CN107164387B

CN107164387B - 一种低锰利用基因、蛋白、重组表达载体及其制备与应用

Info

Publication number: CN107164387B
Application number: CN201710456941.XA
Authority: CN
Inventors: 黄朝锋; 高会玲; 谢文香
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2017-06-16
Filing date: 2017-06-16
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2037-06-16
Also published as: CN107164387A

Abstract

本发明公开了一种低锰利用基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。还公开了一种含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的重组表达载体及其制备方法，一种重组表达转化体及其制备方法，以及一种低锰利用基因的超表达植物株系及其制备方法。本发明还公开了一种低锰利用基因编码的蛋白在提高植株对低锰的耐受能力中的应用，在低锰环境下，该蛋白在植株体内参与锰的装载及细胞内再利用的过程，超表达该基因的株系能够显著增强植物对低锰的耐受能力。

Description

一种低锰利用基因、蛋白、重组表达载体及其制备与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种低锰利用基因、蛋白、重组表达载体、重组表达转化体、超表达植物株系及其制备方法，还涉及一种低锰利用基因在提高植株对低锰的耐受能力中的应用。

背景技术

锰在地壳中是第二大最普遍的过渡金属元素，由于元素锰具有多种价态，在土壤中容易被氧化还原，且氧化形式的锰具有较低的移动性，因此锰的有效性经常受到外界环境的影响。随着人类的活动及化肥的施用，世界上接近三分之一的土壤成为碱性土壤，在这种严重的土壤环境条件下，锰缺乏对于作物的生长发育来说是一个重要的问题。锰是植物生长发育的必需微量元素，参与植物体内多种重要的代谢过程，例如光合作用、蛋白质和脂质的合成、调节多种酶活性、氧化胁迫等。植物在缺锰条件下，症状首先表现在幼叶，叶片失绿变黄，但叶脉和叶脉附近区域保持绿色，叶脉较为清晰。在缺锰较为严重时，植物叶片出现黑褐色斑点，并会逐渐扩大散布于整个叶片。相对而言锰在单子叶植物中较易移动，谷类作物常在中等叶龄和老叶上发生缺锰症状。有些植物的叶片会发生卷曲，植物瘦小，花的发育不良，根系较弱。典型的缺锰症状像燕麦的“灰斑病”，豆类植物的“沼泽斑点病”，甜菜的“黄斑病”，菠菜的“黄病”等等。锰的化学性质活泼，在环境中有Mn¹⁺，Mn²⁺，Mn³⁺，Mn⁴⁺，Mn⁶⁺和Mn⁷⁺等多种价态，其中最易被植物吸收利用的是二价的锰离子。土壤的pH值是影响锰有效性的最大因素，随着pH值降低会使锰的有效性升高。在中性或较高pH条件下，锰以Mn³⁺和Mn⁴⁺价态为主要价态，会很容易形成难溶性的锰氧化物，而可被植物有效吸收利用的Mn²⁺较少，从而导致碱性土壤上植物表现出缺锰的症状。而在pH小于5.5的南方酸性土壤中则会出现锰毒的现象。在碱性土壤中锰缺乏问题是影响作物生产的一个重要限制因子。因此深入探讨植物对营养元素锰的吸收、转运及内平衡机制，特别是植物在缺锰环境下的适应机理和植物锰营养效率的遗传研究，对改善植物营养状况具有重要意义。为应对碱性土壤中植物缺锰的问题，通过遗传改良提高作物吸收利用锰的效率将是一个重要途径，而这一途径的顺利实现有赖于对锰吸收、转运机制的充分了解和锰吸收利用相关基因的克隆和功能解析。

发明内容

为了提高低锰环境下植物对锰的吸收，本发明提供了以下技术方案：

本发明在第一方面提供了一种低锰利用基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

本发明还提供了基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明另外还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体含有如SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列。

上述重组表达载体的制备方法包括以下步骤：

步骤1、扩增核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因的开放阅读框；

步骤2、将步骤1中扩增的核苷酸片段构建于超表达载体；

步骤3、测序，获得测序结果正确的重组表达载体。

优选地，在步骤1中，用于扩增所述基因的引物如SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6所示。

优选地，在步骤2中，超表达载体为pEarleyGate 101或pCAMBIA1305-C-3*HA。

本发明还提供了一种重组表达转化体，该重组表达转化体包含上述重组表达载体。

上述重组表达转化体的制备方法包括将该重组表达载体转化至宿主微生物。

优选地，转化包括化学转化法、热激法或电转法。

优选地，上述宿主微生物为根癌农杆菌。

更优选地，上述宿主微生物为根癌农杆菌GV3101。

本发明在另一方面提供了一种低锰利用基因的超表达植物株系，该超表达植物株系超表达核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因。

优选地，上述植物株系为拟南芥株系。

上述超表达植物株系的制备方法包括以下步骤：

步骤2、将步骤1中扩增的核苷酸片段构建于超表达载体；

步骤3、测序，获得测序结果正确的重组表达载体；

步骤4、将上述重组表达载体转化至根癌农杆菌；

步骤5、挑取上述根癌农杆菌的单克隆至培养液进行培养；

步骤6、将菌体离心，加入侵染试剂，侵染目标株系；

步骤7、筛选转基因阳性株系。

优选地，步骤1中，用于扩增上述基因的引物如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6所示。

优选地，步骤2中，超表达载体为pEarleyGate 101或pCAMBIA1305-C-3*HA。

优选地，步骤4中，根癌农杆菌为根癌农杆菌GV3101。

优选地，步骤5中，挑取单克隆于含卡纳霉素、庆大霉素和利福平抗性LB培养液中，28℃震荡培养24-36h。

优选地，步骤6中，侵染试剂为5％蔗糖和1/2000Silwet(均为终浓度)。

优选地，步骤6中，目标株系为拟南芥株系。

更优选地，步骤6中，目标株系为拟南芥野生型Col-0。

优选地，步骤7中，用Basta抗性筛选该转基因阳性株系。

本发明在又一方面提供了一种低锰利用基因在提高植株对低锰的耐受能力中的应用，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选地，上述植株为拟南芥。

优选地，上述基因编码的蛋白在植株细胞内定位于内膜系统的反式高尔基体上。

优选地，在低锰环境下，上述基因编码的蛋白在植株体内参与锰由地下往地上部的装载及细胞内再利用的过程。

本发明提供的技术方案能够显著提高植物对低锰的耐受能力，对改善植物营养状况具有重要意义。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。所以凡是不脱离本发明所公开的原理下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。

附图说明

图1示出了本发明较优实施例中突变体mdg1nramp1在缺锰和足量锰条件下的表型；

图2示出了本发明较优实施例中突变体mdg1nramp1对Fe²⁺、Zn²⁺和Cd²⁺的响应；三个材料(WT、nramp1、mdg1nramp1)分别点在不同浓度的Fe²⁺、Zn²⁺和Cd²⁺培养基上生长8d左右，从左至右依次为：低Fe(50μM菲咯嗪)、正常Fe(20μM)和足量Fe(50μM)；低Zn(10μM TPEN)、正常Zn(约0.4μM)和足量Zn(4μM)；不同浓度的Cd处理(0、40、80μM CdCl₂)，最后对根长进行测量；

图3示出了本发明较优实施例中NRAMP2的基因结构图以及突变位点；

图4示出了本发明较优实施例中NRAMP2的跨膜结构域分析；NRAMP2共有12个跨膜结构域，在最后一个跨膜结构域上由色氨酸W突变为终止子TGA，图中星号标记为突变位点；

图5示出了本发明较优实施例中NRAMP2的亚细胞定位图；携带NRAMP2-GFP和特异细胞器标记蛋白的质粒共转入拟南芥原生质体，通过激光共聚焦显微镜观察荧光；A：NRAMP2-GFP与Man I-RFP共转荧光图；B：NRAMP2-GFP与ARA-7共转荧光图；C：NRAMP2-GFP与ST-mCherry共转荧光图；D：NRAMP2-GFP与SYP61-mCherry共转荧光图；

图6示出了本发明较优实施例中超表达株系的表型与元素含量分析；其中图6a-b为水培条件下对WT、OxNRAMP2进行-Mn和+Mn(10μM)处理7d，拍照并进行根长统计分析；图6c为水培长期缺锰条件下WT(左)和OxNRAMP2(右)的表型；图6d为水培条件下对WT、OxNRAMP2进行-Mn和+Mn处理，对地上部及根组织进行取样，ICP-MS分析锰、铁、锌元素含量。

具体实施方式

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

MDG1基因的克隆

1、短根突变体mdg1nramp1的筛选

本实施例中所用的植物材料为拟南芥(Arabidopsis thaliana)。在缺锰的条件下，nramp1突变体(T-DNA插入)生长受到抑制，基于nramp1对锰的敏感性，本实施例中采用EMS化学诱变方法对nramp1进行诱变，建立突变体库，筛选到一株锰依赖的短根突变体mdg1nramp1，在低锰条件下其根长受到显著抑制，但是在加锰的培养基条件下mdg1nramp1根长能够恢复至野生型水平，且根长表型在较短的时间内即可快速响应缺锰处理。其筛选方法具体如下：

步骤1、建立EMS诱变库

首先将订购的nramp1突变体进行PCR基因型鉴定。鉴定出的纯合突变体种子在光照培养室(16h光照/8h黑暗，22℃)培养，收获大量纯合体种子，然后进行EMS化学诱变。取4g(约30000粒)的nramp1纯合体种子，放入50mL灭菌的离心管中，加入40mL磷酸缓冲液(100mM)，放入4℃冰箱内过夜。消毒：用8％的次氯酸钠溶液悬浮震荡10分钟进行表面消毒，再用灭菌ddH₂O清洗至少4次。重新加入40mL磷酸缓冲液(100mM)，同时加入160μL的EMS诱变剂(0.4％终浓度)，在翻转仪上于室温环境下温和摇动8小时。8小时后离心，去上清液，加入40mL灭菌水进行清洗，重复洗20次。将清洗后的种子点在1/2MS琼脂培养皿上，琼脂培养基的配方如下：1/2MS、2％蔗糖，0.6％琼脂，KOH调pH至5.6-5.8，121℃高温高压灭菌20分钟。将播种后的种子放在光照培养箱内培养一周左右(16h光照/8h黑暗，温度22℃)。最后将培养皿里的幼苗移栽至育苗容器内(45×35cm)，每个容器种植约500棵单株，每个育苗容器当作一个种子池，一共种植约52个种子池并进行编号n1-n52。所选用基质为营养土混蛭石，定期加营养液，保证幼苗正常生长。待种子成熟，进行收获并在种子储藏柜内烘干种子水分备用。

步骤2、突变体的筛选

首先从每个种子池中取约5000粒M₂种子进行锰缺陷突变体的筛选，选取种子进行8％次氯酸钠溶液表面消毒处理，涡旋混匀10min，然后用灭菌ddH₂O洗涤3次以上，消毒好的种子置于4度冰箱春化3d。筛选突变体所用培养基为改动过的1×Hoagland(缺Mn²⁺)固体培养基，配方如下：5mM KNO₃,5mM Ca(NO₃)₂,2mM MgSO₄,1mM NH₄H₂PO₄,3μM H₃BO₃,1μM(NH₄)₆Mo₇O₂₄,0.4μM ZnSO₄,0.2μM CuSO₄,20μM EDTA-Fe(III)Na,20μM EDTA-2Na，2％蔗糖,1％琼脂粉(Sigma，CAS：9002-18-0),pH 5.7左右，121℃高温高压灭菌20min，冷却后倒在方形培养皿中(9×9cm)。将春化好的种子种在灭菌后的固体培养基上，垂直放在光照培养箱内进行培养10d，拿出培养皿在超净工作台上进行锰缺陷突变体的筛选，筛选表型包括叶片黄化、根长变短、褐色斑点、植株矮小等等。将初步筛选出的突变体移栽至重新配好的锰充足1×Hoagland(含20μM MnSO₄)固体培养基中进行再培养，观察相关突变表型是否能够恢复到野生型水平，统计编号并做好实验记录。最后将筛选到的突变体种植在营养土中培养，直至收获M₃代种子并进行表型的再次鉴定。再次鉴定突变体需同时准备好缺锰和足量锰的固体培养基，将单株收的M3种子点在上述培养基中垂直生长8d左右观察表型，并与上一代表型进行比较。

通过EMS对nramp1突变体进行诱变，共建了52个种子诱变库n1-n52。在低锰培养基条件下对n1-n3种子池进行锰缺陷突变体的筛选，每个池挑选约5000粒M₂代种子作为基准，通过观察在缺锰培养基上的表型变化，最终确认了一株锰依赖的短根突变体，命名为mdg1nramp1，Mn-dependent defective growth(mdg)，这个突变体在添加足量锰的条件下表型能得到完全恢复。为了确认筛选突变体的表型，将M₃代突变体种子分别点在缺锰和足量锰(20μM)的固体培养基上竖直培养。结果显示，在缺锰的条件下，与WT相比，nramp1突变体的根长部分变短，而mdg1nramp1突变体根长受到严重抑制，地上部同时也变小；在外加足量锰的条件下mdg1nramp1突变体的锰缺陷表型得到完全恢复，如图1所示。观察低锰条件下突变体的根细胞结构发现，mdg1nramp1在缺锰处理后根的表皮细胞长度显著缩短，同时在体式镜下观察根毛结构发现，根毛数目减少，受到明显抑制。

研究表明，锰的转运蛋白具有广泛的底物特性，不仅能够转运Mn²⁺，同时能够转运其它二价金属离子如Fe²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺等。为了探究mdg1nramp1突变体的根长表型是否受到其它金属离子的影响，将WT、nramp1、mdg1nramp1分别点在含不同浓度Fe²⁺、Zn²⁺和Cd²⁺的培养基上。统计结果显示，与正常条件下相比，铁或锌缺乏以及添加不同浓度的镉处理均能够显著抑制植物根的正常生长，但是mdg1nramp1突变体在不同金属Fe²⁺、Zn²⁺和Cd²⁺处理条件下根长与对照WT和nramp1相比差异不显著，结果如图2所示。由此可以推测mdg1nramp1突变体的根长表型是锰特异的。

2、遗传定位群体的构建及全基因组测序

首先将mdg1nramp1突变体与nramp1进行杂交得到F1，F1在缺锰培养基上观察表型，F1继续自交获得F2。在缺锰的培养基上，挑选F2群体中根长受到抑制的突变株，并统计遗传分离比例，统计结果分析显示，F2群体中，表型与mdg1nramp1一致的短根突变体与nramp1根长一致的突变体分离比接近1：3，卡方检验约等于0.4，p>0.5，由此说明突变表型是由隐性单基因控制。

将所挑选的短根突变体群体移栽至营养土中，在光照培养室内生长一个月左右，采用CTAB法提取叶片DNA，进行高通量基因组测序，测序结果结合dCAPS分子标记技术，对目的基因进行精细定位。结果显示，突变基因可能位于第一号染色体上。挑出编码区发生非同义突变的位点，根据这些突变位点发展dCAPS分子标记，最后发现突变基因位于FR3标记处。mdg1突变基因为At1g47240(AtNRAMP2)。根据TAIR网站公布的基因信息，MDG1包含四个外显子，三个内含子，突变位点G-A的替换发生在最后一个外显子上，从而使TGG(编码色氨酸W)突变后变为终止密码子TGA，导致MDG1的提前终止，如图3所示。根据TAIR网站上公布的序列信息，NRAMP2编码区共含有1593bp，编码530个氨基酸。根据跨膜结构域网站http://www.enzim.hu/hmmtop/预测的信息，对NRAMP2进行了跨膜结构分析，发现NRAMP2共有12个跨膜结构域，说明NRAMP2是一个膜蛋白，而nramp2突变位点位于最后一个跨膜结构域，致使NRAM2缺失39个氨基酸序列，如图4所示。

NRAM2的亚细胞定位

首先通过扩增NRAMP2的开放阅读框(不含终止密码子)，通过Gateway方法连入载体pEarleyGate 101中。测序成功的质粒转化农杆菌，后按照农杆菌侵染的方法分别转化野生型Col-0(超表达株系的构建)和nramp2nramp1突变体，通过Basta抗性筛选获得转基因阳性植株。T3代转基因纯合植株进行表型验证，分别在-Mn和+Mn培养基上观察表型拍照。同时在激光共聚焦显微镜下观察YFP荧光情况。为了细致地对NRAMP2进行亚细胞定位，构建了35S：NRAMP2-GFP瞬时表达质粒，与一些已知的细胞内膜系统的标记蛋白在拟南芥原生质体进行共表达，包括液泡前体(PVC标记：RFP-ARA7)，顺式高尔基体(cis-Golgi标记：ManI-RFP)，反式高尔基体(TGN标记：SYP61-mCherry)，高尔基体(Golgi标记：ST-mCherry)。最后通过激光共聚焦观察共定位的荧光。结果如图5所示，可见35S:NRAMP2-GFP不与液泡前体PVC(RFP-ARA7)或者顺式高尔基体(ManI-RFP)共定位,而与高尔基体(ST-mCherry)能够部分共定位，与SYP61-mCherry(TGN标记蛋白)能够完全的共定位，由此可知NRAMP2在细胞中定位在反式高尔基体膜上，推测参与锰的细胞内再利用过程。

超表达株系的构建及其对低锰的耐受能力分析

扩增NRAMP2开放阅读框(不含终止密码子)构建于pEarleyGate 101，具体方法如下：

引物序列：

上游引物SEQ ID NO：3—aaaaagcaggctATGGAAAACGACGTCAAAGAGA

下游引物SEQ ID NO：4—agaaagctgggtcGCTATTGGAGACGGACACTC

上游引物SEQ ID NO：5—ggggacaagtttgtacaAAAAAGCAGGCT

下游引物SEQ ID NO：6—ggggaccactttgtacaAGAAAGCTGGGT

使用Gateway方法构建载体

步骤1、BP反应

使用上游引物SEQ ID NO：3-下游引物SEQ ID NO：4，上游引物SEQ ID NO：5-下游引物SEQ ID NO：6进行两轮PCR扩增，产物通过BP反应将目的基因构建到中间载体pDONR上；

步骤2、LR反应

通过LR反应将中间载体pDONR(含目的基因)与终载体pEarleyGate 101进行同源重组，从而将目的基因构建至终载体pEarleyGate 101。

PCR反应条件(20μL体系)

将测序正确的质粒转化农杆菌GV3101，挑取单克隆于100mL含卡纳霉素、庆大霉素和利福平抗性LB培养液中，28℃200rpm震荡培养24-36h；4000rpm离心10min；5％蔗糖悬浮菌体，加1/2000Silwet混匀，最后侵染野生型Col-0，用Basta抗性筛选转基因阳性株系。

将上述在野生型背景下构建的超表达株系，通过对WT(野生型)和OxNRAMP2(超表达株系)在水培条件下进行缺锰和加锰处理。水培实验条件如下：水培营养液配方为改动过的1/5Hoagland方法，具体配方如下：1mM KNO₃,1mM Ca(NO₃)₂,0.4mM MgSO₄,0.2mMNH₄H₂PO₄,3μM H₃BO₃,1μM(NH₄)₆Mo₇O₂₄,0.4μM ZnSO₄,0.2μM CuSO₄,20μM Fe(III)-EDTA。-Mn或+Mn为不含或添加10μM MnSO₄。将春化后的WT、nramp2、nramp1、nramp2nramp1播于拟南芥水培细网上，细网漂浮于含3L 1/10Hoagland营养液的塑料黑桶中，每隔3天更换营养液，生长7d后拍照并进行根长统计分析，剩余的苗用海绵固定在塑料粗孔网上，漂浮于塑料黑桶中进行长期处理观察表型并拍照。植物生长条件为16h光照/8h黑暗，温度22℃。

图6a-b示出了水培条件下对WT、OxNRAMP2进行-Mn和+Mn(10μM)处理7d后的照片和根长统计分析，由图可知，与野生型相比，超表达株系的长势更好，包括地上部叶片略大，主根伸长更为显著。图6c示出了水培长期缺锰条件下WT(左)和OxNRAMP2(右)的表型，通过长期缺锰处理可发现，超表达株系的长势明显好于野生型，抽薹更晚，莲座叶较多，同时根系也更为发达。

对超表达株系进行进一步的金属元素含量分析，采用改动过的1/10Hoagland营养液方法，具体配方如下：0.5mM KNO₃,0.5mM Ca(NO₃)₂,0.2mM MgSO₄,0.1mM NH₄H₂PO₄,3μMH₃BO₃,1μM(NH₄)₆Mo₇O₂₄,0.4μM ZnSO₄,0.2μM CuSO₄,20μM Fe(III)-EDTA。-Mn或+Mn为不含或添加10μM MnSO₄。将春化后的WT、nramp2、nramp1、nramp2nramp1播于拟南芥水培细网上，细网漂浮于含3L 1/5Hoagland(+Mn)营养液的塑料黑桶中，每隔3天更换营养液。生长两周后，用海绵将小苗固定在塑料粗孔网上，漂浮于塑料黑桶中进行培养，两周后幼苗用海绵包裹移至黑色有机板上进行-Mn和+Mn处理，处理两周后进行收样，分地上和地下部分，于烘箱中烘干至恒重，分析天平称干重后于石墨炉上进行消解。消解采用硝酸：高氯酸＝85:15(v：v)，消解完全后用2％HNO₃进行定容，最后使用ICP-MS进行金属含量分析。

图6d示出了水培条件下对WT、OxNRAMP2进行-Mn和+Mn处理后，锰、铁、锌元素含量的ICP-MS分析结果。通过ICP-MS分析元素含量发现，缺锰条件下，与野生型相比较，超表达株系的地上部积累了更多的锰，不仅锰含量积累显著，铁和锌含量也在地上部有更多的积累。由此可以得出结论，在低锰的环境下，超表达NRAMP2能够增强植物的耐受能力，表明NRAMP2参与低锰环境下锰在细胞内的再利用过程。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京农业大学

<120> 一种低锰利用基因、蛋白、重组表达载体及其制备与应用

<130> 2017

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2266

<212> DNA

<213> 拟南芥

<400> 1

atggaaaacg acgtcaaaga gaatctcgaa gaagaggaag accgtcttct tcctcctcct 60

cctccttcac aatctctccc atccaccgat tccgaatccg aagcggcttt cgaaacaaac 120

gaaaagatcc taatcgtcga tttcgaatca cccgacgatc caacaaccgg agacacacca 180

ccgccattct catggcggaa gctctggtta ttcaccggtc caggtttctt aatgagtata 240

gcgtttttgg atccagggaa tctagaagga gatctacaag ctggtgcaat cgctggctat 300

tctctgttgt ggctactaat gtgggcaaca gctatggggt tgttgattca gatgttgtca 360

gctagagtcg gtgtagctac tggtcgtcat ttagctgagc tttgtcgtga tgagtatcct 420

acttgggcta ggtatgtgct ttggtctatg gcggaacttg ctttgattgg tgctgatatt 480

caagaggtta ttggtagtgc tattgctatt cagattctta gccgtggctt cttgcctctt 540

tgggctggtg ttgttattac tgcttccgat tggtgagtcc tttcgatact ctattcgttc 600

tttagagatg ttggattcgt agaattagta gagacttggt ttggagaatc ttatgattca 660

ttctgaaatt ttaaaacttt gcggatcatc ttagcggtat tgagtttgag tatggatcat 720

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aatttgcttt tactttggct gttttcttgt aaaactttgc taagatgatc caaactcaca 840

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tttgtccttt gcttggatgt ttggtgaaac aaaaccgagt gggaaagaac ttatgatagg 1080

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atatctgggg tatcgggttg ttagcagccg gacaaagcag tacgataact ggtacatatg 1560

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cttttgctct tctccctctt ctaaccttgg tatccaaaga agaaattatg ggagacttca 1800

agattgggcc tattctccag gtaaatttcc acttctttta ctacaagtct ccataggata 1860

ccacaatagg tgaattagtg ttgagtctta tcgttttagg tgtctcgact tttttagttt 1920

cactgtttgt gcaattatct tagtaaacat gtagaattga aagtccttca atggaataga 1980

gaagcatgaa gagtgagtat ttgtaagttg attggattta ttgattacat tgcagagaat 2040

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tgtatcagaa gtcgacgggt ttctgtttgg agttacggtc tgcgtctgga cgactgctta 2160

tatcgccttt atagtgtacc tcatttcaca cagcaacttt tttccttctc cttggtcatc 2220

ctcttccata gaacttccca aaagagtgtc cgtctccaat agctag 2266

<210> 2

<211> 530

<212> PRT

<213> 拟南芥

<400> 2

Met Glu Asn Asp Val Lys Glu Asn Leu Glu Glu Glu Glu Asp Arg Leu

1 5 10 15

Leu Pro Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ser Leu Pro Ser Thr Asp Ser Glu

20 25 30

Ser Glu Ala Ala Phe Glu Thr Asn Glu Lys Ile Leu Ile Val Asp Phe

35 40 45

Glu Ser Pro Asp Asp Pro Thr Thr Gly Asp Thr Pro Pro Pro Phe Ser

50 55 60

Trp Arg Lys Leu Trp Leu Phe Thr Gly Pro Gly Phe Leu Met Ser Ile

65 70 75 80

Ala Phe Leu Asp Pro Gly Asn Leu Glu Gly Asp Leu Gln Ala Gly Ala

85 90 95

Ile Ala Gly Tyr Ser Leu Leu Trp Leu Leu Met Trp Ala Thr Ala Met

100 105 110

Gly Leu Leu Ile Gln Met Leu Ser Ala Arg Val Gly Val Ala Thr Gly

115 120 125

Arg His Leu Ala Glu Leu Cys Arg Asp Glu Tyr Pro Thr Trp Ala Arg

130 135 140

Tyr Val Leu Trp Ser Met Ala Glu Leu Ala Leu Ile Gly Ala Asp Ile

145 150 155 160

Gln Glu Val Ile Gly Ser Ala Ile Ala Ile Gln Ile Leu Ser Arg Gly

165 170 175

Phe Leu Pro Leu Trp Ala Gly Val Val Ile Thr Ala Ser Asp Cys Phe

180 185 190

Leu Phe Leu Phe Leu Glu Asn Tyr Gly Val Arg Lys Leu Glu Ala Val

195 200 205

Phe Ala Val Leu Ile Ala Thr Met Gly Leu Ser Phe Ala Trp Met Phe

210 215 220

Gly Glu Thr Lys Pro Ser Gly Lys Glu Leu Met Ile Gly Ile Leu Leu

225 230 235 240

Pro Arg Leu Ser Ser Lys Thr Ile Arg Gln Ala Val Gly Val Val Gly

245 250 255

Cys Val Ile Met Pro His Asn Val Phe Leu His Ser Ala Leu Val Gln

260 265 270

Ser Arg Lys Ile Asp Pro Lys Arg Lys Ser Arg Val Gln Glu Ala Leu

275 280 285

Asn Tyr Tyr Leu Ile Glu Ser Ser Val Ala Leu Phe Ile Ser Phe Met

290 295 300

Ile Asn Leu Phe Val Thr Thr Val Phe Ala Lys Gly Phe Tyr Gly Thr

305 310 315 320

Glu Lys Ala Asn Asn Ile Gly Leu Val Asn Ala Gly Gln Tyr Leu Gln

325 330 335

Glu Lys Phe Gly Gly Gly Leu Leu Pro Ile Leu Tyr Ile Trp Gly Ile

340 345 350

Gly Leu Leu Ala Ala Gly Gln Ser Ser Thr Ile Thr Gly Thr Tyr Ala

355 360 365

Gly Gln Phe Ile Met Gly Gly Phe Leu Asn Leu Arg Leu Lys Lys Trp

370 375 380

Met Arg Ala Val Ile Thr Arg Ser Cys Ala Ile Val Pro Thr Met Ile

385 390 395 400

Val Ala Ile Val Phe Asn Thr Ser Glu Ala Ser Leu Asp Val Leu Asn

405 410 415

Glu Trp Leu Asn Val Leu Gln Ser Val Gln Ile Pro Phe Ala Leu Leu

420 425 430

Pro Leu Leu Thr Leu Val Ser Lys Glu Glu Ile Met Gly Asp Phe Lys

435 440 445

Ile Gly Pro Ile Leu Gln Arg Ile Ala Trp Thr Val Ala Ala Leu Val

450 455 460

Met Ile Ile Asn Gly Tyr Leu Leu Leu Asp Phe Phe Val Ser Glu Val

465 470 475 480

Asp Gly Phe Leu Phe Gly Val Thr Val Cys Val Trp Thr Thr Ala Tyr

485 490 495

Ile Ala Phe Ile Val Tyr Leu Ile Ser His Ser Asn Phe Phe Pro Ser

500 505 510

Pro Trp Ser Ser Ser Ser Ile Glu Leu Pro Lys Arg Val Ser Val Ser

515 520 525

Asn Ser

530

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaaaagcagg ctatggaaaa cgacgtcaaa gaga 34

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agaaagctgg gtcgctattg gagacggaca ctc 33

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29

Claims

1.一种低锰利用基因在提高植株对低锰的耐受能力中的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述应用包括构建超表达植物株系，包括以下步骤：

步骤2、将步骤1中扩增的核苷酸片段构建于超表达载体；

步骤3、测序，获得测序结果正确的重组表达载体；

步骤4、将所述重组表达载体转化至根癌农杆菌；

步骤5、挑取所述根癌农杆菌的单克隆至培养液进行培养；

步骤6、将菌体离心，加入侵染试剂，侵染目标株系；

步骤7、筛选转基因阳性株系。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤1中，用于扩增所述基因的引物如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示。

3.根据权利要求1-2所述的应用，其特征在于，所述步骤2中，所述超表达载体为pEarleyGate 101。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤4中，所述根癌农杆菌为根癌农杆菌GV3101。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤5中，挑取所述单克隆于含卡纳霉素、庆大霉素和利福平抗性的LB培养液中，28℃震荡培养24-36h。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤6中，所述侵染试剂为5％蔗糖和1/2000Silwet。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤6中，所述目标株系为拟南芥株系。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤6中，所述目标株系为拟南芥野生型Col-0。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤7中，用Basta抗性筛选所述转基因阳性株系。

10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因编码的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

11.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因编码的蛋白在植株细胞内定位于内膜系统的反式高尔基体上。

12.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在低锰环境下，所述基因编码的蛋白在所述植株体内参与锰由地下往地上部的装载及细胞内再利用的过程。