CN107126565B - 一种纳米靶向药物载体、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米靶向药物载体、制备方法及其应用，所述的药物载体，其结构式如下：
本发明与现有技术相比，药物载体具有形态结构稳定，能有效地包载疏水性的抗肿瘤药物，药物载体中的靶向基团的靶向作用增加了抗肿瘤药物的选择性，增强抗肿瘤效果，减少对正常组织的毒副作用，载药纳米粒可以长时间滞留肿瘤组织，长时间释放药物以增加药效。
Description
技术领域
本发明涉及药物载体、制备方法及其应用，特别属于纳米靶向药物载体、制备方法及其应用。
背景技术
抗肿瘤药物通常是疏水性的小分子有机物，给药时需要使用有机溶剂增溶，对机体产生毒副作用，严重影响药物的生物利用度，并且抗肿瘤药物由于不具有肿瘤组织的靶向作用，其在杀死肿瘤细胞的同时也会对正常细胞产生毒性，引起严重的毒副作用，不能达到良好的抗肿瘤效果。
发明内容
本发明要解决的第1个技术问题是制备出能包载疏水性抗肿瘤药物且具有肿瘤组织靶向作用的纳米药物载体，使抗肿瘤药物的水溶性增加，减少对正常细胞的毒副作用。
本发明所要解决的第2个技术问题是上述药物载体的制备方法。
本发明所要解决的第3个技术问题是上述药物载体的应用。
本发明解决技术问题的技术方案为
一种纳米靶向药物载体，其结构式如下：
所述纳米靶向药物载体中n＝400-800,甘草次酸根及生物素根的取代度均不为0。
优选的甘草次酸根的取代度为3.72％，生物素根的47.61％。
所述的纳米靶向药物载体的粒径范围是89-144nm，平均粒径约为122nm。
本发明的制备方法，包括以下步骤：
a)反应步骤：将可溶性淀粉、生物素和甘草次酸加入到二甲基亚砜中搅拌溶解，再加入N,N’-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，室温下以150-200转/分的搅拌速度下反应36-48h，得到初产物；
所述可溶性淀粉、生物素、甘草次酸、N,N’-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的质量比为(10-12):(5-7):(2.5-3.5):(2-3):1；
b)透析工序：将a)反应步骤制备的初产物装入透析袋(MW8000-14000)中放入去离子水中透析，每4h换一次去离子水，连续透析24h，抽滤，并分别用无水乙醚和去离子水洗涤3次，得到洗涤物，重复上述步骤3次，将第3次的洗涤物进行于-50℃真空冷冻干燥至恒重，得到甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉；
c)分散步骤：将b步骤制备的甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉溶于去离子水中，在35-40℃，100-120转/分搅拌48-60h后，用探头式超声波仪在100W功率下超声处理3-5分钟用，用1.0μm微孔过滤器过滤得到草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒悬液，将悬液置于冷冻干燥机-50℃真空冷冻干燥至恒重；
甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉与去离子水的重量(g)/体积(ml)比＝1：(100-200)。
所述的纳米靶向药物载体做为分子量小于1200的疏水性抗肿瘤药物载体的应用。
所述的肿瘤为肝肿瘤。
本发明与现有技术相比，所制备的纳米靶向药物载体由疏水性生物素与亲水性淀粉偶联成具有疏水内核和亲水外壳的核-壳式球形纳米粒，亲水外壳的表面共价连接甘草次酸。药物载体中淀粉分子中的羟基是亲水基团暴露在水溶液中，生物素作为疏水端能够相互作用排列在内侧，所以在水溶液中自组装成具有疏水内核和亲水外壳的纳米粒，该纳米粒连接了具有肝主动靶向信号分子甘草次酸，制备的自组装纳米粒在水溶液中能够保持形态结构。其疏水内核可包载疏水性抗肿瘤药物，甘草次酸作为靶向基团实现抗肿瘤药物的肿瘤组织主动靶向输送。
药物载体具有形态结构稳定，能有效地包载疏水性的抗肿瘤药物，药物载体中的靶向基团的靶向作用增加了抗肿瘤药物的选择性，增强抗肿瘤效果，减少对正常组织的毒副作用，载药纳米粒可以长时间滞留肿瘤组织，长时间释放药物以增加药效。
附图说明
图1本发明的反应原理图。
图2可溶性淀粉(A)及甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉(B)的1H-NMR谱图。
图3甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒(实施例1)电镜照片及动态光散射图。
图4甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒(实施例1)的芘荧光光谱
图5甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒(实施例1)的芘荧光强度I386/I374的比值直线图。
图6不同pH值条件下载药甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒的阿霉素的累积释放量图。
图7阿霉素、载药生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒和载药甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒对HepG2细胞的半致死浓度(IC50)图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细的说明。
实施例1
实验原理如图1，具体制备方法如下：
a)反应步骤：取3.0g可溶性淀粉(聚合度为400-800，相对分子量为104-106g/mol)、1.5g生物素和0.75g 18-β甘草次酸溶于150mL二甲基亚砜搅拌溶解，再加入0.5g N,N’-二环己基碳二亚胺和0.25g 4-二甲氨基吡啶以150转/分的搅拌速度室温下反应48h后，得到初产物；
b)透析工序：将a)反应步骤制备的初产物通过将反应物装入透析袋(MW8000-14000)中放入去离子水中透析，每4h换一次去离子水，连续透析24h，抽滤，并分别用无水乙醚和去离子水洗涤3次，得到洗涤物，重复上述步骤3次，将第3次的洗涤物于-50℃真空冷冻干燥至恒重，得到甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉；
c)分散步骤：将b步骤制备的0.1g甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉溶于100mL去离子水中,在37℃下100转/分搅拌48h后，用探头式超声波仪在100W功率下超声处理3分钟，制得甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒悬液，经1.0μm微孔过滤器过滤以除去灰尘和杂质后,于-50℃真空冷冻干燥得到白色絮状甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒。
纳米靶向药物载体即甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉(GBS)的取代度(DS)是每100个无水葡萄糖残基上连接甘草次酸和生物素的个数。因为甘草次酸和生物素在组成元素上的不同，所以将采用两种方法分别测定GBS聚合物中生物素的取代度和甘草次酸的取代度。GBS聚合物中生物素取代度的测定方法是以100mg/L标准硫溶液作为标准品，将配制好的1mg/mL样品溶液放进电感耦合等离子体光谱仪中进行测定，因为只有生物素分子中含有硫元素(S)，所以通过电感耦合等离子体光谱仪测定衍生物中硫元素(S)的含量，进而能够推算生物素的取代度。GBS聚合物中甘草次酸通过紫外光谱来确定GBS聚合物中甘草次酸的取代度。制成系列浓度的甘草次酸标准品溶液，在252nm的波长处测定吸收度，以浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标，绘制甘草次酸标准品标准曲线，再精确称取10mgGBS聚合物溶于50％乙醇中制成1mg/mL的样品溶液，再用紫外分光光度计测定其在252nm时的吸光度值，进而可以计算出甘草次酸的取代度。通过以上方法计算出GBS聚合物中生物素和甘草次酸的取代度分别为47.61％和3.72％。
自组装纳米颗粒的结构信息用1H核磁共振(1H NMR)分析，
采用1H-NMR，选择DMSO-d6作为氘代溶剂，对甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒的结构进行分析，得到1H-NMR谱图如图2。图2中化学位移2.5ppm处对应的是DMSO-d6溶剂的质子吸收峰，3.3ppm处对应的是H2O的质子吸收峰，从可溶性淀粉(A)的1H-NMR图可以看出，淀粉分子中脱水葡萄糖单元上a位上的质子峰则为5.07ppm，b，c，d，e，f上的质子峰分布在3.3～3.8ppm，b，c上的羟基质子峰分布在5.3～5.5ppm，f上的羟基质子峰分布在4.5ppm。甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉(B)的1H-NMR图与可溶性淀粉(A)的氢谱图比较，该图谱中在5.3～5.5ppm处的质子峰明显减弱，并且出现了新的质子峰，6.4ppm处是生物素的-NH-CO上H的吸收峰，2.57～2.85ppm处是生物素-S-CH2-的H吸收峰，在0.7～1.5ppm处出现的吸收峰是甘草次酸的特征吸收峰。
形态用透射电子显微镜观察，粒径大小用激光动态光散射法测定。
图3中透射电子显微镜照片显示甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒为粒径均匀的球形结构(图3左)，激光动态光散射法测定的纳米颗粒的粒径范围在89-144nm，平均粒径约为122nm(图3右)。
临界聚集浓度用芘荧光探针法测定。
图4为不同浓度的甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性纳米粒对芘的荧光影响的光谱图，从图中可以得出随着甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒溶度增加，荧光强度逐渐增加；当纳米粒浓度高于临界聚集浓度时，386nm处的吸光度值增加量多于374nm处的吸光度值增加量的。因此用芘荧光探针在386nm和374nm处的吸光度值的比值确定纳米粒的临界聚集浓度，从图5中两条直线的交点处即为甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒在水溶液中的临界聚集浓度，该浓度为31.8μg/mL。
实施例2：
a)反应步骤：取2.75g可溶性淀粉(聚合度为400-800，相对分子量为104-106g/mol)、1.25g生物素和0.63g 18-β甘草次酸溶于150mL二甲基亚砜搅拌溶解，再加入0.6g N,N’-二环己基碳二亚胺和0.25g 4-二甲氨基吡啶以150转/分的搅拌速度室温下反应48h后，得到初产物；
b)透析工序：将a)反应步骤制备的初产物通过将反应物装入透析袋(MW8000-14000)中放入去离子水中透析，每4h换一次去离子水，连续透析24h，抽滤，并分别用无水乙醚和去离子水洗涤3次，得到洗涤物，重复上述步骤3次，将第3次的洗涤物于-50℃真空冷冻干燥至恒重，得到甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉；
c)分散步骤：将b步骤制备的0.1g甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉溶于150mL去离子水中,在37℃下100转/分搅拌48h后，用探头式超声波仪在100W功率下超声处理3分钟，制得甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒悬液，经1.0μm微孔过滤器过滤以除去灰尘和杂质后,于-50℃真空冷冻干燥得到白色絮状甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒。
实施例3：
a)反应步骤：取2.5g可溶性淀粉(聚合度为400-800，相对分子量为104-106g/mol)、1.75g生物素和0.87g 18-β甘草次酸溶于150mL二甲基亚砜搅拌溶解，再加入0.75g N,N’-二环己基碳二亚胺和0.25g 4-二甲氨基吡啶以150转/分的搅拌速度室温下反应48h后，得到初产物；
b)透析工序：将a)反应步骤制备的初产物通过将反应物装入透析袋(MW8000-14000)中放入去离子水中透析，每4h换一次去离子水，连续透析24h，抽滤，并分别用无水乙醚和去离子水洗涤3次，得到洗涤物，重复上述步骤3次，将第3次的洗涤物于-50℃真空冷冻干燥至恒重，得到甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉；
c)分散步骤：将b步骤制备的0.1g甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉溶于200mL去离子水中,在37℃下100转/分搅拌48h后，用探头式超声波仪在100W功率下超声处理3分钟，制得甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒悬液，经1.0μm微孔过滤器过滤以除去灰尘和杂质后,于-50℃真空冷冻干燥得到白色絮状甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒。
实施例4：
除不加18-β甘草次酸外，其余与实施例1相同。
实施例5：
阿霉素和紫杉醇是临床上常见的疏水性抗肿瘤化疗药物，本发明以阿霉素和紫杉醇作为模式药物以研究甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒对小分子疏水性抗肿瘤药物的包载和释放。
称取5mg盐酸阿霉素与3倍摩尔量的三乙胺混合后再加入10mL二甲基乙酰胺溶液，并向该溶液中分别加入实施例1所制的甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒100mg、200mg、300mg、400mg、500mg，将混合液于4℃放置48h后装于透析袋中，在1/15M,pH7.4的磷酸盐缓冲液中室温下透析三天，第一天每4h更换一次透析介质，之后两天每天更换一次透析介质。将透析袋内的悬液用1.0μm的微孔过滤器去除不溶物，收集清澈滤液，于-50℃真空条件下冷冻干燥至恒重，即得到载阿霉素的甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒。
实施例6：
除所用的药物载体为实施例4所制的载体外，其余与实施例5相同，得到载阿霉素的生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒。
实施例7：
取10mg的载阿霉素的甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒(实施例5)溶于10mLpH值为7.4的磷酸盐缓冲液中，以空白的纳米载体为对照，用荧光分光光度计测量载阿霉素的甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒在激发波长490nm,发射波长560nm处的吸光度值，计算包载的阿霉素的含量，进而得到载阿霉素的甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒的载药量和包封率，当载体与药物的比值从20逐渐增加到100时，载阿霉素的甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉对阿霉素的包封率从64.0％增加到93.4％，而其载药量从3.6％下降为1.06％。
图6为在不同的pH环境中，载阿霉素的甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒的药物累计释放量。从图中可以看到在生理条件即中性环境中阿霉素的释放速度较酸性条件下释放的速度慢，说明该纳米粒具有缓释的作用。
通过MTT实验测定细胞半致死浓度比较游离阿霉素、载阿霉素的生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒(实施例6)和载阿霉素的甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒(实施例5)对肝癌HepG2细胞的抑制效果，从图7中可以得到游离阿霉素(DOX)的细胞半致死浓度为6.2μg/mL，载阿霉素的生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒(DOS/BS)的细胞半致死浓度为3.9μg/mL，载阿霉素的甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒(DOX/GBS)的细胞半致死浓度为1.3μg/mL，三者中载阿霉素的甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒的细胞半致死浓度最小，说明甘草次酸修饰生物素疏水改性淀粉纳米粒对甘草次酸受体表达的肿瘤细胞具有靶向作用，其是通过甘草次酸与细胞膜上的特异性受体结合经胞吞作用能较快地进入到细胞内对肿瘤细胞产生损伤达到抗肿瘤效果。
实施例8：
称取5mg紫杉醇加入10mL二甲基乙酰胺溶液，并向该溶液中分别加入实施例1所制的甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒100mg、200mg、300mg、400mg、500mg，将混合液于4℃放置48h后装于透析袋中，在1/15M,pH 7.4的磷酸盐缓冲液中室温下透析三天，第一天每4h更换一次透析介质，之后两天每天更换一次透析介质。将透析袋内的悬液用1.0μm的微孔过滤器去除不溶物，收集清澈滤液，于-50℃真空条件下冷冻干燥至恒重，
精确称取10mg的载紫杉醇的纳米粒溶于10mL去离子水中，加入15mL的氯仿萃取，应用高效液相色谱仪在流动相乙腈：0.05％三氟乙酸水溶液(60:40)，流速为0.8mL/min,检测波长227nm的条件下，测定有机相，通过制定的标准曲线计算出药物系统中紫杉醇的含量。
紫杉醇含量的标准曲线测定方法：称取1mg紫杉醇完全溶于10ml的氯仿中，并用氯仿将0.1mg/mL的紫杉醇溶液稀释为0.0001mg/mL，0.0005mg/m L，0.001mg/L，0.005mg/mL，0.01mg/mL，0.05mg/mL系列浓度后通过高效液相色谱仪在波长227nm的条件下的检测结果可以绘制出紫杉醇含量的标准曲线。(参考文献:王莺等.叶酸受体介导的负载紫杉醇纳米药物输送系统的制备[J].现代生物医学进展,2013,13(13):2412.)。
通过计算得到当载体与药物的比值从20逐渐增加到100时，纳米粒对紫杉醇的包封率从53％增加到92.1％，但是随着比值的增加，纳米粒的载药量出则从3.2％降到了0.96％。
以上的实验结果验证本发明制备的甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒的形态结果稳定，制备方法简单，增加了疏水性抗肿瘤药物在水中的溶解性，在酸性条件下缓慢释放药物能够延长药物释放时间增加药效，同时本纳米粒中连接有靶向基团甘草次酸，实现了将抗肿瘤药物靶向输送到特定的肿瘤组织，增加了药物的有效利用率，减少了对正常细胞的毒副作用。
Claims (5)
1.一种纳米靶向药物载体，其特征在于：其结构式如下：
所述纳米靶向药物载体中n＝400-800,
其中甘草次酸根的取代度为3.72％，生物素根的取代度为47.61％，
所述的取代度是指每100个葡萄糖残基上连接甘草次酸和生物素的个数，并折算成百分比。
2.根据权利要求1所述的一种纳米靶向药物载体，其特征在于：所述的纳米靶向药物载体的粒径范围是89-144nm，平均粒径为122nm。
3.权利要求1所述的一种纳米靶向药物载体的制备方法，包括以下步骤：
a)反应步骤：将可溶性淀粉、生物素和甘草次酸加入到二甲基亚砜中搅拌溶解，再加入N,N’-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，室温下以150-200转/分的搅拌速度下反应36-48h，得到初产物；
所述可溶性淀粉、生物素、甘草次酸、N,N’-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的质量比为(10-12):(5-7):(2.5-3.5):(2-3):1；
b)透析工序：将a)反应步骤制备的初产物装入MW8000-14000规格的透析袋中放入去离子水中透析，每4h换一次去离子水，连续透析24h，抽滤，并分别用无水乙醚和去离子水洗涤3次，得到洗涤物，重复上述步骤3次，将第3次的洗涤物进行于-50℃真空冷冻干燥至恒重，得到甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉；
c)分散步骤：将b步骤制备的甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉溶于去离子水中，在35-40℃，100-120转/分搅拌48-60h后，用探头式超声波仪在100W功率下超声处理3-5分钟，用1.0μm微孔过滤器过滤，得到甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉纳米粒悬液，将悬液置于冷冻干燥机-50℃真空冷冻干燥至恒重；
甘草次酸修饰生物素疏水改性可溶性淀粉与去离子水的重量g/体积ml比＝1：(100-200)。
4.权利要求1所述的纳米靶向药物载体作为分子量小于1200的疏水性抗肿瘤药物载体的应用。
5.根据权利要求4所述的纳米靶向药物载体的应用，其特征在于：所述的肿瘤为肝肿瘤。
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| "Physicochemical characterization and carcinoma cell interaction of self-organized nanogels prepared from polysaccharide/biotin conjugates for development of anticancer drug carrier";Keun-Hong Park et al;《Journal of Microbiology and Biotechnology》;20061231;第16卷(第9期);第1369页摘要、第1370页Fig.1和第1371页左栏第1-38行 * |
| "Self-assembled nanoparticles of glycyrrhetic acid-modified pullulan as a novel carrier of curcumin";Roufen Yuan et al;《Molecules》;20140828;第19卷;第13305页摘要、第13307页第2.1节和第13313页第3.3节 * |
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