmol/L) 尿尿素氮水平(pmol/L)
空白组 3.87±0.55 11945.50±2446.83
模型组 10.04±3.39* 4833.95±983.93*
阳性对照组 7.28±2.90 7112.84±1780.13
提取物组 8.05±2.55 7192.34±1306.89
东革阿里提取物对血清和肝脏黄嘌呤氧化酶活性的影响表4表明，与空白组相比，模型组血清和肝脏黄嘌呤氧化酶活性均显著升高(P＜0.05)，与模型组相比，阳性对照组血清和肝脏黄嘌呤氧化酶活性均显著降低(P＜0.05)；提取物组血清黄嘌呤氧化酶活性较模型组相比，降低极显著(P＜0.01)。说明东哥阿里提取物对黄嘌呤氧化酶的有较强的抑制作用。
表4东革阿里各种提取物对大鼠血清和肝脏黄嘌呤氧化酶活性的影响(n＝10)
组别 血清黄嘌呤氧化酶活性(ng/L) 肝脏黄嘌呤氧化酶活性(ng/L)
空白组 40.94±7.14 36.44±5.32
模型组 52.11±4.61* 40.22±3.25*
阳性对照组 41.44±7.37# 35.91±3.38#
提取物组 40.25±6.26## 36.71±2.62
东革阿里各种提取物对尿酸排泄分数的影响表5表明，与空白组相比，模型组尿酸排泄分数明显降低，但无显著性差异(P＞0.05)，阳性对照组、提取物组尿酸排泄分数均高于模型组，但无统计学意义(P＞0.05)。
表5东革阿里各种提取物对大鼠24h尿酸排泄分数的影响(n＝10)
组别 尿酸排泄分数(％)
空白组 35.86±7.85
模型组 31.49±5.52
阳性对照组 38.08±8.06
提取物组 30.74±5.42
3.结论：
本研究采用酵母膏、腺嘌呤、氧嗪酸钾混合灌胃大鼠进行造模，以尿酸浓度等指标来观察东革阿里提取物的降尿酸作用。酵母膏属于高嘌呤食物，它通过增加动物体内的嘌呤含量来增加尿酸含量；腺嘌呤的主要作用是抑制肾脏对尿酸的排泄，从而增加血尿酸浓度；氧嗪酸钾利用其结构与尿酸的嘌呤环类似来竞争性结合尿酸酶，抑制尿酸酶的活性，从而增加血尿酸水平。本试验通过这三种原理来建立慢性高尿酸血症大鼠模型，在此基础上通过考察大鼠尿酸的排泄量、体内的尿酸含量以及黄嘌呤氧化酶活性来分析东革阿里提取物降尿酸的作用。在酵母膏、腺嘌呤和氧嗪酸钾混合灌胃建立的高尿酸血症模型中，与空白组相比，模型组血清尿酸水平极显著升高，尿尿酸水平极显著降低，血清和肝脏中的黄嘌呤氧化酶活性显著升高，说明高尿酸血症模型建立成功。别嘌醇灌胃给药14天后，与模型组大鼠相比，阳性对照组大鼠血清尿酸水平显著降低，尿液中尿酸水平显著升高，尿肌酐水平极显著升高，血清和肝脏中黄嘌呤氧化酶浓度显著降低，说明别嘌醇降尿酸作用显著。东革阿里提取物灌胃给药14天后，与模型组相比，东革阿里提取物有一定的降尿酸作用，能极显著促进大鼠尿液中肌酐的排泄，显著降低肝脏中黄嘌呤氧化酶的活性，同时能降低大鼠血清中尿酸、尿素氮、肌酐水平，提高大鼠尿液中尿酸水平，说明东革阿里提取物有较强的降尿酸作用和促尿酸排泄作用。
由于东革阿里提取物均能显著降低黄嘌呤氧化酶活性，且能显著提高尿液中尿酸、肌酐、尿素氮水平，推测东革阿里可能是通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性和促进尿酸的排泄这两种方式来降低大鼠尿酸水平。

Claims (7)

1.东哥阿里总生物碱提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)总生物碱的提取：将东哥阿里切成薄片，加50～90％乙醇回流提取，提取液减压回收乙醇至无醇味，放冷后用酸调节pH为1～4，静置，离心，上清液用碱调节pH为8～12，然后加入非极性有机溶剂萃取，回收溶剂并蒸干，得总生物碱粗提取物；
2)总生物碱的纯化：将总生物碱粗提取物加乙醇溶解，上反相聚合物色谱填充柱，依次用水、20～50％乙醇、70～90％乙醇洗脱，收集70～90％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至稠膏，真空干燥，粉碎，即得东哥阿里总生物碱提取物。
2.如权利要求1所述的东哥阿里总生物碱提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)总生物碱的提取：将东哥阿里切成薄片，加70％乙醇回流提取，提取液减压回收乙醇至无醇味，放冷后用酸调节pH为2，静置，离心，上清液用碱调节pH为10，然后加入非极性有机溶剂萃取，回收溶剂并蒸干，得总生物碱粗提取物；
2)总生物碱的纯化：将总生物碱粗提取物加乙醇溶解，上反相聚合物色谱填充柱，依次用水、30％乙醇、80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至稠膏，真空干燥，粉碎，即得东哥阿里总生物碱提取物。
3.如权利要求1所述的东哥阿里总生物碱提取物的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述酸为稀硫酸，所述碱为氨水。
4.如权利要求1所述的东哥阿里总生物碱提取物的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述非极性有机溶剂为氯仿。
5.如权利要求1所述的东哥阿里总生物碱提取物的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述反相聚合物色谱选自CG161、CG300、MCI CHP20P、MCI CHP20Y、MCI CHP20A。
6.权利要求1～5任一项所述的方法制备得到的东哥阿里总生物碱提取物。
7.权利要求6所述的东哥阿里总生物碱提取物在制备抗尿酸药物中的用途。
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史珅: "几种天然产物对痛风性关节炎的影响初探", 《天然产物研究与开发》 *

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