CN107151651A - 一种猪肝细胞的原代培养方法 - Google Patents

一种猪肝细胞的原代培养方法 Download PDF

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李美荃
张春勇
陈克嶙
安清聪
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
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Abstract

本发明公开了一种猪肝细胞的原代培养方法，其特征在于：包括依次进行的肝脏的获取、肝脏组织压块、肝细胞培养、原代细胞鉴定，其中，所述肝脏组织压块是将肝脏于灭菌培养皿中，剪碎后放置在30～60目网筛中碾压，收集滤过的肝脏组织块于灭菌容器中。本申请采用网筛碾压组织块培养法，通过网筛碾压得到合适的猪肝脏组织块，大小适宜贴壁生长，肝细胞长势良好。

Description

一种猪肝细胞的原代培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养方法，具体涉及一种猪肝细胞的原代培养方法。
背景技术
猪肝细胞的分离培养作为一种体外的培养模型，对于猪营养的基础研究、生物化学的物质代谢及其肝脏生物学功能研究均具有重要生物学意义。猪的原代肝细胞体外实验有较好的重复性，基本保持原有的肝细胞分化状态与代谢功能。猪的原代细胞与体内情况保持一致，可以在最接近体内状态下研究猪的营养作用及其调控机制。迄今，尚无成熟的可供参考的猪肝细胞原代培养方法。由此本实验对猪肝原代细胞进行分离培养，可为新生仔猪肝铁作用与信号传导机制的科学研究提供肝细胞材料。
现在肝细胞分离培养方法一般参考使用如下3种：1.直接分离培养方法：直接取出动物肝脏，机械破碎肝脏组织，采用胰蛋白酶或胶原蛋白酶消化分离肝细胞。此方法操作简单，成本较低，但该法存在分离得到的肝细胞数量少，活性较低的缺陷。2.原位“Seglen二步胶原酶灌注法”：在动物体内建立肝脏循环系统，先用无Ca2+、Mg2+的EDTA灌注液灌注肝脏，然后用蛋白酶或胶原蛋白酶消化分解细胞间的连接蛋白，反复离心，即得到细胞悬液。但该法存在操作复杂、成本高、容易污染的缺陷。3.半原位灌注法：在原位Seglen二步胶原酶法基础上，将肝脏取出，在体外进行灌注。但该法增加了环境因素对肝细胞分离培养的不利影响。上述3种肝细胞分离培养方法均存在操作复杂、细胞培养过程麻烦、增加环境影响因素、因使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶致使成本较高的缺陷和不足。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪肝细胞的原代培养方法，解决现有技术中直接分离培养方法分离得到的肝细胞数量少、活性较低，原位“Seglen二步胶原酶灌注法”和半原位灌注法分离操作复杂、成本高、肝细胞容易污染的问题。
为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种猪肝细胞的原代培养方法，包括依次进行的肝脏的获取、肝脏组织压块、肝细胞培养、原代细胞鉴定，其中，所述肝脏组织压块是将肝脏于灭菌培养皿中，剪碎后放置在30～60目网筛中碾压，收集滤过的肝脏组织压块于灭菌容器中。
本申请采用网筛碾压组织块培养法，通过网筛碾压得到合适的猪肝脏组织压块，大小适宜贴壁生长，肝细胞长势良好。
若使用筛网的网孔偏大，则细胞无法充分分离；若使用筛网的网孔偏小，则肝细胞分离效果不佳。且使用筛网的网孔偏大或网孔偏小，肝脏组织压块都不易贴壁，不利于肝细胞生长。
采用网筛碾压组织块法培养猪肝细胞，具有操作简单、由取出肝脏至肝脏组织块培养于CO2培养箱期间，不需要添加胰蛋白酶或胶原蛋白酶、降低了肝细胞培养成本、具有培养的肝细胞活性高等优势，是一种较好的可供基础营养和生物化学研究使用猪肝细胞培养方法。
作为优选的，所述肝脏来源于非病死的新生仔猪，所述新生仔猪的猪龄小于5h。由于新生仔猪的细胞活性高、容易分离，所以肝脏优选于新生仔猪。
作为优选的，所述肝脏的获取是将新生仔猪浸泡于酒精中消毒后，颈部处死，移至超净工作台，取出肝脏，剥除纤维成分，所述纤维成分包括被膜和血管。
作为优选的，所述酒精为体积分数75%的酒精，消毒时间为15-20s。
作为优选的，碾压肝脏时不断用含血清DMEM冲洗后离心，得到肝脏组织压块。
本申请中碾压肝脏是将肝脏置于筛网上，然后用与筛网大小相配的物体碾压肝脏，使得符合要求的肝脏组织压块从筛网上透过，然后将其收集于灭菌的容器中。
作为优选的，所述肝细胞培养中使用的培养液为高糖型DMEM培养液，其中还含有质量分数为8-10%胎牛血清和0.8-1%双抗培养基。
使用DMEM培养液，胎牛血清（Gibco），由取出肝脏至肝脏组织块培养于CO2培养箱期间，不需要使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶消化细胞、具有操作简单、降低了肝细胞原代培养成本、具有培养的肝细胞活性高等优势。
作为优选的，将所述含肝脏组织块的培养液置于CO2培养箱中培养。
作为优选的，从取出肝脏至将含肝脏组织块的培养液置于CO2培养箱中所经过的时间小于90min。
若肝细胞原代培养处理时间过长，会导致细胞活性下降，对细胞后期的培养也会有不利影响。
作为优选的，培养的细胞为猪原代肝细胞。
采用网筛碾压组织块培养分离的肝细胞，经细胞形态学观察，明确肝细胞呈现多角形，与Dirk等研究报道肝细胞形态一致。且将本方法培养的细胞送到国家细胞库鉴定，鉴定结果也明确网筛碾压法培养的为猪的原代肝细胞。迄今，未见网筛碾压组织块培养法得到的猪原代肝细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少是如下之一：
（1）由取出肝脏至肝脏组织块培养于CO2培养箱期间，不经胰酶消化，对细胞损失较小。
（2）网筛研磨过网，杂细胞较少，操作简单，不易受到污染。
（3）相较于胰酶灌注法，节约成本，方法简单。
（4）无需其它营养因子如细胞生长因子等，节约成本。
（5）本法培养的肝细胞可以供猪的基础营养、生物化学等科学研究和使用。
附图说明
图1为利用本发明方法培养的猪肝细胞的放大图。
图2为细胞培养液中LDH含量随时间的变化曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
本实施例提供了一种猪肝细胞的原代培养方法，包括依次进行的肝脏的获取、肝脏组织压块、肝细胞培养、原代细胞鉴定，其中，所述肝脏组织压块是将肝脏置于灭菌培养皿中，剪碎后放置在30～60目网筛中碾压，收集滤过的肝脏组织压块于灭菌容器中。
实施例2：
本实施例是在实施例1的基础上，进一步限定了：所述肝脏来源于新生仔猪，所述新生仔猪的猪龄小于5h，所述猪龄是指猪从出生至获取肝脏的时间。
实施例3：
本实施例是在实施例1的基础上，进一步限定了：所述肝脏的获取是将新生仔猪浸泡于酒精中消毒后，颈部处死，移至超净工作台，取出肝脏，剥除纤维成分，所述纤维成分包括被膜和血管。
实施例4：
本实施例是在实施例3的基础上，进一步限定了：所述酒精为体积分数75%的酒精，消毒时间为20s。
实施例5：
本实施例是在实施例1的基础上，进一步限定了：碾压肝脏时不断用含血清DMEM冲洗后离心，得到肝脏组织压块。
实施例6：
本实施例是在实施例1的基础上，进一步限定了：所述肝细胞培养中使用的培养液为高糖型DMEM培养液，其中还含有质量分数为10%胎牛血清和1%双抗培养基。
实施例7：
本实施例是在实施例6的基础上，进一步限定了：将所述含肝脏组织块的培养液置于CO2培养箱中培养。
实施例8：
本实施例是在实施例1的基础上，进一步限定了：从取出肝脏至将含肝脏组织块的培养液置于CO2培养箱中所经过的时间小于90min。
实施例9：
本实施例提供了一种猪肝细胞的原代培养方法，包括依次进行的下列步骤：
肝脏的获取：肝脏来源于新生仔猪，所述新生仔猪的猪龄小于5h，猪龄是指猪从出生至获取肝脏的时间；将新生仔猪浸泡于体积分数75%的酒精中消毒15-20s后，颈部处死，移至超净工作台，取出肝脏，剥除被膜和血管等纤维成分；
肝脏组织压块：将肝脏于灭菌培养皿中，剪碎后放置在30～60目网筛中碾压，本实施例中使用的网筛为底面是筛网的柱形不锈钢网筛，碾压肝脏时不断用含血清DMEM培养液冲洗，收集滤过的肝脏组织压块于已灭菌的50mL离心管中进行离心，去除冲洗液，得到肝脏组织压块；
肝细胞培养：将肝脏组织压块置于高糖型DMEM培养液中培养，所述高糖型DMEM培养液中还含有质量分数为10%胎牛血清和1%双抗培养基；然后将含肝脏组织压块的培养液置于CO2培养箱中，其中从取出肝脏至将肝脏组织压块置于CO2培养箱中所经过的时间小于90min；
原代细胞鉴定：将本实施例培养的细胞送到国家细胞库鉴定，鉴定结果明确网筛碾压法培养的为猪原代肝细胞；对本实施例培养的细胞进行观察：如图1A所示，将本申请方法培养得到的细胞放大200倍，可见细胞呈现多角形，贴壁生长；图1B将本申请方法培养得到的细胞放大50倍，可见以肝脏组织压块为中心，细胞贴壁且成片生长；图1C、图1D将本申请方法培养得到的细胞放大100倍，可见视野下长满的肝脏细胞。
另外，对本申请方法培养得到的猪肝脏细胞的功能进行测定：选取培养组织块分离的新鲜肝细胞1、3、5、7天得到的细胞培养液，测定其中LDH含量，测定结果如图2所示，从图2可以看出，随着时间的延长细胞培养液中LDH含量不断增加，也就是随时间延长，细胞开始衰老，但衰老的速度较慢。
尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变形和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。

Claims (9)

1.一种猪肝细胞的原代培养方法，其特征在于：包括依次进行的肝脏的获取、肝脏组织压块、肝细胞培养、原代细胞鉴定，其中，所述肝脏组织压块是将肝脏置于灭菌培养皿中，剪碎后放置在30～60目网筛中碾压，收集滤过的肝脏组织压块于灭菌容器中。
2.根据权利要求1所述的一种猪肝细胞的原代培养方法，其特征在于，所述肝脏来源于新生仔猪，所述新生仔猪的猪龄小于5h。
3.根据权利要求1所述的一种猪肝细胞的原代培养方法，其特征在于，所述肝脏的获取是将新生仔猪浸泡于酒精中消毒后，颈部处死，移至超净工作台，取出肝脏，剥除纤维成分，所述纤维成分包括被膜和血管。
4.根据权利要求3所述的一种猪肝细胞的原代培养方法，其特征在于，所述酒精为体积分数75%的酒精，消毒时间为20s。
5.根据权利要求1所述的一种猪肝细胞的原代培养方法，其特征在于，碾压肝脏时不断用含血清DMEM冲洗后离心，得到肝脏组织压块。
6.根据权利要求1所述的一种猪肝细胞的原代培养方法，其特征在于，所述肝细胞培养中使用的培养液为高糖型DMEM培养液，其中还含有质量分数为10%胎牛血清和1%双抗培养基。
7.根据权利要求6所述的一种猪肝细胞的原代培养方法，其特征在于，将所述含肝脏组织块的培养液置于CO2培养箱中培养。
8.根据权利要求7所述的一种猪肝细胞的原代培养方法，其特征在于，从取出肝脏至将含肝脏组织块的培养液置于CO2培养箱中所经过的时间小于90min。
9.根据权利要求1所述的一种猪肝细胞的原代培养方法，其特征在于，培养的细胞为猪原代肝细胞。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN108823146A (zh) * 2018-06-22 2018-11-16 安徽 一种肝脏干细胞制备和提取方法
CN111849862A (zh) * 2020-06-24 2020-10-30 广东省实验动物监测所 一种鱼类高脂存储肝细胞分离和培养方法

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