CN109662982A - 一种三七中皂苷类活性成分的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及天然药物提取制备领域,一种三七中皂苷类活性成分的提取方法,包括以下步骤:(1)制备得到囊泡表面活性剂溶液;(2)将研磨粉碎后的三七粉加入至囊泡表面活性剂溶液中,混合均匀,随后在超声波下超声提取,得到超声提取液;(3)对超声提取液离心分离,取上层清液,得到含有皂苷类活性成分提取液;与常规提取方法相比,本发明提供的方法重复性好,稳定性高,绿色环保并且操作简单快速高效。实验操作方法简单,避免使用有机溶剂,环境污染小,且对操作人员毒害作用更小,是一种环境友好型的提取方法;此外,通过与超声辅助提取法相结合,经济省时,能够高效便捷地提取三七粉中皂苷类活性成分。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物提取制备领域,尤其涉及一种三七中皂苷类活性成分的提取方法。
背景技术
近年来,源自中药的天然产品引起了人们的极大关注,草本植物含有复杂的成分,活性化合物的浓度往往较低。例如,植物三七的干燥块根和根茎,在中国通常被称为“三七”,在国内栽培已有400多年,三七主要集中在云南省种植。三七目前已被制成一些制剂,如“云南白药”、“片仔黄”和“三七片”。研究表明三七具有止血、抗癌、抗肿瘤、抗高血糖、抗高脂血、抗动脉粥样硬化、抗高血压、抗氧化等作用,可用于治疗因损伤、肿瘤、肝毒性及炎症引起的内外出血。三七中的主要活性成分有皂苷、氨基酸、三七素、黄酮类和多糖等,其中,具有药理活性的皂苷的主要生物活性成分包括人参皂苷和三七皂苷等。因此,三七的质量控制通常集中于皂苷的测定。
将样品引入分析仪器之前,选择合适的提取方法对于从原始基质中纯化目标化合物非常重要,这与基质、分析物的性质、样品中分析物的浓度水平以及所采用的分析技术都有着密切的关系。传统的样品预处理技术有索氏提取法、热回流提取法、蒸馏法或液液提取法,这些技术用于从各种基质中提取所需的化合物。但是,这些传统预处理技术具有许多缺点,需要消耗大量的有机溶剂,程序较为繁琐,提取时间长,成本高,并且在高温和较长的提取时间下,会导致所需的化合物降解。为了尽可能克服上述缺点,目前也提出了各种新的提取方法用于从各种天然药物中提取目标化合物,例如超声辅助提取法、微波辅助提取法和超临界流体提取法。然而这些新方法仍然需要消耗大量的有机溶剂,并且萃取效率较低。
例如,一种在中国专利文献上公开的“一种人参皂苷Rg5和人参皂苷Rk1的提取方法及应用”,其公告号CN107793465A,其公开了一种人参皂苷Rg5和人参皂苷Rk1的提取方法及应用,该发明将蒸制后的人参属植物原料用溶剂回流提取,提取液经大孔吸附树脂柱层析得到含人参皂苷Rg5和Rk1的总皂苷,将总皂苷、经蒸制的人参总皂苷、三七总皂苷或经蒸制的人参皂苷Rb1经大孔吸附树脂柱层析得到人参皂苷Rg5和Rk1总含量大于97%的分组皂苷,分组皂苷再经大孔吸附树脂柱反复柱层析得到纯度大于90%的单体人参皂苷Rg5和单体人参皂苷Rk1,然而该发明在原料的回流提取、吸附和洗脱过程中都需要用到大量的有机溶剂,程序较为繁琐,成本较高。
发明内容
本发明是为了克服目前传统提取技术需要消耗大量的有机溶剂,环境污染严重,且程序较为繁琐,提取时间长,成本高等问题,以囊泡表面活性剂溶液作为提取溶剂,并结合超声辅助提取法,提出一种三七中皂苷类活性成分的提取方法。
为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种三七中皂苷类活性成分的提取方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备得到囊泡表面活性剂溶液;
(2)将研磨粉碎后的三七粉加入至囊泡表面活性剂溶液中,混合均匀,随后在超声波下超声提取,得到超声提取液;
(3)对超声提取液离心分离,取上层清液,得到含有三七中皂苷类活性成分的提取液。
囊泡是大单体的聚集体,由天然或合成的表面活性剂(包括磷脂)形成。囊泡具有球形结构,由一层双层包围的内部溶剂腔组成。自发形成的囊泡可以由带相反电荷的单尾表面活性剂或双尾表面活性剂自发组装。与由磷脂分子组成的脂质体相比,自发囊泡更容易制备,更可控并且热力学性质稳定。一般来说,当阴离子表面活性剂溶液和阳离子表面活性剂溶液在水溶液中混合时,可以在离子配对诱导的低浓度下形成分子双层。与正常的胶束溶液相比,囊泡的增溶位点更多,疏水亲水选择性更强,流体动力学直径更大,这增加了囊泡与各种分析物的相互作用。皂苷类活性物质其分子结构由皂苷元与糖构成,其苷元有不同程度的亲脂性,糖链羟基又有亲水性,因此能够与囊泡发生亲水疏水作用从而相互结合,并且囊泡是由表面活性剂构成,它也可以与皂苷类活性物质发生氢键相互作用和静电作用,使得结合更加紧密牢固。因此,囊泡可用于提取三七中的皂苷类活性成分。
作为优选,所述囊泡表面活性剂溶液为十二烷基三甲基溴化铵/十二烷基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液、十六烷基三甲基溴化铵/辛基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液、十六烷基三甲基氯化铵/辛基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液或二十六烷基二甲基溴化铵囊泡表面活性剂溶液中的一种。
作为优选,所述十二烷基三甲基溴化铵/十二烷基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液的制备方法为:将十二烷基三甲基溴化铵溶于水中,随后加入十二烷基硫酸钠,其中十二烷基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠的摩尔比为3:7,混合均匀后将溶液振摇30 min,得到十二烷基三甲基溴化铵/十二烷基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液。
作为优选,所述囊泡表面活性剂溶液的浓度为0.1%-2% w/v。
作为优选,所述三七粉和囊泡表面活性剂溶液的固液比为5 mg/mL-160 mg/mL。
作为优选,所述超声提取时间为10-30 min。
作为优选,所述离心分离的离心速度为13000-15000 rpm,离心时间为5-10 min。
因此,本发明具有如下有益效果:与常规提取方法相比,本发明提供的方法重复性好,稳定性高,绿色环保并且操作简单快速高效。实验操作方法简单,避免使用有机溶剂,环境污染小,且对操作人员毒害作用更小,是一种环境友好型的提取方法;此外,通过与超声辅助提取法相结合,经济省时,能够高效便捷地提取三七粉中皂苷类活性成分。
附图说明
图1是不同种类的囊泡表面活性剂溶液对三七样品提取效率影响柱状图。
图2是不同浓度的囊泡表面活性剂溶液对三七样品提取效率影响折线图。
图3是不同超声提取时间对三七样品提取效率影响折线图。
图4是不同固液比对三七样品提取效率影响柱状图。
图5是十二烷基三甲基溴化铵/十二烷基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液与甲醇分别作为提取溶剂时提取三七样品的液相色谱图。
图6是十二烷基三甲基溴化铵/十二烷基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液作为提取溶剂在最优条件下提取三七样品的液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明做进一步的描述,本发明实施例或对比例制得含有皂苷类活性成分提取液中的有效成分是通过安捷伦1290超高效液相色谱进行分析表征,在分析表征前先将实施例和对比例制得的含有皂苷类活性成分提取液通过0.22 μm一次性尼龙滤膜过滤获得样品溶液,随后转移至液相进样瓶中,进行超高效液相色谱分析检测;目标分析物的分离在安捷伦SB-C18(4.6×50 mm,1.8 μm)色谱柱,柱温为40 ºC条件下进行,流动相由水(A)和乙腈(B)组成,流动相流速保持在0.400 mL/min。洗脱梯度条件为:0-1 min,20% B;1-2 min,20% -25% B;2-3 min,25%-30% B;3-4 min,30%-35% B;4-5min,35% B;5-6 min,35%-40% B;6-7 min,40%-60% B;7-8 min,60%-100% B;8-9 min,100%B;9-10 min,100%-20% B。进样体积为2 μL,检测波长为203 nm。
实施例1:三七中皂苷类活性成分的提取方法,包括以下步骤:
(1)将14.8 mmol的十二烷基三甲基溴化铵溶于水中,加入54.2mmol的十二烷基硫酸钠,混合后震荡摇匀30min,制备得到总重量百分比为1.8 % w/v的十二烷基三甲基溴化铵/十二烷基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液;
(2)将研磨粉碎后的三七粉加入至囊泡表面活性剂溶液中,固液比为5 mg/mL,混合均匀后,在50KHz频率的超声波下超声提取20min;
(3)将超声提取液在13000 rpm下离心10 min,取上层清液,得到含有皂苷类活性成分提取液。
实施例2:与实施例1的区别在于,步骤(1)制备得到十六烷基三甲基溴化铵/辛基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液,制备方法:将14.8 mmol的十六烷基三甲基溴化铵溶于水中,加入54.2mmol的辛基硫酸钠,混合后震荡摇匀30min,制备得到总重量百分比为1.8% w/v的十六烷基三甲基溴化铵/辛基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液。
实施例3:与实施例1的区别在于,步骤(1)制备得到十六烷基三甲基氯化铵/辛基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液,制备方法:将14.8 mmol的十六烷基三甲基氯化铵溶于水中,加入54.2mmol的辛基硫酸钠,混合后震荡摇匀30min,制备得到总重量百分比为1.8% w/v的十六烷基三甲基氯化铵/辛基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液。
实施例4:与实施例1的区别在于,步骤(1)制备得到二十六烷基二甲基溴化铵囊泡表面活性剂溶液,制备方法:称量50 mg的二十六烷基二甲基溴化铵,溶于10 mL水中,将溶液振摇30 min,获得二十六烷基二甲基溴化铵囊泡表面活性剂溶液。
对比实施例1-4,制备得到了四种不同类型的囊泡表面活性剂溶液,在其他条件相同的情况下进行三七中皂苷类活性成分的提取,结果如图1所示(图中,DTAB/SDS为十二烷基三甲基溴化铵/十二烷基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液,CTAB/SOS为十六烷基三甲基溴化铵/辛基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液,CTAC/SOS为十六烷基三甲基氯化铵/辛基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液,GHAB为二十六烷基二甲基溴化铵囊泡表面活性剂溶液)。图中表明,从不同囊泡表面活性剂溶液在超高效液相色谱中检测到的四种目标分析物(三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd)的峰面积的影响柱状图中可以看出,当十二烷基三甲基溴化铵/十二烷基硫酸钠囊泡用作提取溶剂时,所有分析物的提取效率最高,二十六烷基二甲基溴化铵囊泡表面活性剂溶液对样品的提取效率最低。
实施例5:与实施例1的区别在于,步骤(1)制备得到总重量百分比为0.1 % w/v的十二烷基三甲基溴化铵/十二烷基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液,步骤(3)中离心分离的离心速度为15000 rpm,离心时间为5 min。
实施例6:与实施例1的区别在于,步骤(1)制备得到总重量百分比为1 % w/v的十二烷基三甲基溴化铵/十二烷基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液,步骤(3)中离心分离的离心速度为15000 rpm,离心时间为5 min。
实施例7:与实施例1的区别在于,步骤(1)制备得到总重量百分比为2 % w/v的十二烷基三甲基溴化铵/十二烷基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液,步骤(3)中离心分离的离心速度为14000 rpm,离心时间为7 min。
对比例1:与实施例1的区别在于,步骤(1)制备得到总重量百分比为5 % w/v的十二烷基三甲基溴化铵/十二烷基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液。
对比实施例5-7与对比例1,制备得到了四种不同浓度的十二烷基三甲基溴化铵/十二烷基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液,在其他条件相同的情况下进行三七中皂苷类活性成分的提取,结果如图2所示。图中表明,在囊泡表面活性剂溶液浓度从0.1%w/v增大到1%w/v时,四种目标分析物的峰面积随着囊泡表面活性剂浓度的增加而增加,在浓度从0.1%w/v增大到1%w/v,峰面积缓慢下降,而将囊泡表面活性剂浓度从2%w/v增加到5%w/v时,目标分析物的提取效率逐渐降低,水溶液中过多的囊泡可能对目标分析物传入囊泡溶液的传递产生不利影响。因此囊泡表面活性剂溶液浓度从0.1%w/v至2%w/v为最佳浓度。
对比例2:与实施例1的区别在于,步骤(1)制备得到总重量百分比为1 % w/v的十二烷基三甲基溴化铵/十二烷基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液,且步骤(2)中超声提取时间为5min。
实施例8:与实施例1的区别在于,步骤(1)制备得到总重量百分比为1 % w/v的十二烷基三甲基溴化铵/十二烷基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液,且步骤(2)中超声提取时间为10min。
实施例9:与实施例1的区别在于,步骤(1)制备得到总重量百分比为1 % w/v的十二烷基三甲基溴化铵/十二烷基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液,且步骤(2)中超声提取时间为30min。
将对比例2以及实施例1、8、9进行对比,在其他条件相同的情况下,对比了不同超声提取时间下的提取结果,结果如图3所示。图中表明,当提取时间从5 min升高至10 min时,峰面积上升明显,提取效率快速升高,当提取时间从10 min增加到20 min时,峰面积也缓慢上升,而当提取时间从20 min增加到30 min时,峰面积上升非常缓慢,提取效率提高不明显,因此可推断再增加提取时间,提取效率也不会明显提高,因此提取时间为10-30min为最优选择。
实施例10:与实施例1的区别在于,步骤(2)中的固液比为80 mg/mL。
实施例11:与实施例1的区别在于,步骤(2)中的固液比为160 mg/mL。
对比例3:与实施例1的区别在于,步骤(2)中的固液比为240 mg/mL。
对比实施例1、10、11以及对比例3,在其他条件相同的情况下,对比了不同固液比下提取结果,结果如图4所示。图中表明,随着固液比从5mg/mL增加至160 mg/mL,目标分析物的提取量明显升高,但溶剂的提取效率相差不大。然而,进一步提高固液比至240 mg/mL,四个目标化合物的峰面积略有增加,但提取效率大大下降,在较大的固液比下仅获得微弱的增益,其原因可能是因为在160mg/mL的固液比下可以实现提取的平衡,同时,过大的固液比将导致分析物从样品基质转移到溶液的过程较为困难。减少样品和溶剂的消耗,同时优先考虑目标分析物的最高提取效率是非常重要的。因此,选择三七和囊泡表面活性剂溶液的固液比为5 mg/mL-160 mg/mL为最优选择。
对比例4:三七中皂苷类活性成分的提取方法,包括以下步骤:
(1)将研磨粉碎后的三七粉加入至甲醇中,固液比为5 mg/mL,混合均匀后,在50KHz频率的超声波下超声提取20min;
(2)将超声提取液在13000 rpm下离心10 min,取上层清液,得到含有皂苷类活性成分提取液。
将实施例1与对比例4进行对比,结果如图5所示。其中a)为实施例1的液相色谱图,b)为对比例4的液相色谱图,图中A、B、C、D四个峰分别为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd的峰,对比可知,在其他条件相同的情况下,囊泡表面活性剂溶液与甲醇的提取效率相差不大,并且a)中杂峰明显比b)中的少,说明相对环保的囊泡表面活性剂溶液完全能够取代有机溶剂,又能获得较好的提取效果。
实施例12:三七中皂苷类活性成分的提取方法,包括以下步骤:
(1)将14.8 mmol的十二烷基三甲基溴化铵溶于水中,加入54.2mmol的十二烷基硫酸钠,混合后震荡摇匀30min,制备得到总重量百分比为1 % w/v的十二烷基三甲基溴化铵/十二烷基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液;
(2)将研磨粉碎后的三七粉加入至囊泡表面活性剂溶液中,固液比为160 mg/mL,混合均匀后,在50KHz频率的超声波下超声提取20min;
(3)将超声提取液在13000 rpm下离心10 min,取上层清液,得到含有皂苷类活性成分提取液。
实施例12为最优提取条件,其液相色谱结果如图6所示,图中A、B、C、D四个峰分别为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd的峰,结果可知,液相色谱图中峰高较高,杂峰较少,具有极好的提取效果。
Claims (7)
1.一种三七中皂苷类活性成分的提取方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备得到囊泡表面活性剂溶液;
(2)将研磨粉碎后的三七粉加入至囊泡表面活性剂溶液中,混合均匀,随后在超声波下超声提取,得到超声提取液;
(3)对超声提取液离心分离,取上层清液,得到含有三七中皂苷类活性成分的提取液。
2.根据权利要求1所述的一种三七中皂苷类活性成分的提取方法,其特征在于,步骤(1)中所述囊泡表面活性剂溶液为十二烷基三甲基溴化铵/十二烷基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液、十六烷基三甲基溴化铵/辛基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液、十六烷基三甲基氯化铵/辛基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液或二十六烷基二甲基溴化铵囊泡表面活性剂溶液中的一种。
3.根据权利要求2所述的一种三七中皂苷类活性成分的提取方法,其特征在于,所述十二烷基三甲基溴化铵/十二烷基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液的制备方法为:将十二烷基三甲基溴化铵溶于水中,随后加入十二烷基硫酸钠,其中十二烷基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠的摩尔比为3:7,混合均匀后将溶液振摇30 min,得到十二烷基三甲基溴化铵/十二烷基硫酸钠囊泡表面活性剂溶液。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种三七中皂苷类活性成分的提取方法,其特征在于,步骤(1)所述囊泡表面活性剂溶液的浓度为0.1%-2% w/v。
5.根据权利要求1或2或3所述的一种三七中皂苷类活性成分的提取方法,其特征在于,步骤(2)中所述三七粉和囊泡表面活性剂溶液的固液比为5 mg/mL-160 mg/mL。
6.根据权利要求1或2或3所述的一种三七中皂苷类活性成分的提取方法,其特征在于,步骤(2)中所述超声提取时间为10-30 min。
7.根据权利要求1或2或3所述的一种三七中皂苷类活性成分的提取方法,其特征在于,步骤(3)中所述离心分离的离心速度为13000-15000 rpm,离心时间为5-10 min。
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