CN107167618A

CN107167618A - 一种狼疮抗凝物检测试剂

Info

Publication number: CN107167618A
Application number: CN201710488825.6A
Authority: CN
Inventors: 赖增祖; 叶欣; 杨奎东; 徐健; 邬荣杰
Original assignee: Ai Ke Bio Tech Ltd Ningbo
Current assignee: Ai Ke Bio Tech Ltd Ningbo
Priority date: 2017-06-23
Filing date: 2017-06-23
Publication date: 2017-09-15
Anticipated expiration: 2037-06-23
Also published as: CN107167618B

Abstract

本发明公开了一种狼疮抗凝物检测试剂，包括筛选试剂和确诊试剂，所述筛选试剂和确诊试剂中均包括缓冲液、激活剂silica和合成磷脂，筛选试剂的合成磷脂含量低，确诊试剂的合成磷脂含量高，所述合成磷脂由磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和胆固醇组成，其质量比为5：30：40：15：10。本发明所述狼疮抗凝物检测试剂灵敏度高，为液体试剂，相对于DRVVT法，批间差异非常小，生产更为容易。

Description

一种狼疮抗凝物检测试剂

技术领域

本发明涉及临床检测技术领域，具体涉及的一种检测狼疮抗凝物的试剂。

背景技术

抗磷脂抗体是一类自身抗体统称，抗磷脂抗体可结合磷脂或和磷脂形成复合物的蛋白质。抗磷脂抗体根据该抗体识别的磷脂或磷脂结合蛋白质的不同而具有不同的名称。例如抗心磷脂抗体(anti-cardiolipin antibodies)、抗β2糖蛋白I抗体(anti-β2glycoprotein Iantibodies)、磷脂酰丝氨酸依赖性抗凝血酶原抗体(phosphatidylserine-dependent ant1-prothrombin antibodies)、狼疮抗凝物(lupusanticoagulant)。狼疮抗凝物最初是在红斑狼疮患者体内发现，后来发现在许多非红斑狼疮患者体内也大量存在。狼疮抗凝物形成的机理还不清楚，可能与用药有关，比如氯丙嗪，普鲁卡因胺，硫唑嘌呤等。狼疮抗凝物可引起抗磷脂抗体综合征(antiphospholipidsyndrome)，主要表现为不明原因的血栓拴塞，习惯性流产，血小板减少症，神经障碍。

狼疮抗凝物是一种获得性的抗磷脂抗体，对基于磷脂的体外血凝检测试剂如PT，APTT，DRVVT(dilute russell’s viper venom time test)等具有抑制作用，可以使PT，APTT,DRVVT的凝血时间延长。狼疮抗凝物可以结合带负电荷的磷脂复合物例如cardiolipin,phsaphatidylinositol,phosphatidylethanolamine,phosphatidylserine等(J.Clin.Invest.1980，66:397-405)，也可以和磷脂结合的血浆蛋白结合(Arch.Pathol.Lab.Med.，2002，126(11):1424-1429)。虽然在体外狼疮抗凝物可以抑制磷脂依赖性的血液凝固反应，从而使凝血时间变长，但在体内狼疮抗凝物可引起血栓的形成，具体的机理还不清楚，目前还没有证据表明狼疮抗凝物抑制凝血因子活性。

狼疮抗凝物的检测方法主要有DRVVT，APTT等。APTT是一个动态的检测方法，用以测定血浆的凝血时间。临床上APTT用来测定由于凝血因子的减少或缺失引起的出血病症，内源途径的因子缺陷或非特异性抑制因子的存在。APTT也可以用以评估肝素治疗的效果以及肝素治疗过程中的监测。APTT的检测首先用激活因子如Kaolin,ellagic acid,sillica激活FXII，在磷脂和钙离子存在的条件下，血液发生凝固。通过凝血时间的长短，以确定凝血系统是否正常。引起APTT的延长原因很多，可能是由于内源途径的某个因子的不足或缺失引起，也可能是由于大量的输血，肝素治疗，血凝因子的抑制剂，抗磷脂抗体等因素引起。当APTT延长时，要对每个可能引起的原因进行逐一检测，以确定引起凝血异常的真实原因。

DRVVT是通过RVV直接激活FX变成FXa,在低浓度的磷脂和钙离子存在的条件下引起血凝。这个途径不经过内源途径，因此可以避免VIII,IX,XI XII因子缺陷以及这些因子抑制物的干扰。

由于狼疮抗凝物的异质性，至今没有一个单一的检测方法能够检测所有的抗磷脂抗体的存在。因此狼疮抗凝物需要两种及以上的基于不同的机理的检测方法来确诊，这样才能提高狼疮抗凝物检测的准确性。APTT试剂和DRVVT用来监测狼疮抗凝物时，都包含筛选试剂和确诊试剂，筛选试剂中磷脂的含量较低，确诊试剂中磷脂的含量较高。筛选试剂磷脂含量较低，在狼疮抗凝物存在时凝血时间会延长。确诊试剂中包含较高的磷脂浓度。高浓度的磷脂可以抑制抗磷脂抗体的活性，从而使得凝血时间变短。虽然高浓度的磷脂也可以使正常的血浆凝血时间变短，但其变短的程度很小。而在含有狼疮抗凝物的血浆，高浓度的磷脂可是凝血时间大大变短。

APTT试剂和DRVVT这两种方法用于检测狼疮抗凝物的关键在于筛选试剂和确诊检测试剂的匹配，包括激活成分和所用的磷脂成分。如果不匹配，就会形成假阳性或假阴性。这使得检测狼疮抗凝物的检测试剂的生产具有很大的挑战性。因为检测狼疮抗凝物检测的试剂的活性成分在生产过程中可能会发生变化。DRVVT中的RVV是从蝮蛇毒液提取的一种酶，在溶液中稳定性很差。因此DRVVT试剂只能做成冻干粉试剂。由于稳定性的问题，DRVVT试剂在复溶后要尽快用完。冻干粉试剂本身具有很多内在的缺陷，在生产冻干粉试剂过程中需要复杂的冰冻干燥过程。首先将试剂分装到小的试剂瓶里，再将装有试剂的瓶子放到冰冻干燥机中进行冰冻干燥。在试剂分装过程中，每瓶的分装量会引起差异，同时试剂在冰冻干燥过程中，由于所处的位置不同而导致不同的冰冻干燥效果。所有这些因素导致在冻干粉检测试剂生产过程中瓶与瓶之间的质量会有很大的差异。在使用时冻干粉试剂需要复溶，在复溶时由于加入的复溶剂量的不同也会引起很大的差异。因此冻干粉形式的筛选试剂和冻干粉形式的确诊试剂的成分很难匹配，从而使得检测结果的假阳性率或假阴性率增加。

发明内容

本发明针对现有技术不足，在APTT法的基础上，通过对合成磷脂组分和含量的筛选，提供了一种高灵敏度的狼疮抗凝物检测试剂。本发明所述狼疮抗凝物检测试剂为液体，相对于干粉制剂DRVVT法，批间差异非常小，试剂的生产更为容易。

本发明具体技术方案如下：

一种狼疮抗凝物检测试剂，包括筛选试剂和确诊试剂，所述筛选试剂和确诊试剂中均包括缓冲液、激活剂silica、合成磷脂，筛选试剂的合成磷脂含量低，确诊试剂的合成磷脂含量高，所述合成磷脂由磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和胆固醇组成，其质量比为5：35：35：15：10。

优选的，所述筛选试剂中合成磷脂的浓度为40μM，确诊试剂中合成磷脂的浓度为400μM。

本发明所述缓冲液选自pH为6.5-9.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，三羟甲基氨基甲烷-咪唑缓冲液或者咪唑-盐酸缓冲液，优选pH至7.35的50mM Tris盐酸缓冲液。

为了保证缓冲溶液中的离子强度，可以选择添加无机盐如氯化钾和/或氯化钠等，优选工作浓度为100mM。

本发明所述试剂还含有防腐剂。优选为叠氮钠或者Proclin300，工作浓度为0.05％。

本发明所述的检测试剂，其特征在于还包括稳定剂，所述稳定剂选自BSA，PEG6000，蔗糖，氨基酸，海藻糖，BHA，BHT中的一种或几种。工作浓度为质量体积百分比1-10％。

本发明的一个具体的技术方案，所述筛选试剂为50mM Tris缓冲液，pH 7.35，100mM NaCl，1％BSA，1％PEG6000，0.02％BHT，0.28％silica，40μM合成磷脂，0.05％NaN₃；所述确诊试剂为50mM Tris缓冲液，pH7.35，100mM NaCl，1％BSA，1％PEG6000，0.02％BHT，0.28％silica，400μM合成磷脂，0.05％NaN₃。

本发明所述试剂在使用时，先取筛选试剂加入血样，孵育，加入氯化钙溶液(优选25mM/L)，测定凝血时间，根据结果对血样进行筛选，之后取确诊试剂加入阳性筛选血样，孵育，加入氯化钙溶液(优选25mM/L)，测定凝血时间，对血样进一步确诊。

本发明优点：

(1)现有技术下，APTT和DRVVT检测狼疮抗凝物的特异性和灵敏度不高，存在假阳性或假阴性的问题。本发明通过对合成磷脂组分和含量的筛选，显著提高了APTT检测狼疮抗凝物的灵敏度，提高了检验试剂的准确度。

(2)本发明所述试剂为液体试剂，相较于冻干粉剂制备过程简便，成本相对较低，液态试剂克服干粉试剂复溶过程或冻干过程带来的缺陷，可保证所有成份均一，灌装时不会使成分或浓度发生变化，不存在干粉制剂瓶间差，批间差的问题。此外，本发明通过加入保护剂，有效保证液体试剂的稳定性，具有很高的临床应用价值。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1合成磷脂的筛选

称取适量的合成磷脂酰丝氨酸，磷脂酰胆碱，磷脂酰甘油，磷脂酰乙醇胺，胆固醇，按不同比例(占合成磷脂的质量百分比)溶于氯仿中(具体见表1)，混匀，用氮气吹干，而后真空抽干残余的氯仿。加入一定量的蒸馏水，室温搅拌2小时，制备磷脂脂质体溶液。-20℃保存备用。

表1

磷脂组分	磷脂酰丝氨酸	磷脂酰胆碱	磷脂酰乙醇胺	磷脂酰甘油	胆固醇
						磷脂1	10％	30％	40％	15％	5％
磷脂2	10％	35％	35％	15％	5％
						磷脂3	10％	45	35％	10％	5％
磷脂4	5％	30％	40％	15％	10％
						磷脂5	5％	35％	35％	15％	10％
磷脂6	5％	45	35％	10％	5％

将上述磷脂分别加到烧杯中，加入蒸馏水，使得终浓度为10mM，在室温条件下搅拌2小时制成磷脂溶液。

配制50mM的Tris缓冲液，加入100mM/L的氯化钠，加入适量的silica(购自于Sigma)，终浓度为质量体积百分比0.28％，加入稳定剂和防腐剂，使溶液含有质量体积百分比1％BSA，1％PEG6000，0.02％BHT，0.05％的叠氮钠，调pH至7.35，分别加入表1适量配制好的合成磷脂溶液，合成磷脂终浓度为20μM，混匀得到筛选试剂。

按照仪器的说明书设好程序，在希森美康CA1500血凝仪上分别使用配制好的筛选试剂对正常血浆和狼疮抗凝物阳性血浆进行测试，测试参数为：取50μl的筛选试剂加入反应管中，加入50μl血样，37℃孵育3分钟，加入50μl浓度为25mM/L的氯化钙溶液，测定凝血时间。结果如表2所示。

表2含有不同磷脂的筛选试剂检测正常血浆和狼疮抗凝物阳性血浆结果

从表结果看出利用磷脂4配制的狼疮抗凝物筛选试剂对狼疮抗凝物阳性血浆检测时凝血时间为84.2秒，尽管不是最长，但狼疮抗凝物阳性血浆/正常血浆的结果比率最高，因此对狼疮抗凝物灵敏度最高，选取磷脂4的组分进一步优化制备筛选试剂以及确诊试剂。

实施例2本发明所述狼疮抗凝物的试剂的配制

(1)筛选试剂的配制

配制50mM的Tris缓冲液,加入100mM的氯化钠,加入适量的silica(终浓度为0.28％)，加入稳定剂和防腐剂，使溶液含有质量体积百分比1％BSA，1％PEG6000，0.02％BHT，0.05％的叠氮钠，调pH至7.35，加入适量配制好的实例1中磷脂4溶液，使其终浓度分别为10μM，40μM，160μM混匀。按照仪器的说明书设好程序，在希森美康CA1500血凝仪上利用配制好的筛选试剂对正常血浆和狼疮抗凝物阳性血浆进行测试，测试参数为：取50μl的筛选试剂加入反应管中，加入50μl血样，37度孵育3分钟，加入50μl浓度为25mM/L的氯化钙溶液，测定凝血时间，结果如表3所示。

表3含有不同磷脂浓度的筛选试剂检测正常血浆和狼疮抗凝物阳性血浆结果

结果表明当用的磷脂浓度为40μM时，检测试剂检测正常血浆的凝血时间为40.2秒，狼疮抗凝物阳性血浆的凝血时间为81.4秒，狼疮抗凝物阳性血浆/正常血浆的值为2.02。尽管磷脂浓度为10μM的筛选试剂检测狼疮抗凝物阳性血浆的凝血时间比磷脂浓度为40μM的筛选试剂长，但磷脂浓度为40μM的筛选试剂的狼疮抗凝物阳性血浆/正常血浆的值为1.87。这说明磷脂浓度为40μM时，筛选试剂对狼疮抗凝物的检测灵敏度最高。

(2)确诊试剂的配制

配制50mM的Tris缓冲液,加入100mM的氯化钠,加入适量的silica，(终浓度为0.28％)，加入稳定剂和防腐剂，使溶液含有质量体积百分比1％BSA，1％PEG6000，0.02％BHT，0.05％的叠氮钠，调pH至7.35，加入适量配制好的磷脂溶液，使其终浓度分别为200μM，400μM，800μM混匀。按照仪器的说明书设好程序，在希森美康CA1500血凝仪上利用配制好的确诊试剂对正常血浆和狼疮抗凝物阳性血浆进行测试，测试参数为：取50μl的确诊试剂加入反应管中，加入50μl血样，37度孵育3分钟，加入50μl浓度为25mM/L的氯化钙溶液，测定凝血时间，结果如表4所示。

表4确诊试剂检测正常血浆和狼疮抗凝物阳性血浆结果

结果表明磷脂浓度为400μM时，确诊试剂检测正常血浆凝血时间有所下降，但检测狼疮抗凝物阳性血浆时凝血时间下降的更多，狼疮抗凝物阳性血浆/正常血浆的值为1.64，比磷脂浓度为200μM的确诊试剂灵敏度高，尽管磷脂浓度为800μM的确诊试剂灵敏度更高，但是其正常血浆的凝血时间反而延长了。因此选择磷脂浓度为400μM制备确诊试剂。

实施例3稳定性

按照实例2配制筛选试剂和确诊试剂，将试剂放置于4℃，37℃孵育，每隔7天取样检测。结果如表5所示。

表5

结果显示37℃存放28天狼疮抑制物检测试剂检测结果变化不大，稳定性很好。

Claims

1.一种狼疮抗凝物检测试剂，包括筛选试剂和确诊试剂，所述筛选试剂和确诊试剂中均包括缓冲液、激活剂silica、合成磷脂，筛选试剂的合成磷脂含量低，确诊试剂的合成磷脂含量高，其特征在于所述合成磷脂由磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和胆固醇组成，其质量比为5：30：40：15：10。

2.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于所述筛选试剂中合成磷脂的浓度为40µM，确诊试剂中合成磷脂的浓度为400µM。

3.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于所述缓冲液选自pH为6.5-9.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，三羟甲基氨基甲烷-咪唑缓冲液或者咪唑-盐酸缓冲液。

4.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于所述缓冲液中还含有无机盐。

5.如权利要求4所述的检测试剂，其特征在于所述无机盐为氯化钾或者氯化钠。

6.如权利要求1-5任一项所述的检测试剂，其特征在于所述试剂还含有防腐剂。

7.如权利要求6所述的检测试剂，其特征在于所述防腐剂为叠氮钠或者Proclin300。

8.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于还包括稳定剂，所述稳定剂选自BSA，PEG6000，蔗糖，氨基酸，海藻糖，BHA，BHT中的一种或几种。

9.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于所述筛选试剂为50 mM Tris 缓冲液，pH7.35，100 mM NaCl，1%BSA，1%PEG6000，0.02%BHT，0.28%silica，40µM合成磷脂，0.05%NaN₃；所述确诊试剂为50mM Tris 缓冲液，pH 7.35，100mM NaCl，1%BSA，1%PEG6000，0.02%BHT，0.28%silica，400µM合成磷脂，0.05%NaN₃。