CN107090416A - 一株肉桂链霉菌及其生产磷脂酶d的方法 - Google Patents

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Abstract

一株肉桂链霉菌及其生产磷脂酶D的方法，属于食品生物技术领域。本发明提供一株新的链霉菌，其可以生产磷脂酶D，其命名为肉桂链霉菌（Streptomyces cinnamoneus）SK43.002，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2017010。本发明对该肉桂链霉菌进行斜面、种子、发酵三级培养；从发酵液中分离纯化得到磷脂酶D酶粉。本发明利用链霉菌生产得到磷脂酶D工艺简单，成本较低；得到的磷脂酶D酶活较高，稳定性好，可以广泛应用在食品、生物等领域，具有广阔的市场前景。

Description

一株肉桂链霉菌及其生产磷脂酶D的方法
技术领域
本发明涉及一株肉桂链霉菌（Streptomyces cinnamoneus）SK43.002及其生产磷脂酶D的方法，属于食品生物技术领域。
背景技术
磷脂酶D（PLD）（EC3.1.4.4）是一类催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的酶的总称，主要底物是磷脂酰胆碱（PC），将其水解成磷脂酸（PA）和胆碱。磷脂酶D广泛存在于动植物和微生物体内，植物体内的磷脂酶D在信号传导、膜运输等方面具有重要作用；动物体内的磷脂酶D多为膜结合酶；微生物来源的PLD主要有链霉菌、棒状杆菌、大肠杆菌、假单胞菌、沙门氏杆菌等，其中又以源自链霉菌属的PLD的转磷酯活性最为突出。
磷脂酶D主要应用于磷脂转化和改性，制备高纯度的磷脂产品，如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油等；同时在油脂深加工中，较多利用磷脂酶D进行大豆油脱胶等；磷脂酶D也可以应用在医药工业中，其可将一些多肽、核苷和多糖类药物通过配位键连接在磷脂载体上，制成具有特殊疗效作用的脂质体。利用磷脂酶D还可合成一些抗肿瘤试剂等。
目前，关于磷脂酶D的制备和研究主要针对链霉菌，链霉菌来源的磷脂酶D具有较高的水解和转酰基活力，本发明中所利用的肉桂链霉菌同样具有较高的酶学活性，可以进一步大规模生产。
发明内容
本发明的目的是提供一株肉桂链霉菌及其生产磷脂酶D的方法。
本发明的技术方案：一株肉桂链霉菌是从油脂厂附近的土壤中筛选分离得到的一株可以高产磷脂酶D的链霉菌，分类命名为肉桂链霉菌（Streptomyces cinnamoneus）SK43.002，巳保藏于中国典型培养物保藏中心，筒称CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M2017010。
用所述肉桂链霉菌CCTCC NO：M2017010发酵生产磷脂酶D的方法，步骤如下：
（1）磷脂酶D的发酵液制备：对肉桂链霉菌（Streptomyces cinnamoneus）SK43.002进行斜面、种子、发酵三级培养；
a、斜面培养：ISP培养基（g/L）：酵母提取物2，麦芽提取物10，葡萄糖15，琼脂15~20，自然pH，115℃灭菌30min，培养温度28~30℃，培养时间5~8天；
b、种子培养：培养基（g/L）：葡萄糖10~20，酵母膏10~20，蛋白胨5~15，K2HPO4 0.1~2，MgSO4•7H2O 0.1~2，自然pH，115℃灭菌30min，培养条件：28℃、200rpm摇床培养24h；
c、发酵培养：培养基（g/L）：葡萄糖10~30，酵母膏5~20，蛋白胨10~20，K2HPO4 0.1~2，MgSO4•7H2O 0.1~2，自然pH，115℃灭菌30min，发酵条件：接种量5%、28℃、200rpm摇床培养5～8天，发酵得到含有磷脂酶D的发酵液，经检测酶活达到1～30U/mL；
（2）磷脂酶D的分离纯化：对步骤（1）所得到的含有磷脂酶D发酵液进行离心过滤以去除菌体得到发酵上清，再经过硫酸铵分离沉淀目的蛋白、缓冲液透析、离子交换层析、凝胶过滤层析，超滤浓缩，最后将得到的纯酶液体冷冻干燥成磷脂酶D酶粉。
本发明中的磷脂酶D活性，是将磷脂酶D作用于磷脂酰胆碱，分解生成胆碱，利用酶联比色法检测生成的胆碱的量而测定的。该酶的酶活单位定义为每分钟生成1μmol的胆碱所需要的酶量。
本发明的有益效果：本发明利用肉桂链霉菌作为磷脂酶D的生产菌株，该菌株培养方便，发酵工艺简单。其酶为胞外酶，易于提取，酶活力高，性质稳定，具有广阔的市场应用前景。
生物材料样品保藏：一株肉桂链霉菌，分类命名为肉桂链霉菌（Streptomycescinnamoneus）SK43.002，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地点：中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M2017010，保藏日期：2017年1月5日。
具体实施方式
以下是肉桂链霉菌（Streptomyces cinnamoneus）SK43.002进行发酵生产磷脂酶D的实施例，但本发明的技术范围并不限于所列出的几个实例，在不改变其要点的前提下，可做各种改变进行实施。另外，本发明的技术范围延及均等的范围。
实施例1
将肉桂链霉菌（Streptomyces cinnamoneus）SK43.002在下述条件下进行发酵：
斜面培养：ISP培养基（g/L）：酵母提取物2，麦芽提取物10，葡萄糖15，琼脂15，自然pH，115℃灭菌30min，培养温度28℃，培养时间5天。
种子培养：培养基（g/L）：葡萄糖10，酵母膏20，蛋白胨5，K2HPO4 2，MgSO4·7H2O0.5，自然pH，115℃灭菌30min。培养条件：28℃、200rpm摇床培养24h。
发酵培养：培养基（g/L）：葡萄糖10，酵母膏5，蛋白胨5，K2HPO4 2，MgSO4·7H2O0.5，自然pH，115℃灭菌30min。发酵条件：接种量5%、28℃、200rpm摇床培养5天，得到含有磷脂酶D的发酵液，酶活力7.8U/mL。
实施例2
将肉桂链霉菌（Streptomyces cinnamoneus）SK43.002在下述条件下进行发酵：
斜面培养：ISP培养基（g/L）：酵母提取物2，麦芽提取物10，葡萄糖15，琼脂15，自然pH，115℃灭菌30min，培养温度28℃，培养时间5天。
种子培养：葡萄糖15，酵母膏15，蛋白胨15，K2HPO4 0.5，MgSO4•7H2O 2，自然pH，115℃灭菌30min，培养条件：28℃、200rpm摇床培养24h；
发酵培养：葡萄糖30，酵母膏20，蛋白胨15，K2HPO4 0.1~2，MgSO4•7H2O 2，自然pH，115℃灭菌30min，发酵条件：接种量5%、28℃、200rpm摇床培养8天，发酵得到含有磷脂酶D的发酵液，经检测酶活达到28.5U/mL。
实施例3
磷脂酶D酶粉制备：
将实施例1所得到的发酵液于4℃、8000rpm离心20min，取上清，再经过20%~70%干燥的硫酸铵粉末分离沉淀目的蛋白、用pH=8的0.1M磷酸盐缓冲液透析除去盐离子，再依次经过DEAE-FF 16/10离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析，用1万Da截留分子量超滤膜浓缩，冷冻干燥即成磷脂酶D酶粉，酶活力576 U/mg。

Claims (2)

1.一株产磷脂酶D的菌株，其分类命名为肉桂链霉菌（Streptomyces cinnamoneus）SK43.002，巳保藏于中国典型培养物保藏中心，筒称CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M2017010。
2.用权利要求1所述的肉桂链霉菌SK43.002发酵生产磷脂酶D的方法，其特征在于步骤为：
（1）磷脂酶D的发酵液制备：对肉桂链霉菌（Streptomyces cinnamoneus）SK43.002进行斜面、种子、发酵三级培养；
a、斜面培养：ISP培养基以g/L计：酵母提取物2，麦芽提取物10，葡萄糖15，琼脂15~20，自然pH，115℃灭菌30min，培养温度28~30℃，培养时间5~8天；
b、种子培养：培养基以g/L计：葡萄糖10~20，酵母膏10~20，蛋白胨5~15，K2HPO4 0.1~2，MgSO4·7H2O 0.1~2，自然pH，115℃灭菌30min，培养温度28℃、200rpm摇床培养24h；
c、发酵培养：培养基以g/L计：葡萄糖10~30，酵母膏5~20，蛋白胨10~20，K2HPO4 0.1~2，MgSO4·7H2O 0.1~2，自然pH，115℃灭菌30min，发酵条件：接种量5%、28℃、200rpm摇床培养5～8天，发酵得到含有磷脂酶D的发酵液；
（2）磷脂酶D的分离纯化：对步骤（1）所得到的含有磷脂酶D发酵液进行离心过滤以除掉菌体得到发酵上清，再经过硫酸铵分离沉淀目的蛋白、缓冲液透析、离子交换层析、凝胶过滤层析，超滤浓缩，最后将得到的纯酶液体冷冻干燥即成磷脂酶D酶粉。
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