CN107179363A - 一种铜藻中岩藻黄质的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种铜藻中岩藻黄质的测定方法,具体涉及水产养殖领域,本发明通过对标准岩藻黄质样品的液相色谱测定,绘制标准曲线,通过对铜藻样品浸取液的液相色谱测定,通过计算获得铜藻中岩藻黄质的含量,并且提供了一种铜藻样品的前处理方法,通过低温冷冻和超高转速破碎,实现了简单条件下含量快速测定,实现了快速、无干扰、准确可靠的岩藻黄质含量测定。
Description
技术领域
本发明涉及水产养殖加工技术领域,具体是一种铜藻中岩藻黄质的测定方法。
背景技术
铜藻,褐藻属,主要分布在北太平洋西部海域,在我国资源十分丰富。自古以来,铜藻就一直作为中药被利用,但目前关于其具有生物活性的化学成分的研究还比较少。最近几年,由于气候等综合原因,铜藻已经出现了爆发性增殖,怎么将他们“废物利用”,成为我们研究它们最好的契机。
岩藻黄质,又称岩藻黄素或褐藻素,是胡萝卜素的含氧衍生物,属于类胡萝卜素中的叶黄素类,是一种对人类十分有利的活性物质。在自然界中,岩藻黄质广泛存在于藻类和无脊椎动物细胞中,尤其是褐藻纲和硅藻纲的藻类含量更为丰富,褐藻中岩藻黄质的含有量占自然界中类胡 萝卜素总产量的10%以上。
现有的海藻中岩藻黄质检测方法多为分光光度法,前处理条件相对复杂、繁琐,且干扰因素多,结果准确度不够,针对的基质为海带、裙带菜等藻类,目前尚无一种针对铜藻中岩藻黄质的快速、高效的测定方法。并且对于铜藻的预处理,通常使用冷冻干燥的方式处理,在经过破碎,将粉末分散于有机溶剂中浸取岩藻黄质,但是这种方法在温度较低、时间较短以及浸取液的量较少的情况下,都会使浸出量较少,极大的影响了测定值的精确度,并且干燥过程,以及后续升温浸出的工艺,均会使自身稳定性较差的岩藻黄质变性及分解。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术中前处理条件繁琐,测定结果不精确的缺点,提供一种快速有效并且精确的铜藻中岩藻黄质的测定方法。
本发明的方案是一种铜藻中岩藻黄质的测定方法,其特征在于:使用高效液相色谱法测定,包括如下操作步骤:
(1)铜藻预处理:将新鲜的铜藻用清水洗净,低温冷冻后,使用超高转速破碎机破碎,过筛网,密封避光储存于-20℃冰箱中;
(2)配制岩藻黄质标准贮备液:准确称取0.01g岩藻黄质,精确至0.0001g,用丙酮定容至100ml,配置为100μg/ml的标准贮备液;
(3)配制岩藻黄质标准工作液:取上步岩藻黄质标准贮备液,用流动相稀释成浓度范围为0.02~10μg/ml的标准工作液。
(4)样品处理:称取粉碎后的样品0.5g置于50ml塑料离心管中,精确至0.01g,加入40ml60%的乙醇溶液,超声提取10-40min,放入离心机中离心提取5-20min将提取液转移至50ml容量瓶,定容至50ml,过0.45μm微孔滤膜制得试样提取液;
(5)标准曲线绘制:取若干份浓度不同的标准工作液进行进样分析,绘制出进样浓度与峰面积的线性曲线;
(6)浓度测试:对试样提取液进行高效液相色谱分析,测得峰面积,通过标准曲线,得到试样提取液岩藻黄质浓度;
(7)计算:试样中岩藻黄质的含量按下式计算,结果保留三位有效数字:
X=(C*V)/m
式中:X ——试样中岩藻黄质的含量,单位为毫克每克(mg/g);
C ——由线性标准曲线计算得到的岩藻黄质浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL);
V ——试样提取液最终定容体积,单位为毫升(mL);
m ——称取的试样质量,单位为克(g)。
进一步的,所述的低温冷冻为-20℃以下温度冷冻或直接浸泡于液氮中,将铜藻冷冻至脆硬状态,更有利于研磨破碎,并且,有利于抑制破碎时的摩擦升温,但浸泡时间不超过30s。
进一步的,所述的超高转速破碎机的转速为16000~30000转/分钟,破碎后的铜藻过325目或以上目数的筛网。超高转速的破碎机,更有利于铜藻细胞中的细胞质充分逸出。过筛,保证铜藻被粉碎至足够的细度。
进一步的,铜藻预处理、标准贮备液、标准工作液、试样提取液的制备与贮存为避光条件。
进一步的,色谱条件为色谱柱:Develosil C30-UG-5, 250 mm×4.6 mm(i.d.),5µm;流动相:甲醇-乙腈溶液(49∶51,V∶V);流速:1.0 mL/min;检测波长:450 nm;柱温:30℃;进样体积:20 µL。
进一步的,离心提取时,离心机的转速为3000-5000r/min。
进一步的,所述实验试剂,甲醇、乙腈、丙酮为色谱纯,乙醇为分析纯,实验用水为超纯水。
由于采用了上述技术方案,提供的一种铜藻中岩藻黄质的测定方法,不仅能够使前处理条件简单快速,并且能够准确的通过液相色谱法测出铜藻中岩藻黄质的含量,并且本发明提供的前处理方式测得的岩藻黄质含量值不像其他方式那样,受提取温度,提取时间甚是提取液料液比产生较大影响,同时高效液相色谱法保证了测量的精准。
具体实施方式
为了更好地阐明本发明,下面提供具体的实施例和对比例,但本发明的应用不仅限于实施例所列举的范围。
下述对比例与实施使用通用的样品以及标准贮备液和标准工作液,因此首先进行本发明的前三部操作。
(1)铜藻预处理:取一定量的新鲜铜藻,将新鲜的铜藻用清水洗净,擦干表面残水后,将铜藻浸入液氮中持续30秒,低温冷冻后,将铜藻放入破碎机中,使用超高转速破碎机破碎,破碎后的藻浆,完全通过325目筛网,过滤后的成品即为前处理后的样品,将样品密封避光储存于-20℃冰箱中;
(2)配制岩藻黄质标准贮备液:准确称取0.01g岩藻黄质,精确至0.0001g,用丙酮定容至100ml,配置为100μg/ml的标准贮备液;
(3)配制岩藻黄质标准工作液:取上步岩藻黄质标准贮备液,用流动相稀释成浓度范围为0.02~10μg/ml的标准工作液,为保证标准曲线的准确性,可以配置尽可能多的标准样,绘制标准曲线。
实施例一、称取粉碎后的样品0.5g精确至0.01g,置于50ml塑料离心管中,精确至0.01g,在恒温20℃环境下,加入40ml60%的乙醇溶液,超声提取20min,放入离心机中离心提取4000r/min速度20min将提取液转移至50ml容量瓶,定容至50ml,过0.45μm微孔滤膜制得试样提取液,对试样提取液进行高效液相色谱分析,测得峰面积,通过标准曲线,得到试样提取液岩藻黄质浓度。
实施例二、称取粉碎后的样品0.5g精确至0.01g,置于50ml塑料离心管中,精确至0.01g,在恒温30℃环境下,加入40ml60%的乙醇溶液,超声提取20min,放入离心机中离心提取4000r/min速度20min将提取液转移至50ml容量瓶,定容至50ml,过0.45μm微孔滤膜制得试样提取液,对试样提取液进行高效液相色谱分析,测得峰面积,通过标准曲线,得到试样提取液岩藻黄质浓度。
实施例三、称取粉碎后的样品0.5g精确至0.01g,置于50ml塑料离心管中,精确至0.01g,在恒温40℃环境下,加入40ml60%的乙醇溶液,超声提取20min,放入离心机中离心提取4000r/min速度20min将提取液转移至50ml容量瓶,定容至50ml,过0.45μm微孔滤膜制得试样提取液,对试样提取液进行高效液相色谱分析,测得峰面积,通过标准曲线,得到试样提取液岩藻黄质浓度。
实施例四、称取粉碎后的样品0.5g精确至0.01g,置于50ml塑料离心管中,精确至0.01g,在恒温50℃环境下,加入40ml60%的乙醇溶液,超声提取20min,放入离心机中离心提取4000r/min速度20min将提取液转移至50ml容量瓶,定容至50ml,过0.45μm微孔滤膜制得试样提取液,对试样提取液进行高效液相色谱分析,测得峰面积,通过标准曲线,得到试样提取液岩藻黄质浓度。
实施例五、称取粉碎后的样品0.5g精确至0.01g,置于50ml塑料离心管中,精确至0.01g,在恒温60℃环境下,加入40ml60%的乙醇溶液,超声提取20min,放入离心机中离心提取4000r/min速度20min将提取液转移至50ml容量瓶,定容至50ml,过0.45μm微孔滤膜制得试样提取液,对试样提取液进行高效液相色谱分析,测得峰面积,通过标准曲线,得到试样提取液岩藻黄质浓度。
通过对实施例一到五的数据进行计算,得到下表:
由表格可以看出随着提取温度升高,同样的样品测得的岩藻黄质含量并未出现明显变化,由此可见,本发明提供的制样方法,能够克服温度对测试结果的影响,保证检测结果稳定一致。
实施例六、称取粉碎后的样品0.4g精确至0.01g,置于50ml塑料离心管中,精确至0.01g,在恒温20℃环境下,加入40ml60%的乙醇溶液,超声提取20min,放入离心机中离心提取4000r/min速度20min将提取液转移至50ml容量瓶,定容至50ml,过0.45μm微孔滤膜制得试样提取液,对试样提取液进行高效液相色谱分析,测得峰面积,通过标准曲线,得到试样提取液岩藻黄质浓度。
实施例七、称取粉碎后的样品0.3g精确至0.01g,置于50ml塑料离心管中,精确至0.01g,在恒温20℃环境下,加入40ml60%的乙醇溶液,超声提取20min,放入离心机中离心提取4000r/min速度20min将提取液转移至50ml容量瓶,定容至50ml,过0.45μm微孔滤膜制得试样提取液,对试样提取液进行高效液相色谱分析,测得峰面积,通过标准曲线,得到试样提取液岩藻黄质浓度。
实施例八、称取粉碎后的样品0.2g精确至0.01g,置于50ml塑料离心管中,精确至0.01g,在恒温20℃环境下,加入40ml60%的乙醇溶液,超声提取20min,放入离心机中离心提取4000r/min速度20min将提取液转移至50ml容量瓶,定容至50ml,过0.45μm微孔滤膜制得试样提取液,对试样提取液进行高效液相色谱分析,测得峰面积,通过标准曲线,得到试样提取液岩藻黄质浓度。
实施例九、称取粉碎后的样品0.1g精确至0.01g,置于50ml塑料离心管中,精确至0.01g,在恒温20℃环境下,加入40ml60%的乙醇溶液,超声提取20min,放入离心机中离心提取4000r/min速度20min将提取液转移至50ml容量瓶,定容至50ml,过0.45μm微孔滤膜制得试样提取液,对试样提取液进行高效液相色谱分析,测得峰面积,通过标准曲线,得到试样提取液岩藻黄质浓度。
实施例十、称取粉碎后的样品0.05g精确至0.01g,置于50ml塑料离心管中,精确至0.01g,在恒温20℃环境下,加入40ml60%的乙醇溶液,超声提取20min,放入离心机中离心提取4000r/min速度20min将提取液转移至50ml容量瓶,定容至50ml,过0.45μm微孔滤膜制得试样提取液,对试样提取液进行高效液相色谱分析,测得峰面积,通过标准曲线,得到试样提取液岩藻黄质浓度。
实施例六到实施例十保证定容乙醇一定,减少样品量,相当于增加提取液料比,通过最终实验数据可以看出,随着液料比的增加,并未出现岩藻黄质测得量大幅变动的状况,由此可见,本发明提供的制样方法,能够克服提取液料比对测试结果的影响,保证检测结果稳定一致。
实施例十一、称取粉碎后的样品0.5g精确至0.01g,置于50ml塑料离心管中,在恒温20℃环境下,加入40ml60%的乙醇溶液,超声提取40min,放入离心机中6000r/min离心20min,将提取液转移至50ml容量瓶,定容至50ml,过0.45μm微孔滤膜制得试样提取液,对试样提取液进行高效液相色谱分析,测得峰面积,通过标准曲线,得到试样提取液岩藻黄质浓度。
实施例十二、称取粉碎后的样品0.5g精确至0.01g,置于50ml塑料离心管中,在恒温20℃环境下,加入40ml60%的乙醇溶液,超声提取30min,放入离心机中6000r/min离心20min,将提取液转移至50ml容量瓶,定容至50ml,过0.45μm微孔滤膜制得试样提取液,对试样提取液进行高效液相色谱分析,测得峰面积,通过标准曲线,得到试样提取液岩藻黄质浓度。
实施例十三、称取粉碎后的样品0.5g精确至0.01g,置于50ml塑料离心管中,在恒温20℃环境下,加入40ml60%的乙醇溶液,超声提取20min,放入离心机中6000r/min离心10min将提取液转移至50ml容量瓶,定容至50ml,过0.45μm微孔滤膜制得试样提取液,对试样提取液进行高效液相色谱分析,测得峰面积,通过标准曲线,得到试样提取液岩藻黄质浓度。
实施例十四、称取粉碎后的样品0.5g精确至0.01g,置于50ml塑料离心管中,在恒温20℃环境下,加入40ml60%的乙醇溶液,超声提取10min,放入离心机中,6000r/min离心10min,将提取液转移至50ml容量瓶,定容至50ml,过0.45μm微孔滤膜制得试样提取液,对试样提取液进行高效液相色谱分析,测得峰面积,通过标准曲线,得到试样提取液岩藻黄质浓度。
实施例十五、称取粉碎后的样品0.5精确至0.01g,置于50ml塑料离心管中,在恒温20℃环境下,加入40ml60%的乙醇溶液,超声提取10min,放入离心机中,6000r/min离心5min,将提取液转移至50ml容量瓶,定容至50ml,过0.45μm微孔滤膜制得试样提取液,对试样提取液进行高效液相色谱分析,测得峰面积,通过标准曲线,得到试样提取液岩藻黄质浓度。
实施例十一到实施例十五在保证其他条件不变的条件下,减少超声提取的时间和离心机离心的时间,通过最终实验数据可以看出,提取时间减少,并未出现岩藻黄质测得量大幅变动的状况,由此可见,本发明提供的制样方法,能够克服提取时间对测试结果的影响,保证检测结果稳定一致。特别是实施例十五可见,即使超声提取10min,离心提取5min,仍具有准确的提取测量结果。更加能证明本方法的快捷准确测量的效果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。 应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。 因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种铜藻中岩藻黄质的测定方法,其特征在于:使用高效液相色谱法测定,包括如下操作步骤:
(1)铜藻预处理:将新鲜的铜藻用清水洗净,低温冷冻后,使用超高转速破碎机破碎,过筛网,密封避光储存于冰箱中;
(2)配制岩藻黄质标准贮备液:准确称取一定量岩藻黄质,精确至0.0001g,用丙酮定容,配置为100μg/ml的标准贮备液;
(3)配制岩藻黄质标准工作液:取上步岩藻黄质标准贮备液,用流动相稀释成浓度范围为0.02~10μg/ml的标准工作液;
(4)样品处理:称取粉碎后的样品0.01-1g置于50ml塑料离心管中,精确至0.01g,加入40ml60%的乙醇溶液,超声提取10-40min,放入离心机中离心提取5-20min将提取液转移至50ml容量瓶,定容至50ml,过0.45μm微孔滤膜制得试样提取液;
(5)标准曲线绘制:取若干份浓度不同的标准工作液进行进样分析,绘制出进样浓度与峰面积的线性曲线;
(6)浓度测试:对试样提取液进行高效液相色谱分析,测得峰面积,通过标准曲线,得到试样提取液岩藻黄质浓度;
(7)计算:试样中岩藻黄质的含量按下式计算,结果保留三位有效数字:
X=(C*V)/m
式中:X ——试样中岩藻黄质的含量,单位为毫克每克;
C ——由线性标准曲线计算得到的岩藻黄质浓度,单位为毫克每毫升;
V ——试样提取液最终定容体积,单位为毫升;
m ——称取的试样质量,单位为克。
2.根据权利要求1所述的一种铜藻中岩藻黄质的测定方法,其特征在于:所述的低温冷冻为-20℃以下温度冷冻或直接浸泡于液氮中。
3.根据权利要求1所述的一种铜藻中岩藻黄质的测定方法,其特征在于:所述的破碎机为超高速破碎机。
4.根据权利要求1所述的一种铜藻中岩藻黄质的测定方法,其特征在于:铜藻预处理、标准贮备液、标准工作液、试样提取液的制备与贮存为避光条件。
5.根据权利要求1所述的一种铜藻中岩藻黄质的测定方法,其特征在于:色谱条件为色谱柱:Develosil C30-UG-5, 250 mm×4.6 mmi.d.,5 µm;流动相:甲醇-乙腈溶液,溶液体积比为49∶51;流速:1.0 mL/min;检测波长:450 nm;柱温:30℃;进样体积:20 µL。
6.根据权利要求1所述的一种铜藻中岩藻黄质的测定方法,其特征在于:离心提取时,离心机的转速为4000-10000r/min。
7.根据权利要求1所述的一种铜藻中岩藻黄质的测定方法,其特征在于:所述实验试剂,甲醇、乙腈、丙酮为色谱纯,乙醇为分析纯,实验用水为超纯水。
8.根据权利要求2所述的一种铜藻中岩藻黄质的测定方法,其特征在于:所述的直接浸泡于液氮中,浸泡时间不超过30s。
9.根据权利要求3所述的一种铜藻中岩藻黄质的测定方法,其特征在于:所述的超高转速破碎机的转速为16000~30000转/分钟,破碎后的铜藻过325目或以上目数的筛网。
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