CN107076708A - 用于物质分级的装置和分级方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于流体中的弥散相的动态分级的装置和方法。装置包括分级通道和第一注入口至第三注入口。通过第一注入口和第二注入口能够分别注入第一限制流体和第二限制流体。通过在第一注入口与第二注入口之间配置的第三注入口能够将用于输送弥散相的洗脱流体注入通道。通道的端部包括第一终端部至第三终端部，第一终端部至第三终端部分别与第一注入口至第三注入口对应地配置并具有如下几何结构：使得第一限制流体和第二限制流体分别具有第一预定流量和第二预定流量，洗脱流体具有大于第一预定流量和第二预定流量的第三预定流量。

Description

用于物质分级的装置和分级方法

技术领域

本发明涉及用于分级分散流体(dispersing fluid)中的物质、尤其是生物材料的装置；本发明还涉及分散流体中的这些有机或无机物质、特别是微小物质、生物材料等的分级方法。

背景技术

从现有已知用于弥散物质和颗粒的分级的装置。特别地，这些装置能够用于分级诸如细胞样品等的生物材料。在这种情况下，颗粒能够为单细胞或细胞的集群，还彼此不同。

尽管分级装置能够用于任何类型的生物材料，但是对使用该装置来选择和离析干细胞存在浓厚的兴趣。因此，在以下公共区域的不同分级方法和装置中，与生物材料和干细胞相关。

待分离的生物原始细胞样品是由以附着(附着于基体或支架)或以悬浮在生理流体中的方式生长的不同细胞种类构成的异质性细胞群的等价物。从原始样品能够首先获得以附着于塑料基体的方式培养生长的附着细胞和以分散在分散流体中的方式培养生长的其它悬浮种类。特别地，间充质干细胞被视作附着细胞，而其它悬浮种类是如血细胞、淋巴细胞、红细胞、和肿瘤细胞等的细胞。

干细胞是致力于通过置换损伤的成熟细胞来维持组织的功能和结构完整性的“原始”细胞。干细胞可以依据其分化成不同种类的组织的能力不同(“潜能”的程度不同)以及在似乎将成为医学未来的再生医学中的巨大前景来区分。

简化来自实际来源的复杂且异质的样品的可行性以及再利用废弃组织(作为脂肪组织和新生组织)的机会，基于从再生医学到诊断等不同应用目的而得到不同细胞类型的亚群，通常是具挑战性的。近年来，因用作细胞药物的潜能而特别关注了作为诊断领域的生物标志物的肿瘤细胞、以及干细胞和血细胞(特别是外周血)。

干细胞分布在所有组织中，它们主要存在于包括骨髓、牙髓、脂肪组织、外周血、脐带和胎膜等来源，干细胞可以从中选择，但它们在组织中的定位并不明确，且无法在从更加分化且源于干细胞的所有不同细胞离析的特定区域内识别。目前，利用识别膜抗原的存在的免疫标记(immunolabeling)技术或通过基因选择技术来进行人干细胞的选择/富集。然而，免疫标记可损伤干细胞或诱导它们进入不期望的分化进程，并且免疫标记被认为是"硬"细胞分选技术，这是因为其无法满足关于并非将分析细胞用于研究而是出于医学和临床目的而使用的最小限度操作的规定。

此外，基因选择需要细胞的遗传修饰，该遗传修饰具有针对分选细胞的体内再利用的已知相关问题。基因选择也是昂贵的且显示长的操作时间。

能够分化成任何种类的细胞和组织的全能干细胞的第一来源是胚胎。尽管如此，来自人胚胎的全能干细胞的实验和使用在某些国家(如在意大利，由于2005年6月的公投结果)是被禁止的，而许多其他国家也受到强制立法的严令禁止或者生物伦理考量的阻挠(如其他欧洲国家或美国)。

多能干细胞，在全能干细胞之后，是最具“生活力”的，例如能够专用于各种组织中的存在于几乎所有人体组织中的间充质干细胞。

胚胎以外来源的多能干细胞的低可用性要求使用有效技术用于它们的选择/富集，以便获得充足的细胞数目用以进一步的应用。

多能干细胞不能通过涉及使用特定标志物的直接免疫标记或通过细胞选择技术来选择/富集，这些方法诸如含有免疫涂布的磁珠的流式细胞术中的流式辅助细胞分选(FACS)或磁性辅助细胞分选(MACS)，这是因为这些方法的选择是基于细胞分化性质特有的免疫学标志物(免疫标志物)的识别，且随着干细胞能力等级的增加而难以识别。出于这些原因，尚不存在能够毫无疑问地识别间充质细胞的一整套标志物。

一般而言，间充质干细胞为表达非常广泛的且多样化的表面抗原组的多能细胞，其阻碍了通过直接免疫标记法基于表型特性的准确区分(W.Wagner等，ExperimentalHematology 33(2005)1402-1416)。

FACS和MACS技术也可对分选的间充质干细胞造成生理负担，活细胞的回收相对低，再生和生长的能力低，以及分化能力也不同，进而与期望的分化途径偏离，这会导致不期望的组织和癌组织形成。

采用针对非间充质干细胞的细胞的免疫标志物的"负"选择技术将用于从整个细胞群中排除MSC。该技术无法绝对保证在去除群体内靶细胞的存在，这是因为其并未特异性标记因而无法结合到特定的标志物。这种去除，因其非特异性(aspecificity)，也无法区分属于同一家族的间充质细胞亚群，并且不能区分不同来源的群体之间或同一来源的亚群之间的可能差异。

间充质干细胞也通过基因选择过程(基因转移技术，GTT)进行分选，其在成本和执行时间方面耗费人力且昂贵，需要高度专业化的人员和细胞的遗传修饰。

然而，现有技术代表了细胞选择的两极：极特异意味着低的细胞回收，而非特异则意味着细胞表征的缺乏。

关于生物材料的分级与选择，由于细胞操作、缺乏对通过去除技术离析的细胞群体组成的保证、不可能分离由多个群体构成的复合体或原始样品等，分离/富集的问题仍待解决。在附着条件下生长的生物材料的分离/富集甚至更加成问题，例如多能干细胞的样品，特别是人多能干细胞的样品，例如是通过相对简单的方法(其并不涉及细胞的改变或对其造成负担，不太贵，也由具备普通专业技能的实验人员来操作)的间充质干细胞。重要的是要提醒，最小限度的操作对于将物质或颗粒用于任何与科学研究目的不同的应用的重复使用至关重要。

关于罕见群体如干细胞和癌细胞，已评价了将细胞从不同组织分离的替代技术；特别是场流分级法(下文中，FFF为场流分级的缩写)，其能够仅基于包括复杂群体中被分析物的形态学和特有的生物物理特性在内的物理差异来区分不同的细胞群和相关的亚群(Reschiglian等，TRENDS in Biotechnology Vol.23No.9，2005年9月)。由于这些技术，变得可以简化样品并得到残留在最小限度操作标准品中的目标细胞。

这些技术和方法包括维持经处理的细胞样品相对于初始样品不改变且不增加辅助性质或除去原有性质的程序。我们指的是以下技术：FFF(场流分级)、Gr-FFF(重力场流分级)、Sd-FFF(沉降场流分级)、FDF(双向电泳FFF)、和离心等。

在动态流体条件下，特别是属于FFF的那些，可比较的分离技术提供将活细胞添加到生理盐水缓冲液的悬液中制备的细胞级分的分级方法。接着将样品引入分级装置内部。引入和分离可以在连续流和包括注射器的注射体系的情况下发生，由此样品可以引入到分级用毛细管通道中。

接着将样品通过装置分离或分级、或者为了研究调查而观察从初始样品中离析的单颗粒或颗粒的组的行为。分离可以在静态或动态条件下进行。在动态情况下，在存在或不存在与装置本身接触下泵送连续流并执行来自该装置的洗脱机构；在静态情况下，将细胞保持在特定的位置来观察对细胞所生活的流体的条件和组成方面改变所施加的条件变化的响应。动态分离的方法可以防止待分析/分离的物质在装置物理组件上固定，避免与之接触。然后收集含有在穿过分级装置的过程中分离的不同群体中的不同细胞类型的级分。可选地，一旦研究完成、或出于细胞衰老和存活力等原因，细胞样品被废弃。

属于场流分级技术的一些方法用于从细菌群到上皮细胞的生物样品的分离，但是通过实施现有技术公开的方法和装置实现的结果显示出若干缺点。因地球重力场而在动态流分离条件下运行的技术特别明显，因为它们是在其他可用于分离目的的技术中最简单且更便宜的技术。

这些技术使用在图14中详细说明的的分级装置。分级元件1100包括通道1122，在该通道中能够通过注入口1102沿分级装置内部的流动方向引入纵向流(由箭头指出)。该装置通常受到例如重力等的相对于流动方向垂直作用的力场。

在通道1122中，由于层流，装置内部的物质的输送流(流动相)的横向流速分布是抛物线形的。对于纵向流速的分布也是一样的。因此，注入分级装置的细胞以与洗脱流体相同的流动分布运行。随着侧壁附近的流动速度降低而导致趋近于零，并且在侧壁的表面上为零，这不可避免地涉及分级装置的侧壁附近的细胞固定。这意味着细胞样品的损失是由于细胞的固定，其速度等于零，并沉积在分级通道的壁处。对于倾向于附着到诸如装置的壁的固体支持物的附着干细胞的分级，样品损失是明显的。

本发明的目的是提供一种在动态条件下进行分级和离析的装置，其相对于现有仪器技术克服了关于维持效力、易于使用和便宜等的问题，并且与此同时，能够将减少固定、细胞回收、活力和样品操作方面的缺点最小化。换句话说，本发明的目的是提供一种装置，其允许克服或至少减少在分级通道壁上分离的物质的固定，确保洗脱材料回收的改善。该装置属于用于高回收细胞分离和/或高纯度的群体或亚群离析的装置，遵循涉及“扩展”临床/医疗手术装置导纳(admittance)的最小操作技术类别。

本发明的另一个目的是提供一种用于在流体动态条件下分散流体中的物质的分级方法，允许在不同容器中收集洗脱的物质级分，从而离析含有目标物质的级分并避免注入装置中的损失细胞材料的风险。

发明内容

通过独立方案来解决本发明的主题。本发明的有利实施方式是从属方案的目的。

特别地，本发明涉及用于分散流体中的弥散相的动态分级的装置。弥散相可以包括物质和颗粒或颗粒的组，优选地包括微小尺寸的如细胞、分子、颗粒等的物质和颗粒或颗粒的组。该装置包括分级通道和串联的第一注入口至第三注入口。通过第一注入口，能够将第一限制流体(confining fluid)注入通道，而通过第二注入口，能够将第二限制流体注入通道。通过第三注入口能够将用于输送弥散相的洗脱流体注入通道。第三注入口配置在第一注入口与第二注入口之间。分级通道的第一部分包括分别与第一注入口至第三注入口对应的第一终端部至第三终端部。其中，第一终端部(251)至第三终端部(241)具有如下大小：使得第一限制流体和第二限制流体分别具有第一预定流量和第二预定流量，洗脱流体能够具有第三预定流量，第三预定流量大于第一流量和第二流量，以便将洗脱流体限制在第一限制流体与第二限制流体之间。将通过第一口至第三口引入分级通道的流体定义为分级通道中的流动相。

有利地，第一部分至第三部分可以具有允许将通过对应的口引入的流体发展成与通道的长度方向轴线平行流动的层流的几何结构。例如，端部可以具有弧形或尖头形或V字形轮廓。可选地，端部1至3能够为多边形。第一注入口至第三注入口能够分别布置在终端部附近，其中与洗脱流体的注入口对应的端部比与第一限制流体和第二限制流体的可以彼此有利地相同的注入口对应的终端部宽。

本发明的另一目的是用于分散流体中的物质的分级的方法，该方法包括通过第一注入口将第一限制流体注入分级通道，通过第二注入口将第二限制流体注入分级通道。分别以第一预定流量和第二预定流量供给第一限制流体和第二限制流体。该方法还包括通过在第一注入口与第二注入口之间配置的第三注入口注入用于供给流动相的洗脱流体。洗脱流体具有大于第一预定流量和第二预定流量的第三预定流量，以便将洗脱流体限制在第一限制流体与第二限制流体之间。

有利地，第一限制流体的第一预定流量和第二限制流体的第二预定流量能够在洗脱流体的第三预定流量的从5％至25％的范围，优选地为第三预定流量的10％。

将在以下参照附图作为示例性而非限制性说明的一些实施结构的详细说明中指出根据本发明的分级方法和装置的进一步优点和特征，其中：

附图说明

图1示出了根据本发明一个实施方式或实施图的分级装置的细节的俯视图；

图2示出了根据本发明的分级装置的细节；

图3示出了处于分解形态的图2的装置；

图4是图1至图3的装置的组成部件的俯视平面图；

图5是根据本发明第二实施方式的装置的细节的立体图；

图6是图5的装置的分解立体图；

图7的(A)和图7的(B)分别代表实施根据本发明的方法和背景技术部分的方法的装置中的流体的长度方向速度场分布和总流的长度方向分布之间的比较的图表。

图8的(A)和图8的(B)是通过有限元方法(FEM)模拟获得的图，其代表了注入根据本发明的装置的总细胞样品流的表面趋势以及与根据背景技术部分的装置中的总样品流进行比较；

图9的(A)和图9的(B)代表根据本发明的分级装置内部的通过FEM模拟获得的总流的趋势的矢量表示(图9的(B))，用于与根据背景技术部分的装置中的流的趋势(图9的(A))进行比较；

图10的(A)和图10的(B)是代表根据本发明的分级装置中的输送流体(流动相)的总表面速度场的趋势(图10的(B))、用于与背景技术部分的装置中的速度的趋势(图10的(A))进行比较的图；

图11的(A)和图11的(B)代表根据本发明的分级装置中的输送流体(流动相)的总速度矢量场的趋势(图10的(B))，用于与背景技术部分的装置中的速度的趋势(图11的(A))进行比较；

图12的(A)和图12的(B)代表利用在背景技术部分已知的装置和利用根据本发明的装置的被洗脱样品的检测图表；

图13的(A)和图13的(B)是代表分别在背景技术部分的装置中的和在根据本发明的装置中的、靠近布置有被洗脱级分的收集口的端的细胞分布的照片；

图14示意性地示出了从现有技术已知的分级装置的细节。

具体实施方式

以下段落说明本发明的各种代表性实施方式。例如，为了便于理解，将参照生物材料、特别是细胞的分级来说明根据本发明的分级装置。必须注意的是，参照以下不同实施方式说明的方案还能够用于不同类型的如下样品的分析和分离：诸如包括在数微米与数百微米之间的适当尺寸的有机和无机颗粒等，例如聚合物颗粒、球状或层状矿物质颗粒、碳颗粒、二氧化硅颗粒、用于给药的颗粒、血清和悬浮细胞、细菌群落、脂质体囊泡。

说明书和技术方案中使用的术语分级通道表示在根据本发明的装置的分级元件中获得的凹部，流体能够从与分级元件的第一端对应地配置的注入口流过该凹部的内部、流向与分级元件的和第一端相反的第二端对应地定位的提取点。分级通道能够为毛细管通道。

术语毛细管用于表示大小在至少一个维度上允许在分级通道内部产生层流的通道。毛细管分级通道能够具有不满足毛细管的定义的长度和宽度，而具有满足该定义的厚度，以获得层流。

术语分级通道意味着在至少一个维度上满足前段中的定义的毛细管通道。

术语侧带表示分级通道的与通道的侧壁相邻的部分，该部分遍及通道的长度地沿着侧壁延伸，并且具有与通道的侧壁垂直的大小，从这里起，在宽度方面不等于零来表示该大小。

术语物质是指进行分离处理的弥散相，也就是颗粒或一簇小尺寸的、优选为微小的有机或无机颗粒，诸如聚合物颗粒、球状或层状矿物质、炭颗粒、二氧化硅颗粒、用于给药的颗粒、血清和悬浮细胞、细菌群落、脂质体囊泡等。

术语弥散相是指物理状态与分散相的物理状态不同的成分。分散相是弥散相均匀分布、但不混溶的成分。例如，在颗粒或细胞的情况下，弥散相或细胞弥散可以是固体颗粒弥散(固相)均匀地分散在液体(分散液)中。在这种情况下，因为这两相处于不同的物理状态且不混溶(固体和液体)，所以可以称作固/液弥散。

本发明基于如下观察：在背景技术部分已知的且使用场流分级原理的分级装置具有待分析或待分离的样品的不可忽略的级分会附着到分级通道壁的缺点。通过传统分级装置分离微小材料的方法，可能会损失大约40％的样品。这归因于如下事实：样品注入分级通道的洗脱流体具有层流，并且流速分布是抛物线形的，其中最大速度在通道的中央处，而在通道的侧壁附近为零。进入洗脱流体的所有物质在通道的壁附近的速度均为零，并且倾向于附着到通道的侧壁。在背景技术部分已知的一些装置的另一问题是当流动相停止时，或者换言之，在无流动相的情况下，将样品注入通道，在刚注入样品之后流动相再次开始。还在这种情况下，注入通道的样品级分会附着到通道底壁，并且不会被朝向作为样品收集口的出口运送。另外，通道的侧壁附近的物质以为零的速度悬浮在洗脱流体中的事实允许这些物质与侧壁接触，从而导致这些物质以这种方式损失，因此会降低分级装置的效率。如果待分离的物质包括那些较容易附着到壁的二氧化硅颗粒、聚合物颗粒、或者诸如生物群落、细胞(特别是上皮细胞或贴壁干细胞)等的生物材料，则该问题是显著的。

根据本发明的装置基于如下确认：对于装置的最终性能，洗脱流体的在分级装置的长度方向轴线的垂向上的流分布具有不可忽略的作用。在这种情况下，通道的长度方向轴线被识别成诸如始终沿着一个方向从通道的注入口向收集口延伸的轴线等。特别地，本发明基于如下观察：进入分离通道的最优洗脱流在理想情况下可以有利地具有实质上为阶梯波或方形波分布。实际上，在与通道的长度方向轴线垂直的定向上的中央的前方不为零、在分级通道的位于侧壁附近的侧带处为零的洗脱流分布会减少样品附着到通道的侧壁，从而以这种方式确保了装置的效率的重大提高。优选地，侧带的宽度在通道的总宽度的从10％和25％的范围中。

图1示出了根据本发明的如上所述地允许洗脱流体流的分级装置的细节。图11的(B)示出了进入通道221的流体速度趋势。

特别地，图1示出了分级元件200的平面图，从该平面图获得分级通道221。分级元件200包括第一流体注入口321和第二流体主入口321，分级元件200的实施将参照图2所示的实施形式的说明进行说明。以下还用术语第一侧口和第二侧口称呼第一注入口和第二注入口。通过第一注入口321，能够将第一限制流体注入通道，同时通过第二注入口321，能够将第二限制流体注入通道。可以通过以下还称作中央口的第三注入口311将用于供给流动相(mobile phase)的洗脱流体注入通道221。第三注入口311配置在第一注入口321和第二注入口321之间。通道221的第一端部包括分别与第一注入口321至第三注入口311对应地配置的第一终端部251至第三终端部241。构造有第一终端部至第三终端部，并且第一终端部至第三终端部具有诸如使三股不同的流进入分级通道221的几何结构。特别地，第一限制流体和第二限制流体分别构成两股侧流，这两股侧流可以分别具有第一预定流量和第二预定流量。通过第三注入口注入的洗脱流体限定可以具有第三预定流量的中央流。

第三预定流量比第一预定流量和第二预定流量高，以便使洗脱流体限制在第一限制流体与第二限制流体之间。另外，优先建立具有比洗脱流体的流量低的流量的限制流允许中央流具有允许执行样品场流分级的宽度，从而避免了样品的一部分与分级通道的侧壁接触。通道几何结构的选择、特别是终端部241、251的选择允许以有效的方式应用场流分级法。终端部241、251的如下几何结构和位置的选择将不允许样品的材料分离：使得产生沿着分级通道的长度方向轴线始终集中在数微米带、特别是集中在例如小于100微米的洗脱流体流。

通过第一注入口和第二注入口注入的流在注入步骤期间和分离步骤期间用作限制成分或用作样品的流体引导物。该构造防止了细胞损失和导致分离效率降低的洗脱流的带变宽。有利地，第一限制流和第二限制流可以彼此平行，并且可以与洗脱流体流或中央流平行。为了获得流体引导物，可以将第一终端部251至第三终端部241构造和配置成使得它们各自的长度方向轴线彼此平行并且与分级通道221的长度方向轴线平行。该构造允许容易且精确地产生彼此平行的层流，使得洗脱流体与第一限制流体和第二限制流体的流平行地在通道的中央流动。

在本发明的有利形式中，与第三注入口311对应的以下还用术语中央终端部称呼的第三终端部241的基部大于分别与第一注入口321和第二注入口321对应地配置的第一终端部251和第二终端部251(以下还用术语第一侧终端部和第二侧终端部称呼)的基部。在根据本发明的分级通道221的构造中，终端部的基部是各终端部241、251的连接到分级通道221的部分。以下将用术语点终端部传统地称呼终端部241、251的与基部相反的部分。

在上述构造的另一发展中，第一终端部和第二终端部的基部宽度可以具有直到第三终端部的基部宽度的50％的值。第一终端部251和第二终端部251的基部宽度可以被选择成确保中央流距分级通道221的侧壁的预定距离不为零(not null)，例如在第三终端部的基部宽度的从25％至50％的范围中。

在本发明的图示实现中，侧流可以具有0.1ml/min的流量，并且可以与具有1ml/min的流量的中央流平行。更具体地，可以选择第三终端部241的几何结构和大小，以便获得如下宽度的洗脱流体流(中央流)：在该宽度下，获得了细胞样品沿着分级通道221的宽度的分布始终等于通道221的总宽度的近似一半。第一终端部251和第二终端部251可以具有如下几何结构和形状：使得在中央通道两侧产生宽度在通道221的总宽度的从10％至25％的范围中的侧通道。通过第一限制流体和第二限制流体的流产生侧通道。以这种方式，中央通道被配置成距分级通道221的侧壁预定距离，该预定距离与在通道221的总宽度的从10％至25％的范围中的值对应。

有利地，第一终端部251至第三终端部241可以是弧形。根据本发明，术语“弧形”是大致的。因此，终端部可以具有符合弧形轮廓的任意轮廓。这些轮廓为例如尖头形(cusp-shaped)、V字形或U字形、或者半圆形或多边形轮廓。

尽管与所建议的流量组合的上述构造在细胞分离和细胞回收方面显示出了良好的结果，但是中央通道和侧通道的大小以及限制流体和洗脱流体的流量可以具有与以上表明的值不同的值。这些值取决于分级装置的用途和注入该装置的样品的性质。在分离生物材料的应用中，能够将中央流量选择在0.5毫升每分钟至3毫升每分钟的范围中，并且合理地，中央流量能够随着分级装置的大小而增大，其中该大小能够在如下范围中：宽度为从4毫米至6毫米，长度为从20毫米至40毫米，厚度为从0.1毫米至0.7毫米。另外，终端部241、251能够具有与以上解释的轮廓不同的轮廓。例如，在不意味着本发明的不同构思的情况下，终端部241、251可以具有多边形轮廓。

根据图1所述的构造，可以在将洗脱流体注入分级通道221之前，通过第三注入口将样品注入分级通道。在这种情况下，样品置于分级通道221的底面，并且沿着分级通道221始终被洗脱流体洗脱。

图1所述的分级装置200不限于关于上述样品注入的方法。有利地，分级装置200可以包括通过隔膜(图1中未示出)实现的样品注入口，用于将作为悬浮物质的样品注入必须通过分级通道221分级的流体。配置样品注入口，以便允许例如将物质与分级通道221的平面垂直地注入洗脱流体的流。更具体地，配置样品注入口，以便通过分级通道的平面中的流注入样品。在根据本发明的实施形式中，隔膜可以与第三注入口311对准地配置，有利地，可以配置在由洗脱流体的流限定的中央通道的中央。

通过穿过隔膜的注入，将样品注入流动中的洗脱流体，以这种方式，注入通道221的物质不会附着到通道221的底面。归功于与洗脱流体平行地流动的限制流体，通过侧流体将被注入的遍及分级通道221的整个长度地扩展到分级通道221的物质限制在中央通道中，使得注入通道221的物质不附着到分级通道221的侧壁。

根据本发明的分级装置还包括至少一个流控制构件441，流控制构件441与第一注入口321至第三注入口311流体连接。流控制构件441允许控制通过第三注入口311注入的洗脱流体的流，用于使洗脱流体具有第三预定流量。流控制构件还与第一注入口321和第二注入口321流体连接，用于控制分别通过第一注入口321和第二注入口321注入分级通道211的第一限制流体和第二限制流体的流。流控制构件441允许控制第一限制流体和第二限制流体的流，以使第一限制流体和第二限制流体具有第一预定流量和第二预定流量，其中第一预定流量和第二预定流量比第三预定流量低。在本发明所披露的情况中，第一预定流量和第二预定流量具有相同的值。可选地，第一预定流量和第二预定流量能够具有不同的值。

在根据本发明的特定产品形式中，流控制构件441包括通过分离流体通道来对洗脱口311、321进行洗脱的一个泵送系统(未示出)，该泵送系统例如是蠕动泵、注射泵、隔膜泵、HPLC泵等。在这种情况下，能够通过配置在位于泵和其对应的洗脱口之间的流体装置中的对应的阀控制各第一预定流量至第三预定流量。以上列出的泵仅是示例性的，而非限制性的。特别地，在具有与以上列出的泵相同的效力的情况下，可以使用控制进入根据本发明的分级通道的流体的流的各种泵。

在根据本发明的不同产品中，流控制构件441包括与第一注入口321和第二注入口321流体连接的第一泵和第二泵(未示出)，以及与第三注入口311流体连接的第三泵(未示出)。在这种情况下，可以独立地控制第一泵至第三泵，以便产生分别具有第一预定流量和第二预定流量的第一限制流体和第二限制流体，以及具有第三预定流量的洗脱流体。

显然地，本领域技术人员可以想到流控制构件的其它构造。例如，在第一限制流体和第二限制流体具有相同流量的情况下，如果第一注入流量和第二注入流量具有相同的值，则流控制构件可以包括用于给送第一限制流体和第二限制流体的第一泵，以及用于给送洗脱流体的第二泵。根据该不同的构造，分级装置的设计和产品形式是较容易且较便宜的。

在图2中，根据本发明的作为参照图1表述的概念的产品的产品形式，示出了分级装置的细节。

分级装置200的有利实施形式包括至少三层塑料材料，包括：至少一层底层101，其用作分级装置的积聚壁，并且最终设置有被洗脱物的收集口；一层中间层，其用于固定毛细管通道的侧壁外形；以及一层顶层301，其中配置有流动相和细胞样品的注入口，并且最终配置有被洗脱物的收集口。

塑料材料层以可去除或永久的方式彼此配合；制成层的材料考虑到装置的重复使用的可能性以及一次性使用的可能性两者。分级装置200包括通道221。通道进而包括底层或积聚壁101。积聚壁可以由例如聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚酯、聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯等的塑料材料制成。可选地，积聚壁101能够由如玻璃等的无机材料制成。玻璃比塑料材料更具极性，所以在装置用于分离诸如聚苯乙烯等的塑料颗粒的情况下，可以有利地使用该材料。该底层是这种类型的分级装置的积聚壁。底层101可以具有从5mm至15mm的范围的厚度，并且优选地，底层101为10mm厚。清楚地，这些是非限制性的值，并且清楚的是，本领域技术人员可以根据设计要求和分级装置的用途选择具有与所表明的厚度不同的厚度的底层。

分级装置200包括顶层或供给壁301，其中配置有分级通道的流动相的第三注入口或中央注入口311、流动相的第一注入口和第二注入口或侧注入口321。图2示出了根据图1所述的包括样品注入口331的分级装置的产品形式。

分级装置200还包括一个收集口341，用于收集被洗脱物。顶层301具有与底层101大致相同的特征；顶层301由厚度在从5mm至15mm的范围中的、优选为10mm的板构成。供给壁301可以由诸如聚氯乙烯或聚碳酸酯等的塑料材料制成。可选地，积聚壁可以由聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等制成。配置于顶层301的口具有大约5mm的截面，但是该截面是变化的，并且取决于与因不是本发明的主题而在这里未示出的注入通道、注入通道和收集通道的接合截面。与积聚壁101类似，以上表明的厚度和直径的值是非限制性的，并且清楚的是，本领域技术人员能够根据设计要求和分级装置的用途选择不同的供给壁厚度和具有与所表明的直径不同的直径的注入口。

在积聚壁101与供给壁之间存在一层中间层201，中间层201固定分级通道221的外周轮廓。能够通过适当的制造在中间层中获得毛细管通道的轮廓。中间层201和毛细管通道221可以参见在图3中绘出的分解图。中间层201可以由诸如聚苯二甲酸乙二醇酯等的塑料材料制成，并且具有在从0.2mm至0.5mm的范围中的、优选为0.25mm的厚度。分级通道211的外周轮廓包括：长度方向壁；尖顶(ogive)231，其与收集口341对应地配置；以及三个终端部241、251，其分别与注入口、或者中央注入口311和侧注入口321对应。在本文献所述的产品形式中，终端部是弧形的。第一终端部251和第二终端部251将还由术语侧终端部表示，同时第三终端部241将由术语中央终端部表示。毛细管通道的中央注入口311和侧注入口321引导到终端部241、251。

图4是图1至图3的装置的组成部件的俯视平面图。特别地，图4示出了中间层201的一部分的平面图。在图4所述的特定实施中，与第三终端部241对应的中央终端部在其基部宽度为2D，宽度2D为侧终端部241的宽度D的大致两倍。在图中，用虚线代表注入口331和流动相的注入口311和321。注入口331与中央注入口311配置在同一长度轴线上，并且配置在所述终端部的基线的正下方。特别地，注入口331可以有利地配置在通道的如下点处：在该点处，中央流和侧流排列起来且稳定。终端部241、251还被定向成使得它们的从各终端的基线的末梢向中间延伸的长度方向轴线与分级通道221的长度方向轴线平行，并且更普遍地，与分级装置200的长度方向轴线平行。该几何结构允许平行的层流。另外，通过将第一限制流体和第二限制流体注入分别与第一终端部251和第二终端部251对应的第一注入口321和第二注入口321而产生的流具有比通过第三注入口311注入第三终端部241以及分级通道221的洗脱流体的注入流量低的注入流量。以这种方式，洗脱流体流入中央通道，洗脱流体限制在第一限制流体与第二限制流体之间且具有允许正确的样品分离的宽度。

在图5中，示出了根据本发明的提供了存在能够并行独立工作的多条分级通道212、222的分级装置的第二产品形式。图5示出了包括两条分级通道的分级装置400。总之，意味着本发明不限于该构造，并且意味着分级装置还能够包括多于两条的分级通道。为了简化，将参照具有两条分级通道212、222的分级装置说明多条通道构造。多层分级装置400包括：底层102；中间层202，两条毛细管通道的外周轮廓被制造在中间层202中，图5示出了这两条毛细管通道，并且将稍后对它们进行更好地说明；以及顶层或注入壁302。顶层302配置在中间层202上，并且被分成其它三层底基层(underlayer)，分别为与中间层接触的第一底基层312、配置在第一底基层312上且与第一底基层312接触的第二底基层322以及配置在第二底基层322上且与第二底基层322接触的第三底基层332；第三底基层332包括用于给送限制流体342的限制口和用于给送洗脱流体的洗脱口352。第三底基层还包括用于将待分离的样品注入分级通道的样品注入口362和用于样品输出收集的口112。该构造不必被视作是限制性的，而是意味着输入和输出口可以配置在装置的与上述层不同的层中。例如，用于样品输出收集的口112可以可选地配置于底层102。

在图6中，通过分解立体的方式示出了形成多层毛细管通道400的不同的层和底基层。底层102与稍早说明的毛细管通道200的底层类似地由塑料材料制成。

中间层202是塑料材料层、优选具有与对毛细管通道200说明的中间层相同的特征，其中通过收集管道232使两条通道212和222的外周轮廓连接到第一端部。分级管道212和222可以具有例如与稍早说明的毛细管通道400相同的外周轮廓。

顶层302包括先前提及的底基层；第一底基层312包括：用于分级通道的各一个中央注入口372，其用于洗脱流体注入；用于毛细管通道的各两个侧注入口382；口392，其用于待洗脱的样品的注入；以及样品输出口。该底基层优选由聚氯乙烯、聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯制成，其具有例如从1mm至5mm的范围中的厚度，优选具有3mm的厚度。

第二底基层322由例如PET或PETG或具有相似性能的材料制成，其具有例如从0.2mm至0.7mm的范围中的厚度，优选具有0.5mm的厚度。在该底基层中，制造有第一底基层312的侧注入口382的注入管道402、中央注入口372的注入管道412、样品注入口392的注入管道422以及口112的注入管道232。

第三底基层332由聚氯乙烯、聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯制成，并且具有从1mm至5mm的范围中的厚度，优选具有3mm的厚度。在该底基层中，制造有如稍早说明的顶注入孔342、352、362和112。

通过以下说明，根据本发明的分级装置的操作和实施细胞材料分级的方法会变得明显。如已经解释过地，从背景技术部分已知的分级方法的一个缺点与输送流体的长度方向速度相关，该长度方向速度为从中央至侧壁的抛物线形递减。与该缺点部分相关的另一问题是细胞倾向于首先集中在通道的中央部，随后细胞沿着洗脱通道的整个前部扩展。由于细胞材料输送流体的速度在侧壁附近趋近于零，所以细胞可能会减速，从而使分级效率和细胞回收恶化。代替地，本发明使得样品不接触毛细管通道的所有壁，从而使该装置完全地响应于最少操纵规则。

为了改善分级装置的性能，根据本发明的方法建议通过用于对分级通道212和222进行供给的几乎两种不同且独立的流量来将流动相加入分级通道，以便在各分级通道中均具有输送弥散相的与通道的长度方向轴线对应的中央流，以及与分级通道的侧壁对应的两股侧流或限制流。相对于中央流具有较低流量的第一侧流和第二侧流防止样品中的一部分、如细胞或生物材料附着到侧壁，并且同时遍及分级通道的长度地将被洗脱样品限制在中央通道。在根据本发明的分级装置的构造中，通道中央部、即洗脱流体的流动相流量在从0.5ml/min至1.5ml/min的范围中，优选为大约0.8ml/min-1.0ml/min；通道的侧部处的第一限制流和第二限制流的流量在中央部流量的5％至15％的范围中，优选为该流量的10％。

沿着根据本发明的分级通道的侧壁始终存在第一限制流和第二限制流，改变了与分级通道的抛物线形长度方向速度相关的运行条件，从而将“流动”侧壁发展成分级通道。

另外，通过刚好配置在流动相注入的下游的注入口将预计要分级的样品注入流动相的流；该措施允许较好地限制所注入的细胞材料。

已经按照根据本发明的方法的工作步骤测试了分级装置；将葡萄糖注入装置，已经完成了初步测试。如能够从图7的(A)、图7的(B)的图表观察到地，FEM模拟的结果清楚地示出了两种装置的不同运行。在图表中，(图7的(A))长度方向速度的变化曲线和(图7的(B))总流的变化曲线与位于通道的前方、而非位于通道的宽度的位置相关。对于模拟，已经为两装置选择了1ml/min的流动相流量和40.0mm的总分级通道宽度。这些值是象征性的，并且清楚的是，具有不同大小和不同流量的通道与本发明兼容。更普遍地，能够使用如下分级通道221、212、222实现本发明：这些分级通道使得产生层流，并且遵守上述侧流的流量与中央流的流量之间的比。

如果长度方向速度场分布(参见图7的(A))的差异与根据本发明(虚线)和背景技术部分(连续线)的通道的不同趋势确切相关，则总长度方向流分布(参见图7的(B))的变化特别显著。事实上，流在距侧壁预定距离处呈现为大致减小到零，因此显示出较好的通过根据本发明的装置限制待洗脱的样品的能力。

通过作为结果给出表流的趋势和所注入的细胞样品的速度场的有限元模拟(FEM)来证实该结果，在与以上相同的条件下对该结果进行计算；这些模拟显示，如应用图8至图11所示的图表以递色的方式所呈现的，越是确切地宣称进入根据本发明的装置的总样品流和输送流体的速度场，随着速度场(图10的(A)和图10的(B))和总流(图8的(A)和图8的(B))的分别增大递色越浓，从而确认了被洗脱样品的集中越高。特别地，图8的(A)示出了传统分级通道中的总流的趋势。该图示出了传统分级通道中的流如何向分级通道的侧壁延伸，以及如何朝向通道侧壁运送待分离的样品的一部分。图8的(B)示出了根据本发明的分级通道中的总流。从进入根据本发明的分级通道的总流趋势，清楚地表明进入分级通道的洗脱流或中央流的集中。洗脱流被限制在分级通道的中央、限制在距分级通道的侧壁预定距离处。因此，所注入样品的材料通过中央流维持在距通道壁一定距离处，并且以这种方式避免了该材料附着到侧壁。图9的(A)和图9的(B)示出了如参照图8的(A)和图8的(B)所述的流的矢量形式的趋势。

图10的(A)示出了传统分级通道中的流速的趋势。沿着传统通道的横向速度的趋势始终是抛物线形的，并且速度在分级通道的侧壁附近为零。图10的(B)示出了进入根据本发明的分级通道的速度的趋势。在这种情况下，速度分布在通道的中央处实质上是恒定且平稳的，并且比侧通道所宣称的少。代替地，允许进行材料分离的横向速度场维持抛物线形，并且速度在积聚和注入壁处为零。图11的(A)和图11的(B)示出了如参照图10的(A)和图10的(B)说明的矢量形式的速度趋势。

对不同细胞材料执行了多次分级试验；图12的(A)示出了分别通过从背景技术部分已知的分级装置(连续线)和根据本发明的分级装置和方法(虚线)对两种干细胞进行分级的洗脱图表。

将来自牙髓的间充质干细胞(DP-MSC)样品注入这两装置；使用等渗PBS+BSA0.1％作为流动相。所注入的样品每100μL中含有300000个细胞。图表示出了吸光度(absorbance)相对于时间的函数。

实验结果强调了在如下条件下使用根据本发明的装置能够获得较好的分离性能和较高的细胞回收：

-相同容积的分离通道(标准形状为4cm/流体轨为4cm)；

-用于分离的相同流体流量(分离流为0.8ml/min，不包括流体轨的流量)；

-注入相同的样品。

图12的(B)示出了类似的实验，其中分别通过根据背景技术部分的分级装置和方法(虚线)和根据本发明的分级装置和方法(连续线)对50μL的全部血液样品进行洗脱；流动相为生理盐水和BSA0.1％。

对于为了分离而需要“停流”步骤的种类而言，在回收、效率和灵敏度方面不存在任何显著差异。分离处理不受所采用的实验条件的影响；相反地，观察到了相对于与红血细胞(HRBC)的保留量(retention volume)对应的保留峰(retention peak)的原理高斯(theoretical Gaussian)的较好内聚力(cohesion)。

另外，图片是在背景技术部分已知的装置中的被洗脱级分收集口附近拍摄的，但是在该装置中，通过位于流动相的注入口下游的口来注入细胞材料，并且不具有根据本发明的侧流(图13的(A))和装置(图13的(B))。在根据背景技术部分的装置的情况下，尽管通过该注入口直接注入流动相的细胞较集中在两几何结构的入口处，但是这些细胞倾向于遍及截面地扩展和分布，并且与通道的壁接触。这样发生的原因是未限制样品，因此会在侧壁附近扩展。因为归功于侧流而使细胞被限制，所以根据本发明的装置不会发生该效应。

根据本发明的装置可以被生产成图1至图6所示那样。流动相311、321的注入口有利地配置在毛细管通道的远端附近。口延伸到终端部241、251的顶点，这使通道外周轮廓211的端被再分。这些终端部促进了进入通道的独立流动相注入流的建立，以便发展出上述的所谓的“流动壁”。

有利地，用于洗脱的样品注入口配置在根据本发明的毛细管通道的长度方向轴线上、终端部的基线附近。

图5和图6所示的多分级通道装置还特别适于处理具有大量物质、如在从1百万至2百万细胞的范围中的细胞的样品。

通过生产具有自身的流分布管道系统的多通道分级装置来给予用于该装置的溶液，以便供给配置在多通道2中的两个或更多个毛细管通道，其中仅具有一个流动相注入管道，并且类似地，仅具有一个被洗脱级分收集口。

构成顶层302的底基层312和322允许注入在中间层202中获得的以外周轮廓画出的两毛细管通道212、222的流动相和样品的注入流分流。以这种方式，所获得的多毛细管通道呈现为比根据背景技术部分的多通道装置紧凑、有效且可靠的产品形式。

多通道分级装置允许非常高的分级性能，并且基于与图1至图3所示的稍早说明的单毛细管通道相同的运行原理，意味着参照图1至图3所述的特征还兼容且适用于图5和图6所述的构造，反之亦然。例如，图1所述的控制构件400还能够被图2至图6所述的装置使用。以相同的方式，参照图5和图6所述的注入壁302还可以可选地用于分级装置200的注入壁301。

在结构上通过使用过的材料和制造来设计两装置，以便具有使用根据本发明的装置作为一次性用品的可能性。

本发明还涉及用于弥散相的动态分级的方法。根据参照图1至图13中的分级装置所述的分离处理的特征适用于根据本发明的方法，该方法包括：通过第一注入口将第一限制流体注入毛细管通道，通过第二注入口将第二限制流体注入毛细管通道。分别以第一预定流量和第二预定流量供给第一限制流体和第二限制流体。方法还包括通过配置在第一注入口与第二注入口之间的第三注入口注入洗脱流体，以便供给流动相。洗脱流体具有比第一预定流量和第二预定流量大的第三预定流量，以便将洗脱流体限制在第一限制流体与第二限制流体之间。

根据本发明的产品形式，方法包括如下步骤：

a)制备分散在流动相中的细胞材料样品；

b)通过生理盐水和生物相容性溶液(流动相)的连续流与包括差不多一个毛细管通道的适当分级装置的所处平面垂直地注入样品；

c)使样品洗脱液进入装置；

d)收集由已经从起始样品起被离析成群落或子群落的不同细胞种类构成的级分。

在样品注入步骤之后且在样品洗脱步骤之前，任选地，能够停止洗脱流体流。可选地，可以在无流动相停止流的情况下实施注入步骤和洗脱步骤，所以防止了与装置的积聚壁的接触相互作用。

以预定流量将流动相供给到分级装置的中央部，并且以比中央部的流量低的流量供给到所述分级装置的侧部附近。

根据本发明的方法，其中第一限制流体的第一注入流量和第二限制流体的第二注入流量可以在洗脱流体的第三预定流动相流量的从5％至25％的范围中选择。在有利的形式中，第一预定流量和第二预定流量为第三预定流量的10％。

通过根据分级条件和所注入样品的类型设定洗脱流体的流量和/或第一限制流体和第二限制流体的流量来实现根据本发明的方法。术语分级条件表示适于仪器运行且适于所注入物质的分级的所有组成部件参数。例如，流动相组合物(具有不同PH、盐度、离子强度、有无表面活性剂的水溶液或有机溶液)、洗脱流、侧流和注入流的流量和速度、一股或多股流停止一定时间、所注入样品的量和浓度、分析时间、系统准备和调理的步骤。

在上述方法和装置中，根据本发明，弥散相能够由生物材料、特别是细胞和/或干细胞构成。

参照图1至图4和图7至图13说明的装置和分级装置的特征与根据图5和图6所述的装置和分级装置兼容，并且能够在根据图5和图6所述的分级元件和装置中实施。更普遍地，根据参照任意图说明的实现形式所述的特征均能够在参照其余图说明的实现形式中实施。

Claims (11)

1.一种用于分散流体中的弥散相的动态分级的装置，所述装置包括：

分级通道(221、212、222)，

能够供第一限制流体注入所述分级通道的第一注入口(321)和能够供第二限制流体注入所述分级通道(221、212、222)的第二注入口(321)，

能够供用于输送所述弥散相的洗脱流体注入所述分级通道(221、212、222)的第三注入口(311)，所述第三注入口(311)配置在所述第一注入口(321)与所述第二注入口(321)之间，

其中，所述分级通道(221、212、222)的第一端部包括分别与所述第一注入口(321)至所述第三注入口(311)对应的第一终端部(251)至第三终端部(241)，并且

所述第一终端部(251)至所述第三终端部(241)具有如下大小：使得所述第一限制流体和所述第二限制流体分别具有第一预定流量和第二预定流量，所述洗脱流体具有第三预定流量，所述第三预定流量大于所述第一流量和所述第二流量，以便将所述洗脱流体限制在所述第一限制流体与所述第二限制流体之间，其特征在于：

分别与所述第一注入口(321)和所述第二注入口(321)对应的所述第一终端部(251)和所述第二终端部(251)的基部的宽度在与所述第三注入口(311)对应的所述第三终端部(241)的基部的宽度的25％至50％的范围。

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述第一终端部(251)至所述第三终端部(241)被构造成使得它们各自的长度方向轴线彼此平行且与所述分级通道(221、212、222)的长度方向轴线平行，使得所述洗脱流体能够与所述第一限制流体和所述第二限制流体平行地流动。

3.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述第一终端部(251)至所述第三终端部(241)是弧形的。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的装置，其特征在于，所述装置还包括用于将分散流体中的所述弥散相注入所述分级通道(221、212、222)的样品注入口(331)，所述样品注入口(331)被定位成允许所述弥散相注入所述分级通道(221、212、222)中的所述洗脱流体。

5.根据权利要求1至5中任一项所述的装置，其特征在于，所述装置还包括：

至少一个第一流控制构件(441)，其与所述第一注入口(321)至所述第三注入口(211)流体连接，并且用于将所述洗脱流体的流控制在所述第三预定流量；其中

至少一个第一流控制构件(441)还用于将所述第一限制流体的流控制在所述第一预定流量，将所述第二限制流体的流控制在所述第二预定流量。

6.一种用于分散流体中的弥散相的动态分级的方法，所述方法包括如下步骤：

通过第一注入口(321)将第一限制流体注入分级通道(221、212、222)，通过第二注入口(321)将第二限制流体注入所述分级通道(221、212、222)，分别以第一预定流量和第二预定流量供给所述第一限制流体和所述第二限制流体，

通过配置在所述第一注入口(321)与所述第二注入口(321)之间的第三注入口(311)将用于供给流动相的洗脱流体注入所述分级通道(221、212、222)，以第三预定流量供给所述洗脱流体，

其中，所述第三预定流量大于所述第一预定流量和所述第二预定流量，以便将所述洗脱流体限制在所述第一限制流体与所述第二限制流体之间，其特征在于：

所述第一限制流体的所述第一预定流量和所述第二限制流体的所述第二预定流量在所述洗脱流体的所述第三流量的5％至25％的范围。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将所述第一限制流体、所述第二限制流体和所述洗脱流体分别与所述分级通道(221、212、222)的第一端部的第一终端部(251)至第三终端部(241)对应地注入所述分级通道(221、212、222)。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述第一限制流体的所述第一预定流量和所述第二限制流体的所述第二预定流量为所述第三预定流量的10％。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：

制备分散流体中的弥散相的样品，

通过样品注入口(331)将制备的样品引入流经所述分级通道(221、212、222)的所述洗脱流体，

从所述分级通道(221、212、222)洗脱所述制备的样品，

在引入所述制备的样品的步骤之后且在洗脱所述制备的样品的步骤之前，任选地中断所述洗脱流体的流。

10.根据权利要求6至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：基于分级条件和/或所注入样品的类型设定所述洗脱流体的流量和/或所述第一限制流体和所述第二限制流体的流量。

11.根据权利要求6至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述弥散相包括生物材料，优选地包括细胞和/或干细胞。