CN107144696B - 一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶‑磷脂微囊制备方法，包括以下步骤：S1、磷脂微粒的制备：(1)把40mg丙酮洗过的大豆磷脂，悬浮在1ml缓冲液中，并加入胆酸钠至终浓度为2％；(2)冰上超声波处理；S2、酶蛋白质嵌入磷脂微囊：(1)准备酶溶液；(2)往酶溶液中加胆酸钠溶液至终浓度为0.5％；(3)加入S1得到的磷脂微粒，使酶蛋白和磷脂的质量比为1:40；(4)在冰上孵育30分钟；(5)在冰上进行过夜透析。本方法形成的是大单层微囊，其体积大，并且具有良好的稳定性，膜的流动性好，有利于膜酶蛋白的嵌入，适合于研究各种膜酶的活性和功能。
Description
技术领域
本发明涉及膜酶活性科研实验研究技术领域，具体是涉及一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法。
背景技术
生物细胞尤其是真核生物细胞有发达的生物膜(biomembrane)系统。生物膜是镶嵌有蛋白质和糖类的磷脂双分子层。真核细胞除质膜(又称细胞膜)外，还有分隔各种细胞器的膜系统，包括核膜、线粒体膜、内质网膜、溶酶体膜、高尔基体膜、叶绿体膜、液泡膜、过氧化酶体膜等。生物膜形态上都呈双分子层的片层结构，厚度约5～10纳米。生物膜起着划分和分隔细胞和细胞器的作用，也是与许多能量转化和细胞内通讯有关的重要部位，同时，生物膜上还有大量的酶结合位点。不同的生物膜具体作用又各不相同。
1965年，英国学者Bangham A D把磷脂分散到过量水中，形成了一种由双分子膜组成的闭合磷脂微囊，这一发现开创了新的研究领域。人工磷脂微囊具有类似于生物膜的结构，构成双分子层的类脂亲水性的头部形成膜的内表面，而亲脂性的尾部则处于膜的中间，这种类膜结构使其能够包裹多种物质。人工模拟生物膜有利于研究其功能，例如各种物质穿过膜的机理、生物膜上的各种蛋白质和糖类的功能。在医学上，人工生物膜微囊可以作为药物的载体，携带药物进入细胞，该进药方式具有靶向、长效、低毒、缓释、无免疫原性及保护包封药物的优点。另外，人工磷脂微囊还可以作为基因转染载体，还可以用于免疫学检测等。
发明内容
本发明解决的技术问题是：以往的人工磷脂微囊形成方法往往技术复杂，所形成的磷脂微囊小，不利于将酶蛋白嵌入到微囊膜上。从而提供了一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法。
本发明的技术方案是：
一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法，主要包括以下步骤：
S1、磷脂微粒的制备：
(1)把40mg丙酮洗过的磷脂，悬浮在1ml缓冲液中，并加入胆酸钠至终浓度为2％，过程中控制温度27～28℃；
(2)冰上超声波处理5分钟，超声处理时，要不断的通入氩气，以保证无氧环境；
(3)静置5分钟后，再超声处理5分钟；
S2、酶蛋白质嵌入磷脂微囊：
(1)准备酶溶液300μl，其中酶蛋白含量为1～2mg/ml；将所述酶溶液置于-60℃快速冷冻，水浴30℃中融化，交替冻融3～5次，每次冻融后均用匀浆机高速匀浆处理；
(2)往酶溶液中加胆酸钠溶液至终浓度为0.5％，过程中控制温度27～28℃；
(3)加入S1制备得到的磷脂微粒，使酶蛋白和磷脂的质量比为1:40；
(4)在冰上孵育30分钟；向孵育后的溶液中加入5.0～10.0％海藻酸钠与4.5～6.0％二硫苏糖醇混合溶液，最终使海藻酸钠的质量百分浓度为0.5～3％，二硫苏糖醇的质量百分浓度为0.3～2％，颠倒混匀后再置于冰上进行二次孵育30～50min；
(5)在冰上或冷室中透析4小时，透析液体积为酶溶液体积的100倍，透析过程中不断搅拌；
(6)用200倍体积的缓冲液继续过夜透析，中间更换一次透析液，透析过程中不断搅拌；
(7)用光学显微镜或电子显微镜检查微囊的大小；
(8)除菌，4℃密封保存。
进一步地，在上述方案中，步骤S1中(1)所述磷脂为大豆磷脂(asolectin)。
进一步地，在上述方案中，其特征在于，步骤S1中(1)所述缓冲液为pH为7.0、浓度为0.02～0.04mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，或者pH为7.4、浓度为50mM的磷酸缓冲液，或者pH为7.3、浓度为100mM的Hepes-KOH缓冲液。
进一步地，在上述方案中，步骤S1中(2)所述的冰上超声波处理具体操作为：将溶液放入容器中，利用20khz的探头式脉冲超声波进行处理；处理过程如下：探头插入液下1.3cm，液面高度保持6～10cm，脉冲时间为5～8s，占空比为40％～70％，温度8～26℃，声强150.22～672.34W/cm2。
进一步地，在上述方案中，步骤S1中(3)所述的超声处理是以每超声10～13s，间歇2～5s的方法间歇超声处理共5分钟。步骤S1中(2)和(3)的超声仪探头插入溶液不易过浅，以免表面活性剂胆酸钠产生泡沫。
进一步地，在上述方案中，步骤S2中(1)所述酶包括但不限于牛心线粒体内膜复合物Ⅲ和牛心线粒体内膜复合物IV，尤其适合于各种生物膜酶。
进一步地，在上述方案中，步骤S2中(4)所述的二次孵育期间每隔5～10min混匀一次。
进一步地，在上述方案中，步骤S2中(5)所述的透析液与步骤S1中(1)所述缓冲液相同。
进一步地，在上述方案中，步骤S2中(5)和(6)所述的透析过程中透析袋的透过分子量为8000～14000之间。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在以下几点：
(1)本发明方法形成的是大单层微囊，其体积大，能达到1微米左右，并且具有良好的稳定性，有利于酶蛋白的嵌入。
(2)由于表面活性剂胆酸钠的加入，改善了膜的流动性，这也有利于膜酶蛋白的嵌入。
(3)本发明方法简单易行，适合于研究各种膜酶的活性和功能。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例1
一种利于牛心线粒体内膜复合物Ⅲ活性研究的酶-磷脂微囊制备方法，主要包括以下步骤：
S1、磷脂微粒的制备：
(1)把40mg丙酮洗过的大豆磷脂，悬浮在1ml缓冲液中，并加入胆酸钠至终浓度为2％，过程中控制温度27℃；其中的缓冲液为pH为7.0、浓度为0.02mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液；
(2)冰上超声波处理5分钟：将溶液放入容器中，利用20khz的探头式脉冲超声波进行处理；处理过程如下：探头插入液下1.3cm，液面高度保持6cm，脉冲时间为5s，占空比为40％，温度8℃，声强150.22W/cm；超声处理时，要不断的通入氩气，以保证无氧环境；
(3)静置5分钟后，再以每超声10s，间歇2s的方法间歇超声处理共5分钟；
S2、酶蛋白质嵌入磷脂微囊：
(1)准备酶溶液300μl，其中酶蛋白含量为1mg/ml；将所述酶溶液置于-60℃快速冷冻，水浴30℃中融化，交替冻融3次，每次冻融后均用匀浆机高速匀浆处理；
(2)往酶溶液中加胆酸钠溶液至终浓度为0.5％，过程中控制温度27℃；
(3)加入S1制备得到的磷脂微粒，使酶蛋白和磷脂的质量比为1:40；
(4)在冰上孵育30分钟；向孵育后的溶液中加入5.0％海藻酸钠与4.5％二硫苏糖醇混合溶液，最终使海藻酸钠的质量百分浓度为0.5％，二硫苏糖醇的质量百分浓度为0.3％，颠倒混匀后再置于冰上进行二次孵育30min，二次孵育期间每隔5min混匀一次；
(5)在冰上透析4小时，透析过程中透析袋的透过分子量为8000，透析液体积为酶溶液体积的100倍，透析过程中不断搅拌；透析液为pH为7.0、浓度为0.02mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液；
(6)用200倍体积的缓冲液继续过夜透析，中间更换一次透析液；其中，透析过程中透析袋的透过分子量为8000；
(7)用光学显微镜或电子显微镜检查微囊的大小为1.02微米；
(8)除菌，4℃密封保存。
实施例2
一种利于牛心线粒体内膜复合物Ⅳ活性研究的酶-磷脂微囊制备方法，主要包括以下步骤：
S1、磷脂微粒的制备：
(1)把40mg丙酮洗过的大豆磷脂，悬浮在1ml缓冲液中，并加入胆酸钠至终浓度为2％，过程中控制温度27.5℃；其中的缓冲液为pH为7.4、浓度为50mM的磷酸缓冲液；
(2)冰上超声波处理5分钟：将溶液放入容器中，利用20khz的探头式脉冲超声波进行处理；处理过程如下：探头插入液下1.3cm，液面高度保持8cm，脉冲时间为6s，占空比为55％，温度17℃，声强411.28W/cm；超声处理时，要不断的通入氩气，以保证无氧环境；
(3)静置5分钟后，再以每超声12s，间歇3.5s的方法间歇超声处理共5分钟；
S2、酶蛋白质嵌入磷脂微囊：
(1)准备酶溶液300μl，其中酶蛋白含量为1.5mg/ml；将所述酶溶液置于-60℃快速冷冻，水浴30℃中融化，交替冻融4次，每次冻融后均用匀浆机高速匀浆处理；
(2)往酶溶液中加胆酸钠溶液至终浓度为0.5％，过程中控制温度27.5℃；
(3)加入S1制备得到的磷脂微粒，使酶蛋白和磷脂的质量比为1:40；
(4)在冰上孵育30分钟；向孵育后的溶液中加入7.5％海藻酸钠与5.2％二硫苏糖醇混合溶液，最终使海藻酸钠的质量百分浓度为1.75％，二硫苏糖醇的质量百分浓度为1.1％，颠倒混匀后再置于冰上进行二次孵育40min，二次孵育期间每隔7min混匀一次；
(5)在冷室中透析4小时，透析过程中透析袋的透过分子量为11000，透析液体积为酶溶液体积的100倍，透析过程中不断搅拌；透析液为pH为7.4、浓度为50mM的磷酸缓冲液；
(6)用200倍体积的缓冲液继续过夜透析，中间更换一次透析液；其中，透析过程中透析袋的透过分子量为110001；
(7)用光学显微镜或电子显微镜检查微囊的大小为0.98微米；
(8)除菌，4℃密封保存。
实施例3
一种利于牛心线粒体内膜复合物Ⅳ活性研究的酶-磷脂微囊制备方法，主要包括以下步骤：
S1、磷脂微粒的制备：
(1)把40mg丙酮洗过的大豆磷脂，悬浮在1ml缓冲液中，并加入胆酸钠至终浓度为2％，过程中控制温度28℃；其中的缓冲液为pH为7.3、浓度为100mM的Hepes-KOH缓冲液；
(2)冰上超声波处理5分钟：将溶液放入容器中，利用20khz的探头式脉冲超声波进行处理；处理过程如下：探头插入液下1.3cm，液面高度保持10cm，脉冲时间为8s，占空比为70％，温度26℃，声强672.34W/cm；超声处理时，要不断的通入氩气，以保证无氧环境；
(3)静置5分钟后，再以每超声13s，间歇5s的方法间歇超声处理共5分钟；
S2、酶蛋白质嵌入磷脂微囊：
(1)准备酶溶液300μl，其中酶蛋白含量为2mg/ml；将所述酶溶液置于-60℃快速冷冻，水浴30℃中融化，交替冻融5次，每次冻融后均用匀浆机高速匀浆处理；
(2)往酶溶液中加胆酸钠溶液至终浓度为0.5％，过程中控制温度28℃；
(3)加入S1制备得到的磷脂微粒，使酶蛋白和磷脂的质量比为1:40；
(4)在冰上孵育30分钟；向孵育后的溶液中加入10.0％海藻酸钠与6.0％二硫苏糖醇混合溶液，最终使海藻酸钠的质量百分浓度为3％，二硫苏糖醇的质量百分浓度为2％，颠倒混匀后再置于冰上进行二次孵育50min，二次孵育期间每隔10min混匀一次；
(5)在冰上透析4小时，透析过程中透析袋的透过分子量为14000，透析液体积为酶溶液体积的100倍，透析过程中不断搅拌；透析液为pH为7.3、浓度为100mM的Hepes-KOH缓冲液；
(6)用200倍体积的缓冲液继续过夜透析，中间更换一次透析液；其中，透析过程中透析袋的透过分子量为14000；
(7)用光学显微镜或电子显微镜检查微囊的大小为1.1微米；
(8)除菌，4℃密封保存。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭示的方法范围内，根据本发明的方法及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
S1、磷脂微粒的制备：
(1)把40mg丙酮洗过的磷脂，悬浮在1ml缓冲液中，并加入胆酸钠至终浓度为2％，过程中控制温度27～28℃；
(2)冰上超声波处理5分钟，超声处理时，要不断的通入氩气，以保证无氧环境；
(3)静置5分钟后，再超声处理5分钟；
S2、酶蛋白质嵌入磷脂微囊：
(1)准备酶溶液300μl，其中酶蛋白含量为1～2mg/ml；将所述酶溶液置于-60℃快速冷冻，水浴30℃中融化，交替冻融3～5次，每次冻融后均用匀浆机高速匀浆处理；
(2)往酶溶液中加胆酸钠溶液至终浓度为0.5％，过程中控制温度27～28℃；
(3)加入S1制备得到的磷脂微粒，使酶蛋白和磷脂的质量比为1:40；
(4)在冰上孵育30分钟；向孵育后的溶液中加入质量百分浓度为5.0～10.0％海藻酸钠与质量百分浓度为4.5～6.0％二硫苏糖醇混合溶液，最终使海藻酸钠的质量百分浓度为0.5～3％，二硫苏糖醇的质量百分浓度为0.3～2％，颠倒混匀后再置于冰上进行二次孵育30～50min；
(5)在冰上或冷室中透析4小时，透析液体积为酶溶液体积的100倍，透析过程中不断搅拌；
(6)用200倍体积的缓冲液继续过夜透析，中间更换一次透析液；
(7)用光学显微镜或电子显微镜检查微囊的大小；
(8)除菌，4℃密封保存。
2.如权利要求1所述的一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法，其特征在于，步骤S1中(1)所述磷脂为大豆磷脂(asolectin)。
3.如权利要求1所述的一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法，其特征在于，步骤S1中(1)所述缓冲液为pH为7.0、浓度为0.02～0.04mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，或者pH为7.4、浓度为50mM的磷酸缓冲液，或者pH为7.3、浓度为100mM的Hepes-KOH缓冲液。
4.如权利要求1所述的一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法，其特征在于，步骤S1中(2)所述的冰上超声波处理具体操作为：将溶液放入容器中，利用20khz的探头式脉冲超声波进行处理；处理过程如下：探头插入液下1.3cm，液面高度保持6～10cm，脉冲时间为5～8s，占空比为40％～70％，温度8～26℃，声强150.22～672.34W/cm2。
5.如权利要求4所述的一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法，其特征在于，步骤S1中(2)所述的超声波处理是以每超声10～13s，间歇2～5s的方法间歇超声处理共5分钟。
6.如权利要求1所述的一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法，其特征在于，步骤S1中(3)所述的超声处理是以每超声10～13s，间歇2～5s的方法间歇超声处理共5分钟。
7.如权利要求1所述的一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法，其特征在于，步骤S2中(4)所述的二次孵育期间每隔5～10min混匀一次。
8.如权利要求1所述的一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法，其特征在于，步骤S2中(5)所述的透析液与步骤S1中(1)所述缓冲液相同。
9.如权利要求1所述的一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法，其特征在于，步骤S2中(5)和(6)所述的透析过程中透析袋的透过分子量为8000～14000之间。
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