CN107115328A

CN107115328A - 黄腐酚在制备蛋白激酶b抑制剂方面的应用

Info

Publication number: CN107115328A
Application number: CN201710374439.4A
Authority: CN
Inventors: 董子钢; 李美贤; 刘雪娇; 宋孟秋; 刘康栋
Original assignee: China (henan) Hormel Institute For Cancer Research
Current assignee: China (henan) Hormel Institute For Cancer Research
Priority date: 2017-05-24
Filing date: 2017-05-24
Publication date: 2017-09-01
Anticipated expiration: 2037-05-24
Also published as: CN107115328B

Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及一种黄腐酚在制备蛋白激酶B抑制剂方面的应用。黄腐酚（Xanthohumol），分子式：C₂₁H₂₂O₅，分子量：354.4。本发明经试验发现：黄腐酚通过对蛋白激酶B（AKT）的抑制作用而抑制肿瘤的生长。本发明验证了黄腐酚能够抑制蛋白激酶B激酶活性、抑制食管鳞癌细胞KYSE70，KYSE450，KYSE510的增殖、以及抑制食管癌人源化移植瘤模型（PDX）肿瘤的生长，从而显示了黄腐酚对肿瘤有显著的抑制效果。黄腐酚作为蛋白激酶B抑制剂能够用于多种肿瘤（食管癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌等）的预防及治疗。

Description

黄腐酚在制备蛋白激酶B抑制剂方面的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种黄腐酚在制备蛋白激酶B抑制剂方面的应用，其通过抑制蛋白激酶B激酶活性来预防和抑制肿瘤的生长。

背景技术

黄腐酚（Xanthohumol）是一种异戊二烯黄酮，主要来源于啤酒花及中药苦参。其具有抗炎、抗糖尿病、抗氧化、抗病毒等多种活性。AKT也被称为蛋白激酶B（PKB），其涉及多条信号通路，通过影响下游多种因子的活化状态，发挥着抑制凋亡、促进增殖的关键作用。蛋白激酶B激酶本身及其上游调节分子在超过50%的人类肿瘤中均有异常改变。抑制蛋白激酶B对于预防和治疗肿瘤具有重要作用。本发明经研究发现：黄腐酚对肿瘤的抑制作用机制与其抑制蛋白激酶B激酶活性相关，这一发现将对具有蛋白激酶B异常表达的肿瘤病人的治疗具有重要意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种天然化合物黄腐酚在制备蛋白激酶B抑制剂方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了黄腐酚在制备蛋白激酶B抑制剂方面的应用。即本发明发现了黄腐酚对蛋白激酶B激酶的抑制作用，因而黄腐酚可用作制备蛋白激酶B抑制剂。黄腐酚（Xanthohumol），别名：黄腐醇，分子式：C₂₁H₂₂O₅，分子量：354.4，是一种黄色针状结晶，可溶于甲醇、乙醇、DMSO等有机溶剂。黄腐酚市场上有售，可直接购买普通市售产品。

具体的，本发明经实验发现：黄腐酚通过抑制蛋白激酶B激酶活性来预防和抑制肿瘤生长，黄腐酚对蛋白激酶B产生抑制作用的浓度范围为:0.3－2.5 μM。

进一步的，本发明还提供了黄腐酚在制备抗肿瘤药物方面的应用。如，本发明提供了黄腐酚在制备预防和抑制食管鳞癌药物方面的应用。黄腐酚在浓度范围为:2.5－5 μM时能够抑制食管鳞癌细胞（如：KYSE70，KYSE450，KYSE510等）的增殖。

本发明还提供了黄腐酚在制备抑制食管癌人源化移植瘤模型肿瘤生长药物中的应用，即其可以抑制食管癌人源化移植瘤模型（PDX）肿瘤的生长。

进一步的，黄腐酚对PDX模型肿瘤的抑制作用与其抑制蛋白激酶B激酶活性有关，黄腐酚在剂量80 mg/kg、160 mg/kg时能抑制食管癌人源化移植瘤模型肿瘤的生长。PDX模型荷瘤小鼠在用黄腐酚治疗后，肿瘤样本p-AKT、 p-GSK3β的表达量显著性降低。

和现有技术相比，本发明的有益效果：

1）本发明经试验发现：黄腐酚对肿瘤的抑制作用机制与其抑制蛋白激酶B激酶活性相关，这一发现将对具有蛋白激酶B异常表达的肿瘤病人的治疗具有重要意义；

2）以本发明为例，可以将黄腐酚作为蛋白激酶B抑制剂应用于肿瘤的预防及治疗中。蛋白激酶B与细胞存活、细胞凋亡密切相关，抑制蛋白激酶B激酶的活性能够起到预防及治疗肿瘤的作用。本发明中黄腐酚能够抑制蛋白激酶B激酶活性，并能够抑制食管癌细胞增殖、抑制食管癌人源化移植瘤模型（PDX）肿瘤的生长。因此黄腐酚可应用于多种肿瘤（肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌等），可能也会通过对蛋白激酶B激酶活性的抑制而抑制肿瘤的生长。此外，本发明的黄腐酚还可与其他化疗药或激酶抑制剂一起使用，用于肿瘤的预防及治疗。

附图说明

图1为黄腐酚对蛋白激酶B的抑制作用，其中，黄腐酚对蛋白激酶B产生抑制作用的浓度范围为:0.3－2.5 μM；

图2为黄腐酚在对食管鳞癌细胞的抑制作用，其中，黄腐酚在浓度范围为:2.5－5 μM时能够抑制食管鳞癌细胞KYSE70，KYSE450，KYSE510的增殖。本图将对照组做为100%，其他加药不同浓度组均与其进行比较计算出细胞活性。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001；

图3为黄腐酚对食管癌人源化移植瘤模型（PDX）EG9的预防及抑制作用结果。黄腐酚在剂量为80 mg/kg及160 mg/kg时能显著抑制肿瘤的生长。*p<0.05, **p<0.01；

图4为PDX模型EG9肿瘤样本的免疫组化结果。通过对黄腐酚用于PDX模型EG9肿瘤的预防及治疗作用中得到的肿瘤样本进行免疫组化染色，发现肿瘤样本p-AKT, p-GSK3β的表达量显著性降低。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001；

图5为黄腐酚对食管癌人源化移植瘤模型（PDX）HEG18的预防及抑制作用结果。黄腐酚在剂量为80 mg/kg及160 mg/kg时能显著抑制肿瘤的生长。*p<0.05, **p<0.01；

图6为PDX模型HEG18肿瘤样本的免疫组化结果。通过对黄腐酚用于PDX模型HEG18肿瘤的预防及治疗作用中得到的肿瘤样本进行免疫组化染色，发现肿瘤样本p-AKT, p-GSK3β的表达量显著性降低。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

实施例：

材料与方法

1、材料。

1.1试剂

黄腐酚购自四川维克奇生物科技有限公司，纯度为98%。蛋白激酶B激酶试剂盒购自CST公司。MK2206购自selleckchem公司。噻唑蓝（MTT）购自Ruitaibio公司。

1.2仪器与器材：

1.2.1海尔医用低温保存箱（青岛海尔特种电器有限公司）

1.2.2电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）

1.2.3 Thermo 超净工作台

1.2.4酶标仪Multiskan GO microplate Spectrophotometer。

1.3 肿瘤组织

本发明使用了两例人食管癌组织标本。两种模型编号分别为EG9和HEG18。EG9来源于河南省郑州大学第一附属医院，男性，66岁。术后病理切片提示为：鳞癌Ⅱb级，高中分化，淋巴结有转移，病理分期：T2N1M0。HEG18来源于河南省肿瘤医院，女性，73岁。术后病理切片提示为：食管髓质型低分化鳞癌，淋巴结有转移。本发明使用的EG9模型为第8代，HEG18为第5代。

1.4 实验动物

本实施例中SCID免疫缺陷小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司。许可证编号为：SCXK(京)2012-0001，SPF级，6-8周龄，体重16-18g，雌鼠。小鼠饲料购于北京华阜生物科技股份有限公司。实验动物饲养于中美（河南）荷美尔肿瘤研究院的动物设施内，在恒温（22-26℃）、恒湿（45%-50%）、新鲜空气、除尘除菌的无特殊病原菌（SPF级）饲养室条件下饲养，动物先放于有机塑料盒内（苏州市冯氏实验动物设备有限公司），再置于IVC系统饲养，每个饲养盒内饲养3-4只动物，经无菌处理的饲料供动物自由摄入，高温消毒的垫料每三天更换一次，笼具及饮水每三天紫外线消毒一次，饮用无菌蒸馏水。更换饲养用品时严格遵循无菌原则操作。将实验动物在12:12小时光照/黑暗循环下饲养，可以自由接近食物和水。

1.5 动物实验药物的配制

药物溶剂为5%二甲基亚砜（DMSO），45%聚乙二醇400（PEG400），50%磷酸缓冲盐溶液（PBS）。

2方法。

2.1 蛋白激酶B激酶实验

根据CST公司激酶试剂盒提供的实验方案，测定不同浓度黄腐酚、及阳性对照药蛋白激酶B 激酶抑制剂MK2206对蛋白激酶B激酶的抑制作用。结果见图1。

2.2 细胞增殖实验

食管鳞癌细胞KYSE70，KYSE450，KYSE510接种于96孔板，每孔1000-2000细胞，24小时后分别加入不同浓度的黄腐酚，分别在加药后0小时、24小时、48小时、72小时加入噻唑蓝，测定吸光度OD值。结果见图2。

2.3食管癌人源化移植瘤模型的建立

将新鲜肿瘤组织剔除坏死组织，剪成0.1－0.12 g，3 mm左右小块，移植于雌性小鼠的背部皮肤下。待肿瘤长到约15 mm左右，取下肿瘤剪成0.1－0.12g，3 mm小块，移植于另外小鼠即为传代。待各荷瘤鼠的移植瘤出现且肿瘤大小差异不大。再移植至免疫缺陷小鼠皮下进行实验。

2.4实验动物分组及治疗

接种一周后，小鼠背部肿瘤长到100立方毫米左右时开始分组，按照肿瘤体积大小均匀分配小鼠至每组，每组分10-15只。实验小鼠分为三组，分别是：溶剂对照组(A)、黄腐酚低剂量组(B)、黄腐酚高剂量组(C)。每天进行灌胃给药，每周两次记录小鼠体重以及肿瘤体积，当溶剂对照组小鼠肿瘤长到1000立方毫米左右时（约50天），终止实验，取下肿瘤并称重。肿瘤组织石蜡包埋后做免疫组化染色，分析p-AKT、p-GSK3β的表达量；

溶剂对照组(A)：灌胃溶剂（5%DMSO，45%PEG400，50%PBS）；

黄腐酚低剂量组(B)：每天以80 mg/kg小鼠体重灌胃黄腐酚；

黄腐酚高剂量组(C)：每天以160 mg/kg小鼠体重灌胃黄腐酚。

实验结果。

1. 黄腐酚对蛋白激酶B激酶活性具有抑制作用（见图1），其中，黄腐酚对蛋白激酶B激酶产生抑制作用的浓度范围为: 0.3－2.5 μM。

2. 黄腐酚对食管鳞癌细胞具有抑制作用（见图2），其中黄腐酚在浓度范围为2.5－5 μM时能够抑制食管鳞癌细胞KYSE70、KYSE450、KYSE510的增殖。以对照组为100%，*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。

3. 黄腐酚对食管癌人源化移植瘤模型（PDX）EG9的预防及抑制作用结果见图3。黄腐酚在剂量为80 mg/kg及160 mg/kg时能显著抑制肿瘤的生长。*p<0.05, **p<0.01。

4．黄腐酚对PDX模型EG9免疫组化的检测结果见图4。对黄腐酚用于PDX模型EG9肿瘤的预防及治疗作用中得到的肿瘤样本进行免疫组化染色，通过结果可见：与对照组相比，实验组肿瘤样本p-AKT, p-GSK3β的表达量显著性降低。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。

5. 黄腐酚对食管癌人源化移植瘤模型（PDX）HEG18的预防及抑制作用结果见图5。黄腐酚在剂量为80 mg/kg及160 mg/kg时能显著抑制肿瘤的生长。*p<0.05, **p<0.01。

6．黄腐酚对PDX模型HEG18免疫组化的检测结果见图6。对黄腐酚用于PDX模型HEG18肿瘤的预防及治疗作用中得到的肿瘤样本进行免疫组化染色，通过结果可见：与对照组相比，实验组肿瘤样本p-AKT, p-GSK3β的表达量显著性降低。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。

综上可以看出：黄腐酚作为一种小分子天然化合物，能够抑制蛋白激酶B激酶活性，是一种蛋白激酶B激酶抑制剂；能够抑制食管鳞癌细胞KYSE70、KYSE450、KYSE510的增殖；能抑制食管癌人源化移植瘤模型（PDX）肿瘤的生长。黄腐酚通过对蛋白激酶B激酶活性的抑制从而可以预防肿瘤的发生及抑制肿瘤的生长。

Claims

1.黄腐酚在制备蛋白激酶B抑制剂方面的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，黄腐酚通过抑制蛋白激酶B激酶活性来预防和抑制肿瘤生长，黄腐酚对蛋白激酶B产生抑制作用的浓度范围为:0.3－2.5 μM。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，黄腐酚在制备抗肿瘤药物方面的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，黄腐酚在制备预防和抑制食管鳞癌药物方面的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，黄腐酚在浓度范围为:2.5－5 μM时能够抑制食管鳞癌细胞的增殖。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，黄腐酚在制备抑制食管癌人源化移植瘤模型肿瘤生长药物中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，黄腐酚在剂量80 mg/kg、160 mg/kg时能抑制食管癌人源化移植瘤模型肿瘤的生长。