CN109248157B - 一种仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种仿生嵌入固定化酶‑改性磷脂微囊的制备方法，包括以下步骤：(1)改性磷脂的制备；(2)改性磷脂微粒的制备；(3)酶蛋白仿生嵌入改性磷脂微粒；(4)酶‑改性磷脂微囊的分离。本发明通过电磁‑超声耦合处理对磷脂进行改性，可改变其空间结构，有利于酶蛋白的嵌入，并且能提高嵌合的稳定性，利用培养基质液及制造脉冲生物电，模拟仿生环境，提高酶活力，从而提高酶蛋白嵌入成功率。利用本发明的方法制备的酶‑改性磷脂微囊作为药物载体，相较于普通纳米脂质载体，药物的溶解度可提高1.9‑2.1倍。
Description
技术领域
本发明涉及膜酶活性科研实验研究技术领域，具体涉及一种仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制备方法。
背景技术
生物膜的组分繁多，分离纯化的难度较大，因此早年为便于研究，往往采用单一或几种脂质组成的各种人工膜结构：单分子层膜、累积膜、脂质体、平板双分子层脂膜等，同时，生物膜上还有大量的酶结合位点，也可将蛋白质嵌入后组成重建膜，这些膜结构泛称“人工膜”。
1965年，英国学者Bangham A D把磷脂分散到过量水中，形成了一种由双分子膜组成的闭合磷脂微囊，这一发现开创了新的研究领域。人工磷脂微囊具有类似于生物膜的结构，构成双分子层的类脂亲水性的头部形成膜的内表面，而亲脂性的尾部则处于膜的中间，这种类膜结构使其能够包裹多种物质。因此，近些年利用脂质体可以和细胞膜融合等特点制备脂质体载体药物是人工膜的另一项比较大的拓展。
为了解决溶解性差药物的低口服生物可利用率的问题，利用磷脂或卵磷脂等脂质体形成的生物膜制备的药物载体，通过将难溶药物进行包裹，提高药物溶解度，进而提高药物的利用率。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：以往的人工磷脂微囊形成方法不同，所形成的磷脂微囊与酶蛋白的嵌合率低，影响其作为药物载体的成效，使得口服药物生物利用率降低。从而提供一种仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制备方法。
本发明的技术方案为：一种仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)改性磷脂的制备
S1：将磷脂溶解于去离子水中，配制成为浓度为3-5％的磷脂溶液；
S2：将所述磷脂溶液在惰性气体氛围保护下进行电磁-超声耦合处理，得到改性磷脂溶液；
(2)改性磷脂微粒的制备
S1：向所述改性磷脂溶液中加入脱氧胆酸钠至终浓度为3％，水浴控温至25-26℃；
S2：在惰性气体氛围保护下进行超声波震荡分散，时间为10-20min，温度控制在4-10℃；
S3：真空冷冻干燥后得到改性磷脂微粒；
(3)酶蛋白仿生嵌入改性磷脂微粒
S1：取浓度为3-5mg/ml的酶蛋白溶液在1.5-3.5kv/cm范围内，经工频电场处理5min，激活酶蛋白活力，再利用高速匀浆机匀浆处理2-3次；
S2：将改性磷脂微粒利用等体积比的磷酸缓冲液复溶，复溶液体再与2-3倍体积比的培养基质液混合，调节pH至6.8-7.3；
S3：加入处理过的酶蛋白溶液，使得酶蛋白与磷脂的质量比为1:50-60；
S4：30℃恒温孵育40-60min，期间利用石墨电极制造脉冲生物电，模拟仿生环境，并且分3次补充葡萄糖，葡萄糖添加总量为25mg/L；
(4)酶-改性磷脂微囊的分离
S1：离心，弃上清，用10mM磷酸缓冲液对酶-改性磷脂微囊充分洗涤，再将酶-改性磷脂微囊重悬于100倍体积的10mM磷酸缓冲液中；
S2：装入密封超滤膜，通入惰性气体，正压过滤16-24h；
S3：真空冷冻干燥得到酶-改性磷脂微囊固体粉末。
进一步地，步骤(1)的S2中所述电磁-超声耦合处理的方法为：电磁场处理的强度为2500-4000高斯，压力为0.1-0.2bar，超声波频率为30KHz，处理温度为25℃，处理时间为8-10min。通过电磁-超声耦合处理，磷脂的空间结构会发生明显改变，大大提高了与酶蛋白的亲和力。
进一步地，步骤(2)的S2中所述超声波震荡分散的具体操作为：采用超声波横波斜探头，将探头伸入液下1cm，并与液面呈45度夹角，频率为25KHz，脉冲时间为10s。超声横波的震荡分散更加充分。
进一步地，步骤(3)的S2中所述培养基质液包括：1.8-2.2wt％磷酸二羟基丙酮、0.5-0.7wt％脱氧胆酸钠、2.1-2.4wt％海藻糖、1.1-1.4wt％半胱氨酸，余量为30mM磷酸缓冲液。培养基质液可为酶蛋白嵌入改性磷脂提供良好的反应环境。
进一步地，步骤(3)的S4中所述石墨电极制造脉冲生物电的具体操作为：所述的脉冲频率为400Hz，脉冲强度为1-6mv/cm，每间隔5min脉冲处理100-500μs。
进一步地，步骤(3)的S4中所述葡萄糖的添加方法为：第一次12mg/L，第二次8mg/L，第三次5mg/L，每次间隔10min。
进一步地，步骤(4)的S2中所述正压过滤的压力为3-8bar。
进一步地，所述惰性气体为氮气或者氩气，防止酶发生氧化。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)通过电磁-超声耦合处理对磷脂进行改性，可改变其空间结构，有利于酶蛋白的嵌入，并且能提高嵌合的稳定性；
(2)利用培养基质液及制造脉冲生物电，模拟仿生环境，提高酶活力，从而提高酶蛋白嵌入成功率；
(3)利用充入惰性气体进行正压过滤，可快速得到纯净的酶-改性磷脂微囊。
(4)利用本发明的方法制备的酶-改性磷脂微囊作为药物载体，相较于普通纳米脂质载体，药物的溶解度可提高1.9-2.1倍。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例1
一种仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)改性磷脂的制备
S1：将大豆磷脂溶解于去离子水中，配制成为浓度为3％的磷脂溶液；
S2：将磷脂溶液在氮气氛围保护下进行电磁-超声耦合处理，得到改性磷脂溶液；电磁-超声耦合处理的方法为：电磁场处理的强度为2500高斯，压力为0.1bar，超声波频率为30KHz，处理温度为25℃，处理时间为8min。通过电磁-超声耦合处理，磷脂的空间结构会发生明显改变，大大提高了与酶蛋白的亲和力。
(2)改性磷脂微粒的制备
S1：向改性磷脂溶液中加入脱氧胆酸钠至终浓度为3％，水浴控温至25℃；
S2：在氮气氛围保护下将超声波横波斜探头伸入液下1cm，并与液面呈45度夹角进行超声波震荡分散，频率为25KHz，时间为10min，脉冲时间为10s，温度控制在4℃。超声横波的震荡分散更加充分。
S3：真空冷冻干燥后得到改性磷脂微粒；
(3)酶蛋白仿生嵌入改性磷脂微粒
S1：取浓度为3mg/ml的酶蛋白溶液在1.5kv/cm范围内，经工频电场处理5min，激活酶蛋白活力，再利用高速匀浆机匀浆处理2次；
S2：将改性磷脂微粒利用等体积比的磷酸缓冲液复溶，复溶液体再与2倍体积比的培养基质液混合，调节pH至6.8；培养基质液包括：1.8wt％磷酸二羟基丙酮、0.5wt％脱氧胆酸钠、2.1wt％海藻糖、1.1wt％半胱氨酸，余量为30mM磷酸缓冲液。培养基质液可为酶蛋白嵌入改性磷脂提供良好的反应环境。
S3：加入处理过的酶蛋白溶液，使得酶蛋白与磷脂的质量比为1:50；
S4：30℃恒温孵育40min，期间利用石墨电极制造脉冲生物电，模拟仿生环境，的脉冲频率为400Hz，脉冲强度为1mv/cm，每间隔5min脉冲处理100μs。并且分3次补充葡萄糖，第一次12mg/L，第二次8mg/L，第三次5mg/L，每次间隔10min。葡萄糖添加总量为25mg/L；
(4)酶-改性磷脂微囊的分离
S1：离心，弃上清，用10mM磷酸缓冲液对酶-改性磷脂微囊充分洗涤，再将酶-改性磷脂微囊重悬于100倍体积的10mM磷酸缓冲液中；
S2：装入密封超滤膜，通入氮气，以3bar压力正压过滤24h；
S3：真空冷冻干燥得到酶-改性磷脂微囊固体粉末。
实施例2
一种仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)改性磷脂的制备
S1：将大豆磷脂溶解于去离子水中，配制成为浓度为4％的磷脂溶液；
S2：将磷脂溶液在氮气氛围保护下进行电磁-超声耦合处理，得到改性磷脂溶液；电磁-超声耦合处理的方法为：电磁场处理的强度为3300高斯，压力为0.15bar，超声波频率为30KHz，处理温度为25℃，处理时间为9min。通过电磁-超声耦合处理，磷脂的空间结构会发生明显改变，大大提高了与酶蛋白的亲和力。
(2)改性磷脂微粒的制备
S1：向改性磷脂溶液中加入脱氧胆酸钠至终浓度为3％，水浴控温至25℃；
S2：在氮气氛围保护下将超声波横波斜探头伸入液下1cm，并与液面呈45度夹角进行超声波震荡分散，频率为25KHz，时间为15min，脉冲时间为10s，温度控制在7℃。超声横波的震荡分散更加充分。
S3：真空冷冻干燥后得到改性磷脂微粒；
(3)酶蛋白仿生嵌入改性磷脂微粒
S1：取浓度为4mg/ml的酶蛋白溶液在2.5kv/cm范围内，经工频电场处理5min，激活酶蛋白活力，再利用高速匀浆机匀浆处理3次；
S2：将改性磷脂微粒利用等体积比的磷酸缓冲液复溶，复溶液体再与2.5倍体积比的培养基质液混合，调节pH至7.0；培养基质液包括：2.0wt％磷酸二羟基丙酮、0.6wt％脱氧胆酸钠、2.3wt％海藻糖、1.3wt％半胱氨酸，余量为30mM磷酸缓冲液。培养基质液可为酶蛋白嵌入改性磷脂提供良好的反应环境。
S3：加入处理过的酶蛋白溶液，使得酶蛋白与磷脂的质量比为1:55；
S4：30℃恒温孵育50min，期间利用石墨电极制造脉冲生物电，模拟仿生环境，的脉冲频率为400Hz，脉冲强度为3mv/cm，每间隔5min脉冲处理300μs。并且分3次补充葡萄糖，第一次12mg/L，第二次8mg/L，第三次5mg/L，每次间隔10min。葡萄糖添加总量为25mg/L；
(4)酶-改性磷脂微囊的分离
S1：离心，弃上清，用10mM磷酸缓冲液对酶-改性磷脂微囊充分洗涤，再将酶-改性磷脂微囊重悬于100倍体积的10mM磷酸缓冲液中；
S2：装入密封超滤膜，通入氮气，以5.5bar压力正压过滤20h；
S3：真空冷冻干燥得到酶-改性磷脂微囊固体粉末。
实施例3
一种仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)改性磷脂的制备
S1：将大豆磷脂溶解于去离子水中，配制成为浓度为5％的磷脂溶液；
S2：将磷脂溶液在氩气氛围保护下进行电磁-超声耦合处理，得到改性磷脂溶液；电磁-超声耦合处理的方法为：电磁场处理的强度为4000高斯，压力为0.2bar，超声波频率为30KHz，处理温度为25℃，处理时间为10min。通过电磁-超声耦合处理，磷脂的空间结构会发生明显改变，大大提高了与酶蛋白的亲和力。
(2)改性磷脂微粒的制备
S1：向改性磷脂溶液中加入脱氧胆酸钠至终浓度为3％，水浴控温至26℃；
S2：在氩气氛围保护下将超声波横波斜探头伸入液下1cm，并与液面呈45度夹角进行超声波震荡分散，频率为25KHz，时间为20min，脉冲时间为10s，温度控制在10℃。超声横波的震荡分散更加充分。
S3：真空冷冻干燥后得到改性磷脂微粒；
(3)酶蛋白仿生嵌入改性磷脂微粒
S1：取浓度为5mg/ml的酶蛋白溶液在3.5kv/cm范围内，经工频电场处理5min，激活酶蛋白活力，再利用高速匀浆机匀浆处理3次；
S2：将改性磷脂微粒利用等体积比的磷酸缓冲液复溶，复溶液体再与3倍体积比的培养基质液混合，调节pH至7.3；培养基质液包括：2.2wt％磷酸二羟基丙酮、0.7wt％脱氧胆酸钠、2.4wt％海藻糖、1.4wt％半胱氨酸，余量为30mM磷酸缓冲液。培养基质液可为酶蛋白嵌入改性磷脂提供良好的反应环境。
S3：加入处理过的酶蛋白溶液，使得酶蛋白与磷脂的质量比为1:60；
S4：30℃恒温孵育60min，期间利用石墨电极制造脉冲生物电，模拟仿生环境，的脉冲频率为400Hz，脉冲强度为6mv/cm，每间隔5min脉冲处理500μs。并且分3次补充葡萄糖，第一次12mg/L，第二次8mg/L，第三次5mg/L，每次间隔10min。葡萄糖添加总量为25mg/L；
(4)酶-改性磷脂微囊的分离
S1：离心，弃上清，用10mM磷酸缓冲液对酶-改性磷脂微囊充分洗涤，再将酶-改性磷脂微囊重悬于100倍体积的10mM磷酸缓冲液中；
S2：装入密封超滤膜，通入氩气，以8bar压力正压过滤16h；
S3：真空冷冻干燥得到酶-改性磷脂微囊固体粉末。
试验例
采用本实施例2中方法制备的酶-改性磷脂微囊为实验组载体，以市售的纳米脂质载体为对照组载体，分别对三叶苷、青蒿素、紫杉醇进行包裹，并测试其溶解性。
测试方法为：
(1)将三叶苷、青蒿素、紫杉醇分别溶解在乙醇中，得到三叶苷饱和溶液、青蒿素饱和溶液、紫杉醇饱和溶液；
(2)将三叶苷饱和溶液、青蒿素饱和溶液、紫杉醇饱和溶液均分为两组，一组分别与实施例2制备的酶-改性磷脂微囊进行混合，另一组分别与对照组的纳米脂质载体进行混合，冰浴环境中用超声波破碎仪超声乳化，将乳化液离心，弃上清液，即得到了分别包裹了三叶苷、青蒿素、紫杉醇的酶-改性磷脂微囊药物载体，记为第一组；和分别包裹了三叶苷、青蒿素、紫杉醇的纳米脂质药物载体，记为第二组；
(3)将上述第一组和第二组获得的包裹了三叶苷、青蒿素、紫杉醇的药物载体分别用PBS重悬至1ml，并用5％Triton X-100在37℃轻轻摇晃过夜破乳，并用体积比100倍的甲醇稀释；
(4)用高效液相色谱法对三叶苷、青蒿素、紫杉醇进行含量测定，测算出第一组中1ml溶液的载体中三叶苷的含量为13.7％，青蒿素的含量为14.1％，紫杉醇含量为16.5％；第二组中1ml溶液的载体中三叶苷的含量为6.4％，青蒿素的含量为7.3％，紫杉醇含量为7.8％。
结果表明，采用被本实施例2中方法制备的酶-改性磷脂微囊包裹的三叶苷、青蒿素、紫杉醇，比采用市售的纳米脂质载体包裹的三叶苷、青蒿素、紫杉醇的溶解度提高了1.9-2.1倍。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭示的方法范围内，根据本发明的方法及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)改性磷脂的制备
S1：将磷脂溶解于去离子水中，配制成为浓度为3-5％的磷脂溶液；
S2：将所述磷脂溶液在惰性气体氛围保护下进行电磁-超声耦合处理，得到改性磷脂溶液；所述电磁-超声耦合处理的方法为：电磁场处理的强度为2500-4000高斯，压力为0.1-0.2bar，超声波频率为30KHz，处理温度为25℃，处理时间为8-10min；
(2)改性磷脂微粒的制备
S1：向所述改性磷脂溶液中加入脱氧胆酸钠至终浓度为3％，水浴控温至25-26℃；
S2：在惰性气体氛围保护下进行超声波震荡分散，时间为10-20min，温度控制在4-10℃；所述超声波震荡分散的具体操作为：采用超声波横波斜探头，将探头伸入液下1cm，并与液面呈45度夹角，频率为25KHz，脉冲时间为10s；
S3：真空冷冻干燥后得到改性磷脂微粒；
(3)酶蛋白仿生嵌入改性磷脂微粒
S1：取浓度为3-5mg/ml的酶蛋白溶液在1.5-3.5kv/cm范围内，经工频电场处理5min，激活酶蛋白活力，再利用高速匀浆机匀浆处理2-3次；
S2：将改性磷脂微粒利用等体积比的磷酸缓冲液复溶，复溶液体再与2-3倍体积比的培养基质液混合，调节pH至6.8-7.3；所述培养基质液包括：1.8-2.2wt％磷酸二羟基丙酮、0.5-0.7wt％脱氧胆酸钠、2.1-2.4wt％海藻糖、1.1-1.4wt％半胱氨酸，余量为30mM磷酸缓冲液；
S3：加入处理过的酶蛋白溶液，使得酶蛋白与磷脂的质量比为1:50-60；
S4：30℃恒温孵育40-60min，期间利用石墨电极制造脉冲生物电，模拟仿生环境，并且分3次补充葡萄糖，葡萄糖添加总量为25mg/L；所述石墨电极制造脉冲生物电的具体操作为：所述的脉冲频率为400Hz，脉冲强度为1-6mv/cm，每间隔5min脉冲处理100-500μs；所述葡萄糖的添加方法为：第一次12mg/L，第二次8mg/L，第三次5mg/L，每次间隔10min；
(4)酶-改性磷脂微囊的分离
S1：离心，弃上清，用10mM磷酸缓冲液对酶-改性磷脂微囊充分洗涤，再将酶-改性磷脂微囊重悬于100倍体积的10mM磷酸缓冲液中；
S2：装入密封超滤膜，通入惰性气体，正压过滤16-24h；所述正压过滤的压力为3-8bar；惰性气体为氮气或者氩气；
S3：真空冷冻干燥得到酶-改性磷脂微囊固体粉末。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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