CN107084950A - β‑环糊精增敏亚甲基蓝荧光法测定抗生素类药物含量的方法 - Google Patents

β‑环糊精增敏亚甲基蓝荧光法测定抗生素类药物含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种β‑环糊精增敏亚甲基蓝荧光法测定抗生素类药物含量的方法，属于药品中抗生素类药物含量的测定技术领域。本发明的技术方案要点为：β‑环糊精增敏亚甲基蓝荧光法测定抗生素类药物含量的方法，包括标准曲线的绘制和待测药品中抗生素类药物含量的测定等步骤。本发明利用β‑环糊精作增敏剂，通过主客体相互作用与亚甲基蓝形成包合物，可以在更低浓度下间接测定一些还原性药物的含量，大大降低了这些药品的检测限；本发明的测定方法对实际样品进行检测过程，进行50次平行测定得出相对标准偏差小于2%，进而表明该方法重现性较好，稳定性较高且灵敏度较高。

Description

β-环糊精增敏亚甲基蓝荧光法测定抗生素类药物含量的方法
技术领域
本发明属于药品中抗生素类药物含量的测定技术领域，具体涉及一种β-环糊精增敏亚甲基蓝荧光法测定抗生素类药物含量的方法。
背景技术
抗生素是由某些微生物产生的化学物质，能抑制微生物和其它细胞增殖的物质，包括抗细菌药物、抗真菌药物以及对抗其他微小病原的药物，常见的抗生素类药物有头孢氨苄、头孢拉定和左氧氟沙星等。
对抗生素类药物的测定已见报道的方法主要有分光光度法、荧光法、流动注射化学发光法、高效液相色谱法和电化学分析法等。然而分光光度法的灵敏度不够，高效液相色谱法所需设备较昂贵，难于普及，而已报道的荧光法以及化学发光法均需对抗生素类药物先在强酸介质或强碱介质中水浴加热水解20min使其生成荧光产物，其分析过程较长且步骤较为繁琐。
环糊精(Cyclodextrin，简称CD)是由亲水的外腔和能够包合一系列有机或无机化合物的疏水性空腔组合而成的环状聚合物，其中β-CD的应用最为广泛。有机客体分子被β-CD包结后，β-CD空腔内的高电子云密度会诱导客体分子的电子发生移动，从而影响有机客体分子的光学性质。利用这种原理可以测定出客体分子与β-CD的包结平衡常数及热力学常数，同时通过改变溶液极性、离子强度等因素可以推测包结过程的驱动力。
亚甲基蓝(Methylene blue)是一种芳香杂环化合物，具有刚性平面，易产生荧光，常被用作化学指示剂、染料、生物染色剂和药物使用。已有文献报道，染料作为一种独特的客体，可以和环糊精形成一系列稳定的包合物，但是并未见关于研究亚甲基蓝和β-环糊精包合物的报道。本专利通过紫外可见分光光度法﹑荧光光谱法﹑分子模拟和红外光谱法研究了β-CD和亚甲基蓝形成包合物的包合机理及微环境对包合物光谱性能的影响，并求出了包合物的包和比及包和常数。
发明内容
本发明针对现有技术的不足而提供了一种简单、快速且灵敏的β-环糊精增敏亚甲基蓝荧光法测定抗生素类药物含量的方法，该方法具有很高的灵敏度和较低的检测限，并且操作简单，干扰物质较少。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，β-环糊精增敏亚甲基蓝荧光法测定抗生素类药物含量的方法，其特征在于具体步骤为：
(1)标准曲线的绘制，在10mL比色管中依次加入不同质量浓度的抗生素类药物标准溶液3mL、5mol/L的盐酸溶液0.4mL和25mg/L的KBrO3-KBr溶液0.6mL，摇匀，反应10min，再加入1.0×10-4mol/L的亚甲基蓝溶液1.0mL，反应10min，然后加入β-CD 3mL，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，静置30min后，以660nm为激发波长在荧光光谱仪中测定混合溶液的荧光强度F，以不加抗生素类药物溶液的混合溶液为空白F0，计算ΔF＝F-F0，并用ΔF对抗生素类药物标准溶液的质量浓度绘制标准曲线；
(2)待测药品中抗生素类药物含量的测定，将待测药品研磨、精密称重并溶解稀释成10mg/L的待测药品溶液，移取待测药品溶液3mL置于10mL的比色皿中，并加入5mol/L的盐酸溶液0.4mL和25mg/L的KBrO3-KBr溶液0.6mL，摇匀，反应10min，再加入1.0×10-4mol/L的亚甲基蓝溶液1.0mL，反应10min，然后加入β-CD 3mL，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，静置30min后，以660nm为激发波长在荧光光谱仪中测定混合溶液的荧光强度F1，以不加抗生素类药物溶液的混合溶液为空白F0，计算ΔF1＝F1-F0，并根据步骤(1)绘制的标准曲线计算得到待测药品溶液中抗生素类药物的质量浓度，然后根据待测药品溶液中抗生素类药物的质量浓度、待测药品溶液的体积及待测药品的质量计算得到待测药品中抗生素类药物的含量。
进一步优选，所述的抗生素类药物为头孢氨苄、头孢拉定或左氧氟沙星。
进一步优选，所述的荧光光谱仪在测定过程中的温度保持在10℃。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
1、本发明利用氧化剂溴水与抗生素类还原性药物发生氧化还原反应，选择性较强，反应较为灵敏；
2、本发明用荧光法间接测定抗生素类药物的含量，灵敏度较高，操作简单，不需要复杂的大型仪器；
3、本发明利用β-环糊精作增敏剂，通过主客体相互作用与亚甲基蓝形成包合物，可以在更低浓度下间接测定抗生素类药物的含量，大大降低了该类抗生素类药物的检测限；
4、本发明的测定方法对实际样品进行检测过程，进行50次平行测定得出相对标准偏差小于2％，表明该方法重现性较好，稳定性较高且灵敏度较高。
附图说明
图1是MB在KBrO3-KBr、KBrO3-KBr/β-CD、KBrO3-KBr/CPX、KBrO3-KBr/β-CD/CPX中的荧光光谱图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
本发明利用β-环糊精作为增敏剂，通过主客体相互作用与亚甲基蓝形成包合物的方法测定抗生素类药物的含量，代表性的抗生素类药物主要有头孢氨苄、头孢拉定和左氧氟沙星等。其中头孢氨苄的结构式如式(I)所示，头孢拉定的结构式如式(II)所示，左氧氟沙星的结构式如式(III)所示。
通过研究发现，测定这几种抗生素类药物均是利用β-环糊精增敏亚甲基蓝的方法，β-环糊精的空腔大小和疏水性使其特别容易包合荧光试剂亚甲基蓝，属于一种超分子自组装，能大大增强亚甲基蓝的荧光强度。利用β-环糊精作为敏化剂，通过主客体相互作用与亚甲基蓝形成包合物，其荧光强度是亚甲基蓝的近2倍，作为荧光探针使用，可以大大提高测定的灵敏度，进而能够实现在更低浓度下间接测定该类抗生素类药物的含量。
本发明测定过程的实验方法为：(1)标准曲线的绘制，在10mL比色管中依次加入不同质量浓度的抗生素类药物标准溶液3mL、5mol/L的盐酸溶液0.4mL和25mg/L的KBrO3-KBr溶液0.6mL，摇匀，反应10min，再加入1.0×10-4mol/L的亚甲基蓝溶液1.0mL，反应10min，然后加入β-CD 3mL，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，静置30min后，以660nm为激发波长在荧光光谱仪中测定混合溶液的荧光强度F，以不加抗生素类药物溶液的混合溶液为空白F0，计算ΔF＝F-F0，并用ΔF对抗生素类药物标准溶液的质量浓度绘制标准曲线；
(2)待测药品中抗生素类药物含量的测定，将待测药品研磨、精密称重并溶解稀释成10mg/L的待测药品溶液，移取待测药品溶液3mL置于10mL的比色皿中，并加入5mol/L的盐酸溶液0.4mL和25mg/L的KBrO3-KBr溶液0.6mL，摇匀，反应10min，再加入1.0×10-4mol/L的亚甲基蓝溶液1.0mL，反应10min，然后加入β-CD 3mL，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，静置30min后，以660nm为激发波长在荧光光谱仪中测定混合溶液的荧光强度F1，以不加抗生素类药物溶液的混合溶液为空白F0，计算ΔF1＝F1-F0，并根据步骤(1)绘制的标准曲线计算得到待测药品溶液中抗生素类药物的质量浓度，然后根据待测药品溶液中抗生素类药物的质量浓度、待测药品溶液的体积及待测药品的质量计算得到待测药品中抗生素类药物的含量。
实施例1
头孢氨苄的检测
本实施例选择采用本法对市售头孢氨苄片(黑龙江惠普生医药有限公司)和头孢氨苄胶囊(石药集团欧意有限公司)中头孢氨苄含量进行测定，作为待测样品，对其中的头孢含量进行检测。
依照实验所述方法进行实验后，在荧光光谱仪上分别绘制MB在KBrO3-KBr、KBrO3-KBr/β-CD、KBrO3-KBr/CPX、KBrO3-KBr/β-CD/CPX中的荧光光谱图(如图1所示)。该方法包括四个阶段，第一阶段为BrO3 -+5Brˉ+6H+＝3Br2+3H2O，KBrO3-KBr在强酸中生成Br2；第二阶段为未知的头孢氨苄与过量已知的Br2之间的氧化还原反应，此阶段中头孢氨苄被消耗殆尽；第三阶段为剩余的Br2与适量已知的MB之间的氧化还原反应，此阶段中剩余的Br2被消耗殆尽；第四阶段为β-CD与剩余的MB之间发生包合反应，形成较稳定的包合产物，β-CD的疏水空腔增强剩余MB的荧光强度，在最大激发波长为660nm条件下测定头孢氨苄的含量。根据以上步骤，分别绘制了在HCl介质中，MB在β-CD和水溶液中的荧光发射光谱图(如图1)，得出以下结论：(1)加入β-CD后FKBrO3-KBr+MB上升为原来的近5倍(曲线1和2)；(2)加入头孢氨苄后FKBrO3-KBr+MB上升为原来的近8倍(曲线1和3)；(3)在等量的头孢氨苄条件下，ΔF＝FCPX+KBrO3-KBr+MB+β-CD-F0KBrO3-KBr+MB+β-CD(曲线4和2)的荧光增敏值是ΔF＝FCPX+KBrO3-KBr+MB–F0KBrO3-KBr+MB(曲线3和1)的近3倍，由此可知痕量的头孢氨苄对β-CD增敏KBrO3-KBr氧化MB体系的荧光具有增强作用。
关于该体系的反应机理，我们推测可能是：
(1)BrO3 -+5 Br-+6 H+＝3 Br2+3H2O
(2)
(3)
取头孢氨苄片8片精细研磨均匀后称其重量，取其重量的十分之一(约为0.20g头孢氨苄)溶于100mL容量瓶中，超声30min，干过滤，取其后续滤液5mL于100mL容量瓶中，定容至刻度，备用。
取头孢氨苄胶囊8粒混合均匀后称其重量，取其重量的十分之一(约为0.20g头孢氨苄)溶于100mL容量瓶中，超声30min，干过滤，取其后续滤液5mL于100mL容量瓶中，定容至刻度，备用。
采用本方法对市售头孢氨苄片(黑龙江惠普生医药有限公司)和头孢氨苄胶囊(石药集团欧意有限公司)中的头孢氨苄含量进行测定，结果如表1所示。
表1实际样品中头孢氨苄含量的测定结果
实施例2
头孢拉定的检测
采用本法对市售头孢拉定片(石药集团欧意有限公司)和头孢拉定胶囊(石药集团欧意有限公司)中的头孢拉定含量进行测定，所得结果与HPLC法的测定结果全部绘制到下表。发现我们所用的方法无论是用F-检验或是t-检验都不存在显著性差异，说明该分析方法可靠，能用于实际样品中头孢拉定含量的测定，可以用于临床检验，结果如表2所示。
表2实际样品中头孢拉定含量的测定结果
实施例3
左氧氟沙星的检测
采用本法对市售盐酸左氧氟沙星片(四川珍珠制药有限公司)，盐酸左氧氟沙星胶囊(扬子江药业集团有限公司)中的左氧氟沙星含量进行测定，结果如表3所示。
表3实际样品中左氧氟沙星含量的测定结果
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

Claims (3)

1.β-环糊精增敏亚甲基蓝荧光法测定抗生素类药物含量的方法，其特征在于具体步骤为：
（1）标准曲线的绘制，在10mL比色管中依次加入不同质量浓度的抗生素类药物标准溶液3mL、5mol/L的盐酸溶液0.4mL和25mg/L的KBrO3-KBr溶液0.6mL，摇匀，反应10min，再加入1.0×10-4mol/L的亚甲基蓝溶液1.0mL，反应10min，然后加入β-CD 3mL，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，静置30min后，以660nm为激发波长在荧光光谱仪中测定混合溶液的荧光强度F，以不加抗生素类药物溶液的混合溶液为空白F0，计算ΔF=F- F0，并用ΔF对抗生素类药物标准溶液的质量浓度绘制标准曲线；
（2）待测药品中抗生素类药物含量的测定，将待测药品研磨、精密称重并溶解稀释成10mg/L的待测药品溶液，移取待测药品溶液3mL置于10mL的比色皿中，并加入5mol/L的盐酸溶液0.4mL和25mg/L的KBrO3-KBr溶液0.6mL，摇匀，反应10min，再加入1.0×10-4mol/L的亚甲基蓝溶液1.0mL，反应10min，然后加入β-CD 3mL，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，静置30min后，以660nm为激发波长在荧光光谱仪中测定混合溶液的荧光强度F1，以不加抗生素类药物溶液的混合溶液为空白F0，计算ΔF1=F1- F0，并根据步骤（1）绘制的标准曲线计算得到待测药品溶液中抗生素类药物的质量浓度，然后根据待测药品溶液中抗生素类药物的质量浓度、待测药品溶液的体积及待测药品的质量计算得到待测药品中抗生素类药物的含量。
2.根据权利要求1所述的β-环糊精增敏亚甲基蓝荧光法测定抗生素类药物含量的方法，其特征在于：所述的抗生素类药物为头孢氨苄、头孢拉定或左氧氟沙星。
3.根据权利要求1所述的β-环糊精增敏亚甲基蓝荧光法测定抗生素类药物含量的方法，其特征在于：所述的荧光光谱仪在测定过程中的温度保持在10℃。
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