CN107164469A - 筛选与紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法 - Google Patents

筛选与紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种筛选紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法，包括克隆体培养、基因组DNA提取、设计微卫星引物、PCR扩增和数据统计与分析。有益效果为：本发明可快速得到大量的经微卫星引物标记的紫背浮萍的DNA序列，微卫星标记检测速度快，可快速获得紫背浮萍Sp25和Sp30遗传标记基因座呈现高度遗传变异的多态性图谱。紫背浮萍的叶长与 Sp30、叶宽与 Sp25 位点显著相关（P 均小于 0.05），Sp25位点基因型为 CE 的紫背浮萍叶片形态最大，且数量最多。

Description

筛选与紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法
技术领域
本发明涉及DNA分子标记技术领域，具体是一种筛选紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法。
背景技术
富、高度杂合且稳定性好、遵循孟德尔分离定律共显性遗传、易于PCR扩增等特点，已成为近年来广泛应用的DNA标记，常应用于生物资源的家系谱系认证、基因连锁分析、遗传图谱构建、种质鉴定、种群遗传多样性等许多研究领域。
在自然环境中，紫背浮萍基本以无性生殖进行繁殖，当环境条件适宜时2天即可克隆出一代，种群遗传多样性水平较低。
现有技术提供多种卫星标记的检测方法，例如，中国发明授权专利文献 一种锈斑蟳微卫星标记的快速检测方法 授权公告号 CN 103305611 B该发明涉及一种锈斑蟳微卫星标记的快速检测方法，包括 ： （1）锈斑蟳基因组 DNA 的提取 ； （2）根据 GeneBank 数据库中锈斑蟳的功能基因序列，获得含有微卫星重复的基因序列 ； （3）微卫星标记引物的设计 ； （4）锈斑蟳不同个体的基因组 DNA的 PCR 扩增 ； （5）PCR 产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。该发明的检测方法具有快速、准确、灵敏等优点，能够直观地检测出锈斑蟳不同个体的基因型，从而快速获得锈斑蟳在功能基因微卫星位点遗传变异的多态性图谱，该微卫星标记可应用于锈斑蟳遗传变异与种群遗传多样性分析等领域，但微卫星标记检测速度还有提升空间。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速筛选与紫背浮萍叶生长相关的分子标记方法，清晰紫背浮萍的叶数/株、叶长和叶宽与相关DNA位点的关系。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：筛选紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法，包括克隆体培养、基因组DNA提取、设计微卫星引物、PCR扩增和数据统计与分析。
作为优选，植株克隆体培养的营养液成份及其浓度为：氮0.3~0.4g/L、磷酐0.1~0.15 g/L、氧化钾0.16~0.23 g/L、氧化镁0.01~0.015 g/L和硫0.012~0.02 g/L。上述营养液能全面提供紫背浮萍生长所需的大量元素和微量元素，无性繁殖速度快，基因突变的概率低，可得到大量基因相同的植株，样本量足。
作为优选，植株克隆体在光照培养箱中进行室内培养50~70d，培养条件为22.5~23.5℃，湿度73~83%，光照强度为1800~2200lux，光暗时间14~16:10~8h。上述培养条件下，紫背浮萍的光合作用强，生长速度快。
作为优选，微卫星引物为：Sp25:F: GGCAGAGACAGAAAGATCATC；R:CCTAGTTCCCTAGAGCGAGAG；Sp30：F: CGCCTATAAGTAACCCCCTAC；R: ATCATATCTGCTCGAACCATC。
作为优选，PCR扩增体系为18~22ul，其中包括 3.4~4.2U Taq DNA 聚合酶（Sangon）、1.6~2.2ul10×PCRbuffer、0.7~0.9mMdNTP、上游、下游引物各 0.3mM、50~100ngDNA 模板，ddH2O 补至终体积 20ul；在Bio-Rad PCR扩增仪上进行扩增，扩增程序为92~96℃预变性4.5~5.6min；93~96℃变性28~33s，52~56℃复性33~37s，70~75℃延伸36~43s，共33~38个循环；最终 70~75℃延伸2.5~3.4min。上述PCR扩增可快速得到大量的经微卫星引物标记的紫背浮萍的DNA序列。
作为优选，数据统计与分析为对浮萍克隆的叶数/株、叶长和叶宽进行统计描述，应用单因素方差分析和最小显著差数法或 Dunnett T3 非参数多重比较两两基因型生长性状特征之间的差异性；应用一般线性模型过程对叶数/株、叶长和叶宽性状与微卫星位点的关联性进行最小二乘分析, 并对同一位点的各基因型进行多重比较。紫背浮萍的叶长与Sp30、叶宽与 Sp25 位点显著相关（P 均小于 0.05），Sp25位点基因型为 CE 的紫背浮萍叶片形态最大，且数量最多。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明可快速得到大量的经微卫星引物标记的紫背浮萍的DNA序列，微卫星标记检测速度快，可快速获得紫背浮萍Sp25和Sp30遗传标记基因座呈现高度遗传变异的多态性图谱。紫背浮萍的叶长与 Sp30、叶宽与 Sp25 位点显著相关（P 均小于 0.05），Sp25位点基因型为 CE 的紫背浮萍叶片形态最大，且数量最多。了解基因型差异对紫萍生长以及污染物净化能力的影响，提高废水的生物治理效率。
具体实施例
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
筛选紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法，包括克隆体培养、基因组DNA提取、设计微卫星引物、PCR扩增和数据统计与分析。
植株克隆体培养的营养液成份及其浓度为：氮0.3~0.4g/L、磷酐0.1~0.15 g/L、氧化钾0.16~0.23 g/L、氧化镁0.01~0.015 g/L和硫0.012~0.02 g/L。上述营养液能全面提供紫背浮萍生长所需的大量元素和微量元素，无性繁殖速度快，基因突变的概率低，可得到大量基因相同的植株，样本量足。
植株克隆体在光照培养箱中进行室内培养50~70d，培养条件为22.5~23.5℃，湿度73~83%，光照强度为1800~2200lux，光暗时间14~16:10~8h。上述培养条件下，紫背浮萍的光合作用强，生长速度快。
微卫星引物为：Sp25:F: GGCAGAGACAGAAAGATCATC；R: CCTAGTTCCCTAGAGCGAGAG；Sp30：F: CGCCTATAAGTAACCCCCTAC；R: ATCATATCTGCTCGAACCATC。
PCR扩增体系为18~22ul，其中包括 3.4~4.2U Taq DNA 聚合酶（Sangon）、1.6~2.2ul10×PCRbuffer、0.7~0.9mMdNTP、上游、下游引物各 0.3mM、50~100ng DNA 模板，ddH2O 补至终体积 20ul；在Bio-Rad PCR扩增仪上进行扩增，扩增程序为92~96℃预变性4.5~5.6min；93~96℃变性28~33s，52~56℃复性33~37s，70~75℃延伸36~43s，共33~38个循环；最终 70~75℃延伸2.5~3.4min。上述PCR扩增可快速得到大量的经微卫星引物标记的紫背浮萍的DNA序列。
数据统计与分析为对浮萍克隆的叶数/株、叶长和叶宽进行统计描述，应用单因素方差分析和最小显著差数法或 Dunnett T3 非参数多重比较两两基因型生长性状特征之间的差异性；应用一般线性模型过程对叶数/株、叶长和叶宽性状与微卫星位点的关联性进行最小二乘分析, 并对同一位点的各基因型进行多重比较。紫背浮萍的叶长与 Sp30、叶宽与 Sp25 位点显著相关（P 均小于 0.05），Sp25位点基因型为 CE 的紫背浮萍叶片形态最大，且数量最多。
实施例2：
筛选紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法，包括克隆体培养、基因组DNA提取、设计微卫星引物、PCR扩增和数据统计与分析。
植株克隆体培养的营养液成份及其浓度为：氮0.32g/L、磷酐0.12 g/L、氧化钾0.19g/L、氧化镁0.012 g/L和硫0.016g/L。上述营养液能全面提供紫背浮萍生长所需的大量元素和微量元素，无性繁殖速度快，基因突变的概率低，可得到大量基因相同的植株，样本量足。
植株克隆体在光照培养箱中进行室内培养60d，培养条件为23℃，湿度78%，光照强度为2000lux，光暗时间16: 8h。上述培养条件下，紫背浮萍的光合作用强，生长速度快。
微卫星引物为：Sp25:F: GGCAGAGACAGAAAGATCATC；R: CCTAGTTCCCTAGAGCGAGAG；Sp30：F: CGCCTATAAGTAACCCCCTAC；R: ATCATATCTGCTCGAACCATC。
PCR扩增体系为20ul，其中包括 4U Taq DNA 聚合酶（Sangon）、2ul10×PCRbuffer、0.8mMdNTP、上游、下游引物各 0.3mM、50-100ng DNA 模板，ddH2O 补至终体积20ul。在Bio-Rad PCR扩增仪上进行扩增，扩增程序为94℃预变性5 min；94℃变性30s，54℃复性 35s，72℃延伸 40s，共 35 个循环；最终 72℃延伸 3min。PCR 扩增产物在 3730XL测序仪上进行毛细管电泳检测。上述PCR扩增可快速得到大量的经微卫星引物标记的紫背浮萍的DNA序列。
数据统计与分析为对浮萍克隆的叶数/株、叶长和叶宽进行统计描述，应用单因素方差分析和最小显著差数法或 Dunnett T3 非参数多重比较两两基因型生长性状特征之间的差异性；应用一般线性模型过程对叶数/株、叶长和叶宽性状与微卫星位点的关联性进行最小二乘分析, 并对同一位点的各基因型进行多重比较。紫背浮萍的叶长与 Sp30、叶宽与 Sp25 位点显著相关（P 均小于 0.05），Sp25位点基因型为 CE 的紫背浮萍叶片形态最大，且数量最多。
实施例3：
筛选紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法，包括克隆体培养、基因组DNA提取、设计微卫星引物、PCR扩增和数据统计与分析。
植株克隆体培养的营养液成份及其浓度为：氮 0.32g/L、磷酐 0.12g/L、氧化钾0.2g/L、氧化镁 0.013g/L和硫 0.017g/L。上述营养液能全面提供紫背浮萍生长所需的大量元素和微量元素，无性繁殖速度快，基因突变的概率低，可得到大量基因相同的植株，样本量足。
对不同培养系中的每一植株（叶片相连）计数叶片的数量，对每一叶片计数根的数量，使用游标卡尺测量叶片的叶长（叶片最长长度）、叶宽（叶片最短长度）及每条根的长度。
微卫星引物为：Sp25:F: GGCAGAGACAGAAAGATCATC；R: CCTAGTTCCCTAGAGCGAGAG；Sp30：F: CGCCTATAAGTAACCCCCTAC；R: ATCATATCTGCTCGAACCATC。
采用改良的CTAB方法提取紫背浮萍和少根紫萍基因组 DNA。PCR扩增体系为20ul，其中包括 4U Taq DNA 聚合酶（Sangon）、2ul10×PCRbuffer、0.8mMdNTP、上游、下游引物各0.3mM、50-100ng DNA 模板，ddH2O 补至终体积 20ul。在Bio-Rad PCR扩增仪上进行扩增，扩增程序为94℃预变性5 min；94℃变性30s，54℃复性 35s，72℃延伸 40s，共 35 个循环；最终 72℃延伸 3min。PCR 扩增产物在 3730XL 测序仪上进行毛细管电泳检测。
数据统计与分析为采用 SPSS19.0 对实验数据进行统计分析。对浮萍克隆的叶数/株、叶长和叶宽进行统计描述，应用单因素方差分析（One-way ANOVA）和最小显著差数法（Least-significant difference，LSD）或 Dunnett T3 非参数多重比较两两基因型生长性状特征之间的差异性；应用一般线性模型（General linear models, GLM）过程对叶数/株、叶长和叶宽性状与微卫星位点的关联性进行最小二乘分析, 并对同一位点的各基因型进行多重比较。紫背浮萍的叶长与 Sp30、叶宽与 Sp25 位点显著相关（P 均小于0.05），Sp25位点基因型为 CE 的紫背浮萍叶片形态最大，且数量最多。了解基因型差异对紫萍生长以及污染物净化能力的影响，提高废水的生物治理效率。
微卫星标记扫描：
用毛细管电泳检测2个微卫星标记的紫背浮萍。结果显示，3 个紫背浮萍克隆为3个不同的 MLGs。
表1紫背浮萍3个克隆在2个微卫星位点的基因型
表2两个微卫星位点不同基因型在紫背浮萍叶生长性状的多重比较
紫背浮萍3 个克隆在实验室内分别培养得到 155~162 个分株，叶片总数为441~450。由表2可看出紫背浮萍3 个 MLGs分株所含叶片数量最少为 1 片，最多 8 片。其中，MLGsⅡ每一分株的平均叶片数最少，为 2.7±0.1（平均数±标准误差）叶数/株，MLGsⅠ和Ⅲ为 2.9±0.1 叶数/株。紫背浮萍平均叶长达到 6.05±0.12mm，平均叶宽为 4.58±0.10mm。由此可看出紫背浮萍的叶长与 Sp30、叶宽与 Sp25 位点显著相关（P 均小于 0.05），位点 Sp25基因型 CE 的紫背浮萍具有最大和最多的叶状体。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江海洋大学
<120> 筛选与紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ggcagagaca gaaagatcat c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cctagttccc tagagcgaga g 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
cgcctataag taacccccta c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
atcatatctg ctcgaaccat c 21

Claims (6)

1.筛选与紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法，其特征在于：所述的方法包括克隆体培养、基因组DNA提取、设计微卫星引物、PCR扩增和数据统计与分析。
2.根据权利要求1所述的筛选与紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法，其特征在于：所述的植株克隆体培养的营养液成份及其浓度为：氮0.3~0.4g/L、磷酐0.1~0.15 g/L、氧化钾0.16~0.23 g/L、氧化镁0.01~0.015 g/L和硫0.012~0.02 g/L。
3.根据权利要求1所述的筛选与紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法，其特征在于：所述的植株克隆体在光照培养箱中进行室内培养50~70d，培养条件为22.5~23.5℃，湿度73~83%，光照强度为1800~2200lux，光暗时间14~16:10~8h。
4.根据权利要求1所述的筛选与紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法，其特征在于：所述的微卫星引物为：Sp25:F: GGCAGAGACAGAAAGATCATC；R: CCTAGTTCCCTAGAGCGAGAG；Sp30：F: CGCCTATAAGTAACCCCCTAC；R: ATCATATCTGCTCGAACCATC。
5.根据权利要求1所述的筛选与紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法，其特征在于：所述的PCR扩增体系为18~22ul，其中包括 3.4~4.2U Taq DNA 聚合酶（Sangon）、1.6~2.2ul10×PCRbuffer、0.7~0.9mMdNTP、上游、下游引物各 0.3mM、50~100ng DNA 模板，ddH2O 补至终体积 20ul；在Bio-Rad PCR扩增仪上进行扩增，扩增程序为92~96℃预变性4.5~5.6min；93~96℃变性28~33s，52~56℃复性33~37s，70~75℃延伸36~43s，共33~38个循环；最终 70~75℃延伸2.5~3.4min。
6.根据权利要求1所述的筛选与紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法，其特征在于：所述的数据统计与分析为对浮萍克隆的叶数/株、叶长和叶宽进行统计描述，应用单因素方差分析和最小显著差数法或 Dunnett T3 非参数多重比较两两基因型生长性状特征之间的差异性；应用一般线性模型过程对叶数/株、叶长和叶宽性状与微卫星位点的关联性进行最小二乘分析, 并对同一位点的各基因型进行多重比较。
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