CN107072972A - 用伊非曲班治疗心脏纤维化的组合物和方法 - Google Patents

用伊非曲班治疗心脏纤维化的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及治疗、预防和/或改善纤维化综合征(特别是心脏纤维化)的方法，其通过给药治疗有效量的伊非曲班或其药学上可接受的盐进行。

Description

用伊非曲班治疗心脏纤维化的组合物和方法
发明领域
本发明涉及血栓烷A2受体拮抗剂(例如伊非曲班)在治疗和/或预防哺乳动物(例如人)的纤维化中的用途，以及用于所述用途的药物组合物，其包含有效治疗和/或预防这些疾病的量的血栓烷A2受体拮抗剂(例如伊非曲班)。在某些实施方案中，所述纤维化是心脏纤维化。
发明背景
纤维化是在修复性或反应性过程中于器官或组织中过量纤维结缔组织的形成。这可以为反应性的、良性的或为病理状态，并在生理学上发挥沉积结缔组织的作用，这可消除器官或组织的体系结构和功能。纤维化可用于描述纤维组织的过度沉积的病理学状态，以及在愈合中结缔组织沉积的过程。尽管纤维组织的形成是正常的，并且纤维组织是体内器官或组织的正常组分，但是由纤维化条件造成的瘢痕形成可能消除器官或组织的体系结构。
例如，随着纤维化瘢痕组织替代被高血压损伤的心肌，心脏变得弹性更低且因而不太能完成它的工作。类似地，肺纤维化造成肺变僵硬并损害肺功能。纤维化生长可以增生和侵入健康的周围组织，甚至在原始损伤愈合以后也可以。在大多数情况下，纤维化是反应性过程，并且数种不同的因素可明显地调节导致组织纤维化的途径。这样的因素包括早期炎症应答、成纤维细胞细胞群体的局部增加、成纤维细胞的合成功能的调节以及胶原的生物合成和降解的改变的调节。其它因素包括附近组织的炎症或泛发的炎症性状态，伴有增加的循环介质。
纤维化包括特征在于组织损伤后纤维化物质(例如细胞外基质)的异常和/或过量蓄积的病理学状况。纤维增生性疾病是与血管疾病(诸如心脏病、脑疾病和外周血管病)有关以及与影响肺系统、肾系统、眼、心脏系统、肝系统、消化系统和皮肤的多种慢性疾病中的器官衰竭有关的发病率和死亡率的原因。
迄今为止，没有商购可得的有效治疗或预防纤维化疾病(特别是心脏纤维化)的疗法。大多数纤维化相关的病症的常规治疗经常涉及皮质类固醇(诸如泼尼松)和/或抑制身体的免疫系统的其它药物。当前治疗方案的目标是减少炎症和随后的瘢痕形成。对目前可用的治疗的应答是可变的，并且与这些治疗有关的毒性和副作用可为严重的。实际上，仅少数患者对单独的皮质类固醇有应答，并且经常将免疫抑制药物与皮质类固醇联合使用。
右心室(RV)衰竭是肺动脉高压(PAH)中死亡的主要原因，并且是其它形式的肺性高血压的显著发病率和死亡率的来源。血栓烷和F2异前列烷(isprostane)(其均为血栓烷/前列腺素类(prostainoid)(TP)受体的激动剂)的产生在增加负荷压力的病理学状态(诸如肺动脉高压)中增加。已将前列环素/血栓烷平衡与应激下的心脏保护效果关联，其可能通过冠状动脉的支持。尽管阿司匹林治疗可以减少血栓烷和前列腺素的产生，但是它也会抑制有益的前列环素产生，并且对异前列烷形成没有作用。
没有批准用于保留RV功能的疗法。F-系列和E-系列异前列烷在心力衰竭和PAH中增加，所述增加与疾病的严重性相关，并且可通过血栓烷/前列腺素类(TP)受体传递信号，其具有血管收缩至纤维化的效果。尽管治疗减轻肺动脉压，但RV功能的损失可进展。对慢性压力负荷过大的RV应答可以呈适应性形式和适应不良性形式，这经常决定临床结果。具有增加的蛋白合成的适应性心室肥大维持功能，而纤维化和心肌细胞肥大可造成心律失常和收缩功能障碍，并且适应不良性扩张与RV衰竭有关。因此，面对慢性负荷压力时促进适应性肥大的治疗策略可以保留心脏功能并改善结果。
随慢性压力负荷过大发生的细胞肥大和心肌纤维化的发展也与增加的氧化性应激和脂质过氧化作用有关。15-F2t异前列烷(8-isoPGF2α或8-isoF)是氧化性应激的常见生物标志物，并且其水平随心室扩张而增加，并且与心力衰竭的严重性相关联。除了是生物标志物外，表明8-isoF和其它异前列烷可在心肌病中发挥直接作用。已知F-系列和E-系列异前列烷通过血栓烷/前列腺素类(TP)受体传递信号，其具有血管收缩至纤维化的效果。环式内过氧化物(PGH2)和血栓烷A2(TxA2)的环加氧酶(COX)产物也是TP受体的配体，并且TP受体活化有助于慢性高血压模型中的心脏肥大，并在Gh过表达小鼠中降低心脏功能。TP受体不仅发现于血小板和血管中，而且也发现于右心室中，在PAH患者中此处的受体密度增加。
发明概述
本发明的一个目的是提供在哺乳动物(例如人)中预防和/或治疗纤维化和/或硬化的新方法。
本发明的一个目的是提供用于预防和/或治疗和/或减弱哺乳动物(例如人)中的心脏纤维化的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供用于减轻哺乳动物(例如人)中的心脏纤维化的效果的组合物和方法。
现已出乎预料地发现，用治疗有效量的血栓烷A2受体拮抗剂(例如伊非曲班)治疗哺乳动物可预防或减弱心脏纤维化和相关的后遗症。在某些实施方案中，在从炎症和纤维化至功能性生理性肥大的压力负荷过大的情况下，给药治疗有效量的血栓烷A2受体拮抗剂(例如伊非曲班)可预防或减弱心肌病和心力衰竭。
根据以上目的，本发明提供预防、逆转、改善或治疗纤维化的方法，其通过向需要其的患者给药治疗有效量的血栓烷A2受体拮抗剂(例如伊非曲班或其药学上可接受的盐(例如伊非曲班钠))来进行。
根据以上目的，本发明提供预防、逆转、改善或治疗心脏纤维化的方法，其通过向需要其的患者给药治疗有效量的血栓烷A2受体拮抗剂(例如伊非曲班)来进行。
在某些实施方案中，本发明涉及治疗和/或改善患者中的纤维化疾病或病况(特别是心脏纤维化)的方法，其包括向需要其的患者给药治疗有效量的血栓烷A2受体拮抗剂，以提供约0.1ng/ml至约100,000ng/ml的血栓烷A2受体拮抗剂(和/或它的活性代谢物)的期望血浆浓度。在某些实施方案中，所述治疗有效量的血栓烷A2受体拮抗剂提供约0.1ng/ml至约10,000ng/ml的血栓烷A2受体拮抗剂的期望血浆浓度。在一些实施方案中，上述血浆浓度是在稳态时的血浆浓度。在一些实施方案中，上述血浆浓度是最大血浆浓度(Cmax)。在某些优选的实施方案中，所述血栓烷A2受体拮抗剂是伊非曲班或其药学上可接受的盐，例如伊非曲班钠。
本发明还涉及向经历肺动脉高压的人患者提供心脏保护效果的方法，其通过给药如本文中所述的血栓烷A2受体拮抗剂来进行。
本发明进一步涉及改善人患者中右心对负荷应激的适应的方法，其通过给药如本文中所述的血栓烷A2受体拮抗剂来进行。
在某些实施方案中，所述血栓烷A2受体拮抗剂包含治疗有效量的[1S-(1α,2α,3α,4α)]-2-[[3-[4-[(戊基氨基)羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]甲基]苯丙酸(伊非曲班)及其药学上可接受的盐。
本发明进一步涉及治疗需要其治疗的哺乳动物中的心脏纤维化的方法，其包括向所述哺乳动物给药治疗有效量的[1S-(1α,2α,3α,4α)]-2-[[3-[4-[(戊基氨基)羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]甲基]苯丙酸(伊非曲班)或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，所述血栓烷A2受体拮抗剂包括治疗有效量的[1S-(1α,2α,3α,4α)]-2-[[3-[4-[(戊基氨基)羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]甲基]苯丙酸单钠盐(伊非曲班钠)。在某些优选的实施方案中，所述治疗有效量的伊非曲班降低所述哺乳动物中的纤维化组织的形成速率。在某些优选的实施方案中，所述哺乳动物是人患者。在某些优选的实施方案中，所述治疗有效量的伊非曲班减慢人患者中心肌纤维化的进展，和/或改善人患者中的运动能力，和/或减轻人患者中的RV纤维化，和/或减轻人患者中的心肌细胞肥大，和/或提供人患者中增加的E/A比率，和/或增加人患者中的心肌细胞直径，和/或改善或维持选自下列的功能：右心室射血分数(RVEF)、左心室射血分数(LVEF)、肺动力学、右心室收缩压(RVSP)、左心室收缩功能(LVSF)、右心室舒张功能(RVDF)和左心室舒张功能(LVDF)。
在某些优选的实施方案中，所述治疗有效量的伊非曲班针对压力负荷过大进行心脏保护，其通过使右心进展向适应而非适应不良性的纤维化、炎症和细胞肥大来进行。
在某些优选的实施方案中，所述治疗有效量的伊非曲班减弱人患者中的左心衰竭。
在上述方法和本文中描述的其它方法的任一种中，优选将伊非曲班以有效提供约1ng/ml至约100,000ng/ml的伊非曲班(和/或伊非曲班的活性代谢物)或约1ng/ml至约10,000ng/ml的伊非曲班本身的血浆浓度的量给药，并且在一些实施方案中，约1ng/ml至约1,000ng/ml。在一些实施方案中，上述血浆浓度是在稳态时的血浆浓度。在一些实施方案中，上述血浆浓度是最大血浆浓度(Cmax)。在某些其中哺乳动物是人患者的优选实施方案中，所述治疗有效量是约100mg/天至约2000mg/天，或者约10mg/天或约100mg/天至约1000mg/天，并且在某些实施方案中更优选约100mg/天至约500mg/天。所述每日剂量可以分开的剂量给药，或在一个推注或单位剂量中或在并行给药的多个剂量中给药。就该方面而言，可将伊非曲班口服给药、鼻内给药、直肠给药、阴道给药、舌下给药、含服给药、胃肠外给药或透皮给药。
本发明还涉及药物组合物，其包含血栓烷A2受体拮抗剂(例如伊非曲班或其药学上可接受的盐)，所述血栓烷A2受体拮抗剂为在需要其的哺乳动物中有效地改善或维持选自下列的功能的量：右心室射血分数(RVEF)、左心室射血分数(LVEF)、肺动力学、右心室收缩压(RVSP)、左心室收缩功能(LVSF)、右心室舒张功能(RVDF)和左心室舒张功能(LVDF)。在某些优选的实施方案中，所述伊非曲班盐是伊非曲班钠。
在某些优选的实施方案中，在上述药物组合物中，治疗有效量是约10mg至约1000mg伊非曲班(或其药学上可接受的盐)/天。在某些优选的实施方案中，所述治疗有效量是约100mg/天至约500mg/天。
本发明还涉及在需要其治疗的个体或患者中治疗纤维化(特别是心脏纤维化)的方法和组合物，所述方法包括向需要其的个体或患者给药治疗有效量的血栓烷A2受体拮抗剂。特别地，它涉及在需要这样的治疗的个体或患者中治疗或预防导致纤维化或硬化的病症的方法，其包括给药组合物，其包括向需要其的患者给药治疗有效量的血栓烷A2受体拮抗剂，所述量有效地降低纤维化或硬化的速率。本发明还提供在需要这样的治疗的个体或患者中预防纤维化或硬化的方法，其包括以有效减少在无这样的治疗存在下会发生的纤维化或硬化组织的形成的量给药包含血栓烷A2受体拮抗剂的组合物。
在某些实施方案中，所述纤维化与选自心脏纤维化、肾纤维化、肝纤维化、肺纤维化和系统性硬化病的纤维增生性疾病有关。
发明详述
根据上述目的，相信向需要其的个体或患者给药治疗有效量的血栓烷A2受体拮抗剂可预防和/或治疗纤维化(纤维化疾病或病况，并且特别是心脏纤维化)。
右心室无法适应负荷应激是肺动脉高压中死亡率的直接原因。血栓烷产生在增加负荷应激的病理学状态(诸如肺动脉高压)中增加，并已将前列环素/血栓烷平衡与应激下的心脏保护效果关联，其可能通过冠状动脉的支持。尽管阿司匹林治疗可以减少血栓烷和前列腺素的产生，但是它也会抑制有益的前列环素产生，并且更靶向的方法可能是需要的。
纤维化可以发生在体内的许多组织中，其通常作为炎症或损伤的结果，并且实例包括：肺纤维化(肺)；特发性肺纤维化(其中原因是未知的)；囊性纤维化；肝纤维化或肝硬化(肝)；心脏纤维化，包括心内膜心肌纤维化(心脏)、陈旧性心肌梗死(心脏)、心房纤维化(心脏)；以及其它纤维化病况，其包括但不限于纵隔纤维化(纵隔的软组织)、骨髓纤维化(骨髓)、腹膜后纤维化(腹膜后腔的软组织)、进行性块状纤维化(肺)；煤矿工人尘肺病的并发症、肾源性系统性纤维化(皮肤)、克罗恩氏病(肠)、瘢痕疙瘩(皮肤)、硬皮病/系统性硬化病(皮肤、肺)、关节纤维化(膝、肩、其它关节)和粘连性关节囊炎的一些形式(肩)。在过去使用的肺纤维化的多种类型的其它名称包括慢性间质性肺炎、肺间质特发性纤维化综合征、常见间质性肺炎(UIP)和弥漫性纤维化肺泡炎。
肺纤维化的症状包括呼吸短促、咳嗽和降低的运动耐量。症状的严重性和症状随时间的恶化可变化，并且至少部分地取决于纤维化的原因。
肝硬化是由长期损伤造成的肝中的广泛瘢痕形成(纤维化)。该损伤由炎症造成，所述炎症是对一些损伤(如慢性病毒感染或慢性酒精中毒)的正常应答。肝通过如下修复受损伤的区域：以与当个体在他们的身体上遭受切口时在愈合过程中瘢痕组织形成类似的方式，用瘢痕组织替代所述受损伤的区域。肝中的纤维化不同于周围健康的肝组织。不幸地是，由于瘢痕组织不能以正常肝细胞的形式发挥作用，过多的瘢痕组织干扰基本的肝功能。肝硬化具有许多原因，但是最常见的原因是酒精中毒和慢性肝炎。肝硬化的一些其它原因是肝和胆囊中阻塞的胆管、自身免疫性肝炎和遗传病(如肝豆状核变性或血色素沉着症)。
肝纤维化是响应于由连续的和重复的肝损伤造成的慢性肝病(CLD)而引发的瘢痕形成过程。CLD的晚期阶段特征在于肝体系结构的广泛重构和慢性器官衰竭，无论根本的疾病(例如肝硬化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、原发性硬化性胆管炎(PSC))是什么。
特发性肺纤维化(IPF)是肺纤维化的主要形式。IPF是以阻碍氧摄取的肺的进行性瘢痕形成为特征的使人虚弱的和危及生命的肺病。
系统性硬化病是退行性病症，其中过度纤维化在多个器官系统中发生，包括皮肤、血管、心脏、肺和肾。纤维化疾病的数种形式造成硬皮病患者的死亡，包括肺纤维化、充血性心力衰竭和肾纤维化；其中的每一种在约一半的系统性硬化病患者中发生。
纤维化也是器官移植排斥的主要原因。
短语“治疗有效量”是指以可适用于任何治疗的合理收益/风险比产生一些期望的局部或全身效果的物质的量。这样的物质的有效量根据被治疗的个体和疾病状况、个体的重量和年龄、疾病病况的严重性、给药方式等而变化，其可由本领域普通技术人员容易地确定。
如本文中使用的术语“血栓烷A2受体拮抗剂”是指在标准生物测定中或在体内或当以治疗有效剂量使用时，将血栓烷受体的表达或活性抑制至少或至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的化合物。在某些实施方案中，血栓烷A2受体拮抗剂抑制血栓烷A2与受体的结合。血栓烷A2受体拮抗剂包括竞争性拮抗剂(即与激动剂竞争受体的拮抗剂)和非竞争性拮抗剂。血栓烷A2受体拮抗剂包括针对所述受体的抗体。所述抗体可以是单克隆的。它们可以是人或人源化抗体。血栓烷A2受体拮抗剂还包括血栓烷合酶抑制剂，以及具有血栓烷A2受体拮抗剂活性和血栓烷合酶抑制剂活性的化合物。
血栓烷A2受体拮抗剂
大约30年来，血栓烷A2受体拮抗剂的发现和开发已经成为许多制药公司的目标(参见Dogne J-M等人,Exp.Opin.Ther.Patents 11:1663-1675(2001))。这些公司鉴定的某些单个化合物(具有或不具有伴随的血栓烷A2合酶抑制活性)包括伊非曲班(BMS)、利多格雷(Janssen)、特波格雷(BI)、UK-147535(Pfizer)、GR 32191(Glaxo)和S-18886(Servier)。临床前药理学已经确立，这类化合物具有通过血栓烷途径的抑制而得到的有效抗血栓形成活性。这些化合物还防止由血栓烷A2和其它前列腺素类(其作用于血管床内的血栓烷A2受体)诱导的血管收缩，并因而可有益地用于预防和/或治疗肝肾综合征和/或肝性脑病。
适合在本发明中使用的血栓烷A2受体拮抗剂可包括例如但不限于：小分子诸如伊非曲班(BMS；[1S-(1α,2α,3α,4α)]-2-[[3-[4-[(戊基氨基)羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]甲基]苯丙酸)，以及在第2009/0012115号美国专利申请公开(将其公开内容在此以其整体援引加入)中描述的其它。
适合在本文中使用的其它血栓烷A2受体拮抗剂还在第4,839,384(Ogletree)；5,066,480(Ogletree等人)；5,100,889(Misra等人)；5,312,818(Rubin等人)；5,399,725(Poss等人)和6,509,348(Ogletree)号美国专利中记载，将它们的公开内容在此以其整体援引加入。这些可包括但不限于如在第5,100,889号美国专利中公开的间插亚苯基(interphenylene)7-氧杂二环-庚基取代的杂环酰胺前列腺素类似物，其包括：
[1S-(1α,2α,3α,4α)]-2-[[3-[4-[[(4-环己基丁基)氨基]羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]甲基]苯丙酸(SQ 33,961)或者其酯或盐；
[1S-(1α,2α,3α,4α)]-2-[[3-[4-[[[(4-氯苯基)丁基]氨基]羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]甲基]苯丙酸或者其酯或盐；
[1S-(1α,2α,3α,4α)]-3-[[3-[4-[[(4-环己基丁基)氨基]羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]苯乙酸或者其酯或盐；
[1S-(1α,2α,3α,4α)]-[2-[[3-[4-[[(4-环己基丁基)氨基]羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]甲基]苯氧基]乙酸或者其酯或盐；
[1S-(1α,2α,3α,4α]-2-[[3-[4-[[(7,7-二甲基辛基)氨基]羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]甲基]苯丙酸或者其酯或盐。
如在第5,100,889号美国专利(1992年3月31日授权)中公开的7-氧杂二环庚基取代的杂环酰胺前列腺素类似物，其包括[1S-[1α,2α(Z),3α,4α)]-6-[3-[4-[[(4-环己基丁基)氨基]羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-4-己烯酸或者其酯或盐；
[1S-[1α,2α(Z),3α,4α)]]-6-[3-[4-[[(4-环己基丁基)氨基]羰基]-2-噻唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-4-己烯酸或者其酯或盐；
[1S-[1α,2α(Z),3α,4α)]]-6-[3-[4-[[(4-环己基丁基)甲基氨基]羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-4-己烯酸或者其酯或盐；
[1S-[1α,2α(Z),3α,4α)]]-6-[3-[4-[(1-吡咯烷基)羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-4-己烯酸或者其酯或盐；
[1S-[1α,2α(Z),3α,4α)]]-6-[3-[4-[(环己基氨基)羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基-4-己烯酸或者其酯或盐；
[1S-[1α,2α(Z),3α,4α)]]-6-[3-[4-[[(2-环己基乙基)氨基]羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-4-己烯酸或者其酯或盐；
[1S-[1α,2α(Z),3α,4α)]]-6-[3-[4-[[[2-(4-氯苯基)乙基]氨基]羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-4-己烯酸或者其酯或盐；
[1S-[1α,2α(Z),3α,4α)]-6-[3-[4-[[(4-氯苯基)氨基]羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-4-己烯酸或者其酯或盐；
[1S-[1α,2α(Z),3α,4α)]]-6-[3-[4-[[[4-(4-氯苯基)丁基]氨基]羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-4-己烯酸或者其酯或盐；
[1S-[11α,2α(Z),3α,4α)]]-6-[3-[4α-[[-(6-环己基-己基)氨基]羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-4-己烯酸或者其酯或盐；
[1S-[1α,2α(Z),3α,4α)]]-6-[3-[4-[[(6-环己基-己基)氨基]羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-4-己烯酸或者其酯或盐；
[1S-[1α,2α(Z),3α,4α]]-6-[3-[4-[(丙基氨基)羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-4-己烯酸或者其酯或盐；
[1S-[1α,2α(Z),3α,4α)]]-6-[3-[4-[[(4-丁基苯基)氨基]羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-4-己烯酸或者其酯或盐；
[1S-[1α,2α(Z),3α,4α)]]-6-[3-[4-[(2,3-二氢-1H-吲哚-1-基)羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-4-己烯酸或者其酯或盐；
[1S-[1α,2α(Z),3α,4α)]]-6-[3-[4-[[(4-环己基丁基)氨基]羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-N-(苯磺酰基)-4-己烯酰胺；
[1S-[11α,2α(Z),3α,4α)]]-6-[3-[4-[[(4-环己基丁基)氨基]羰基]-2-噁唑基]-N-(甲基磺酰基)-7-氧杂二环[2-.2.1]庚-2-基]-4-己烯酰胺；
[1S-[1α,2α(Z),3α,4α)]]-7-[3-[4-[[(4-环己基丁基)氨基]羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环(2.2.1]庚-2-基]-5-庚烯酸或者其酯或盐；
[1S-[1α,2α(Z),3α,4α)]]-6-[3-[4-[[(4-环己基丁基)氨基]羰基]-1H-咪唑-2-基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-4-己烯酸或者其酯或盐；
[1S-[1α,2α,3α,4α)]-6-[3-[4-[[(7,7-二甲基辛基)氨基]羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-4-己烯酸或者其酯或盐；
[1S-[1α,2α(E),3α,4α)]]-6-[3-[4-[[(4-环己基丁基)氨基]羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-4-己烯酸；
[1S-[1α,2α,3α,4α)]-3-[4-[[(4-(环己基丁基)氨基]羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2-己酸或者其酯或盐；
[1S-[1α,2α(Z),3α,4α)]]-6-[3-[4-[[(4-环己基丁基)氨基]羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-4-己烯酸或者其酯或盐；
如在Snitman等人的第4,537,981号美国专利(将其公开内容在此以其整体援引加入)中公开的7-氧杂二环庚烷和7-氧杂二环庚烯化合物，诸如[1S-(1α,2α(Z),3α(1E,3S*,4R*),4α)]]-7-[3-(3-羟基-4-苯基-1-戊烯基)-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-5-庚烯酸(SQ 29,548)；如在Nakane等人的第4,416,896号美国专利(将其公开内容在此以其整体援引加入)中公开的7-氧杂二环庚烷取代的氨基前列腺素类似物，诸如[1S-[1α,2α(Z),3α,4α)]]-7-[3-[[2-(苯基氨基)羰基]肼基]甲基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-5-庚烯酸；如在Nakane等人的第4,663,336号美国专利(将其公开内容在此以其整体援引加入)中公开的7-氧杂二环庚烷取代的二酰胺前列腺素类似物，例如[1S-[1α,2α(Z),3α,4α)]]-7-[3-[[[[(1-氧代庚基)氨基]乙酰基]氨基]甲基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-5-庚烯酸和相应的四唑，以及[1S-[1α,2α(Z),3α,4α)]]-7-[3-[[[[(4-环己基-1-氧代丁基)氨基]乙酰基]氨基]甲基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-5-庚烯酸；
如在第4,977,174号美国专利(将其公开内容在此以其整体援引加入)中公开的7-氧杂二环庚烷咪唑前列腺素类似物，诸如[1S-[1α,2α(Z),3α,4α)]]-6-[3-[[4-(4-环己基-1-羟基丁基)-1H-咪唑-1-基]甲基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-4-己烯酸或它的甲酯；
[1S-[1α,2α(Z),3α,4α)]]-6-[3-[[4-(3-环己基丙基)-1H-咪唑-1-基]甲基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-4-己烯酸或它的甲酯；
[1S-[1α.,2α(X(Z),3α,4α)]]-6-[3-[[4-(4-环己基-1-氧代丁基)-1H-咪唑-1-基]甲基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-4-己烯酸或它的甲酯；
[1S-[1α,2α(Z),3α,4α]]-6-[3-(1H-咪唑-1-基甲基)-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-4-己烯酸或它的甲酯；或者
[1S-[1α,2α(Z),3α,4α)]]-6-[3-[[4-[[(4-环己基丁基)氨基]羰基]-1H-咪唑-1-基]甲基-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]-4-己烯酸或它的甲酯；
在Witte等人的第4,258,058号美国专利(将其公开内容在此以其整体援引加入)中公开的苯氧基烷基羧酸，其包括4-[2-(苯磺酰氨基)乙基]苯氧基乙酸(BM 13,177-Boehringer Mannheim)，在Witte等人的第4,443,477号美国专利(将其公开内容在此以其整体援引加入)中公开的磺酰氨基苯基羧酸，其包括4-[2-(4-氯苯磺酰氨基)乙基]苯乙酸(BM 13,505,Boehringer Mannheim)，在第4,752,616号美国专利(将其公开内容在此以其整体援引加入)中公开的芳基硫基烷基苯基羧酸，其包括4-(3-((4-氯苯基)磺酰基)丙基)苯乙酸。
适合在本文中使用的血栓烷A2受体拮抗剂的其它实例包括但不限于伐哌前列素(其为优选实例)、(E)-5-[[[(吡啶基)]3-(三氟甲基)苯基]亚甲基]氨基]氧基]戊酸(也被称作R68,070-Janssen Research Laboratories)、3-[1-(4-氯苯基甲基)-5-氟-3-甲基吲哚-2-基]-2,2-二甲基丙酸[(L-655240Merck-Frosst)Eur.J.Pharmacol.135(2):193,87年3月17日]、5(Z)-7-([2,4,5-顺式]-4-(2-羟基苯基)-2-三氟甲基-1,3-二氧杂环己烷-5-基)庚烯酸(ICI 185282,Brit.J.Pharmacol.90(Proc.Suppl):228P-Abs,87年3月)、5(Z)-7-[2,2-二甲基-4-苯基-1,3-二氧杂环己烷-顺式-5-基]庚烯酸(ICI 159995,Brit.J.Pharmacol.86(Proc.Suppl):808P-Abs.,85年12月)、N,N'-双[7-(3-氯苯氨基-磺酰基)-1,2,3,4-四氢-异喹啉基]二磺酰基酰亚胺(SKF 88046,Pharmacologist25(3):116Abs.,117Abs,83年8月)、(1α(Z)-2β,5α]-(+)-7-[5-[[(1,1'-联苯)-4-基]-甲氧基]-2-(4-吗啉基)-3-氧代环戊基]-4-庚烯酸(AH 23848-Glaxo,Circulation 72(6):1208,85年12月)、左洛啡烷烯丙基溴(CM 32,191Sanofi,Life Sci.31(20-21):2261,82年11月15日)、(Z,2-内-3-氧代)-7-(3-乙酰基-2-二环[2.2.1]庚基-5-庚-3Z-烯酸、4-苯基-缩氨基硫脲(EP092-Univ.Edinburgh,Brit.J.Pharmacol.84(3):595,85年3月)；GR 32,191(伐哌前列素)-[1R-[1α(Z),2β,3β,5α]]-(+)-7-[5-([1,1'-联苯]-4-基甲氧基)-3-羟基-2-(1-哌啶基)环戊基]-4-庚烯酸；ICI 192,605-4(Z)-6-[(2,4,5-顺式)2-(2-氯苯基)-4-(2-羟基苯基)-1,3-二氧杂环己烷-5-基]己烯酸；BAY u 3405(雷马曲班)-3-[[(4-氟苯基)-磺酰基]氨基]-1,2,3,4-四氢-9H-咔唑-9-丙酸；或ONO 3708-7-[2α,4α-(二甲基桥亚甲基)-6β-(2-环戊基-2β-羟基乙酰氨基)-1α-环己基]-5(Z)-庚烯酸；(±)(5Z)-7-[3-内-((苯磺酰基)氨基]-二环[2.2.1]庚-2-外-基]庚烯酸(S-1452,Shionogi domitroban,)；(-)6,8-二氟-9-对甲基磺酰基苄基-1,2,3,4-四氢咔唑-1-基-乙酸(L670596,Merck)和(3-[l-(4-氯苄基)-5-氟-3-甲基吲哚-2-基]-2,2-二甲基丙酸(L655240,Merck)。
本发明优选的血栓烷A2受体拮抗剂是伊非曲班或其任意药学上可接受的盐。
在某些优选的实施方案中，优选的血栓烷A2受体拮抗剂是伊非曲班钠(化学上称作[1S-(1α,2α,3α,4α)]-2-[[3-[4-[(戊基氨基)羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]甲基]苯丙酸，单钠盐。
治疗方法
在本发明的某些实施方案中提供预防和/或治疗和/或改善患者或患者群体的一个或多个器官或组织中的纤维化的方法，其通过向需要其的患者给药治疗有效量的血栓烷A2受体拮抗剂来进行。
治疗有效量的血栓烷A2受体拮抗剂的给药可以通过任意治疗上有用的给药途径实现，其包括但不限于口服给药、鼻内给药、直肠给药、阴道给药、舌下给药、含服给药、胃肠外给药或透皮给药。在某些优选的实施方案中，将所述血栓烷A2受体拮抗剂胃肠外给药。在某些其它实施方案中，将所述血栓烷A2受体拮抗剂通过关节内注射给药。在某些其它实施方案中，将所述血栓烷A2受体拮抗剂直接给药至受影响的解剖学部位。在另一实施方案中，将所述血栓烷A2受体拮抗剂通过肝动脉给药。
在上述方法和本文中描述的其它方法的任一种中，优选以有效提供约1ng/ml至约100,000ng/ml或约0.1ng/ml的血栓烷A2受体拮抗剂(和/或其活性代谢物)的血浆浓度，或者1ng/ml至约10,000ng/ml伊非曲班本身的血浆浓度，并且在一些实施方案中约1ng/ml至约1,000ng/ml或更多(例如，在一些实施方案中，高达约10,000ng/ml，并且在其它实施方案中，高达约100,000ng/ml)的量给药所述血栓烷A2受体拮抗剂(例如伊非曲班)。在一些实施方案中，上述血浆浓度是在稳态时的血浆浓度。在一些实施方案中，上述血浆浓度是最大血浆浓度(Cmax)。在其中哺乳动物是人患者的某些优选的实施方案中，所述治疗有效量是约100mg/天至约2000mg/天，或者约10mg/天或约100mg/天至约1000mg/天，并且在某些实施方案中更优选约100mg/天至约500mg/天。所述每日剂量可以分开的剂量给药，或在一个推注或单位剂量中或在并行给药的多个剂量中给药。就该方面而言，可将伊非曲班口服给药、鼻内给药、直肠给药、阴道给药、舌下给药、含服给药、胃肠外给药或透皮给药。
给药的剂量应当根据患者的年龄、重量和病况，以及给药途径、剂型和方案以及期望的结果进行调节。
为了获得血栓烷A2受体拮抗剂的期望血浆浓度来用于治疗或预防纤维化，血栓烷A2受体拮抗剂的每日剂量优选为约0.1mg至约5000mg。在某些优选的实施方案中，用于治疗或预防纤维化的血栓烷A2受体拮抗剂的每日剂量可为约1mg/天至约2000mg/天；约10mg/天至约1000mg/天；约100mg/天至约1000mg/天；约50mg/天至约500mg/天；约100mg/天至约500mg/天；约200mg/天至约500mg/天；约300mg/天至约500mg/天；或约400mg/天至约500mg/天。
在某些优选的实施方案中，约10mg至约250mg(伊非曲班游离酸量)的伊非曲班钠的每日剂量会产生治疗有效血浆水平的伊非曲班游离酸以用于治疗或预防纤维化。
当所述血栓烷A2受体拮抗剂是伊非曲班时，用于提供A2/前列腺素内过氧化物受体(TPr)活化的抑制效果并从而提供脑微血管活化的减少的期望血浆浓度应当大于约10ng/mL(伊非曲班游离酸)。在大于约1ng/mL的浓度可看到血栓烷A2受体拮抗剂(例如伊非曲班)的一些抑制效果。
给药的剂量必须根据患者的年龄、重量和病况，以及给药途径、剂型和方案以及期望的结果小心地调节。
在其中所述血栓烷A2受体拮抗剂是伊非曲班或其药学上可接受的盐的某些优选的实施方案中，约10mg至约500mg，优选约10mg至约300mg(伊非曲班游离酸量)的伊非曲班钠的每日剂量会产生伊非曲班游离酸的有效血浆水平。
药物组合物
可将本发明的血栓烷A2受体拮抗剂通过任意药学上有效的途径给药。例如，可以使得可将它们口服给药、鼻内给药、直肠给药、阴道给药、舌下给药、含服给药、胃肠外给药或透皮给药的方式配制所述血栓烷A2受体拮抗剂，并从而相应地配制。
在某些实施方案中，可将所述血栓烷A2受体拮抗剂配制成药学上可接受的口服剂型。口服剂型可包括但不限于口服固体剂型和口服液体剂型。
口服固体剂型可包括但不限于片剂、胶囊剂、囊片、散剂、丸剂、多颗粒剂、珠、球及其任意组合。这些口服固体剂型可被配制为立即释放制剂、控释制剂、持续(延长)释放制剂或修饰释放制剂。
本发明的口服固体剂型还可含有药学上可接受的赋形剂，诸如填充剂、稀释剂、润滑剂、表面活性剂、助流剂、粘合剂、分散剂、助悬剂、崩解剂、增粘剂、成膜剂、制粒助剂、矫味剂、甜味剂、包衣剂、增溶剂及其组合。
根据期望的释放特性，本发明的口服固体剂型可含有合适量的控释剂、延长释放剂、修饰释放剂。
口服液体剂型包括但不限于溶液剂、乳剂、混悬剂和糖浆剂。这些口服液体剂型可以用本领域技术人员已知用于制备液体剂型的任何药学上可接受的赋形剂配制。例如，水、甘油、单糖浆、醇及其组合。
在本发明的某些实施方案中，可将所述血栓烷A2受体拮抗剂配制成适合用于胃肠外使用的剂型。例如，所述剂型可以是冻干的粉末、溶液剂、混悬剂(例如储库型混悬剂)。
在其它实施方案中，可将所述血栓烷A2受体拮抗剂配制成局部剂型，例如但不限于贴剂、凝胶剂、糊剂、乳膏剂、乳剂、搽剂、香膏、洗剂和软膏剂。
优选实施方案的详细描述
以下实施例不意为限制性的，并且代表本发明的某些实施方案。
实施例1
在该实施例中，用表1中列出的以下成分制备伊非曲班钠胶囊剂：
表1
成分 重量百分比
伊非曲班的钠盐 35
甘露醇 50
微晶纤维素 8
交聚维酮 3.0
氧化镁 2.0
硬脂酸镁 1.5
胶态二氧化硅 0.3
采用合适的混合器，将伊非曲班的钠盐、氧化镁、甘露醇、微晶纤维素和交聚维酮在一起混合约2至约10分钟。使得到的混合物通过#12至#40筛目尺寸筛。此后，加入硬脂酸镁和胶态二氧化硅，并继续混合约1分钟至约3分钟。
然后将得到的均匀混合物装入胶囊中，每个胶囊含有50mg伊非曲班钠盐。
实施例II
在该实施例中，由表2中列出的以下成分制备1000个片剂，每片含有400mg伊非曲班钠：
表2
成分 量
伊非曲班的钠盐 400mg
玉米淀粉 50g
明胶 7.5g
微晶纤维素(Avicel) 25g
硬脂酸镁 2.5g
实施例III
在该实施例中，用表3a和3b中列出的以下成分制备用于静脉内使用的可注射的伊非曲班钠溶液剂：
表3a
成分 量
伊非曲班钠 2500mg
对羟基苯甲酸甲酯 5mg
对羟基苯甲酸丙酯 1mg
氯化钠 25,000mg
注射用水足量 5升
表3b
成分 量
伊非曲班钠 52.5mg
无水磷酸氢二钠 345mg
无水磷酸二氢钠 1.0g
氯化钠 21.5g
注射用水足量 5升
将伊非曲班的钠盐、缓冲剂和氯化钠在3升注射用水中溶解，然后将体积调至5升。将溶液通过无菌过滤器过滤，并无菌填充入预灭菌的小瓶中，然后将所述小瓶用预灭菌的橡胶塞封闭。各小瓶含有50mg活性成分/5ml溶液的浓度。
实施例IV
右心室对负荷应激的适应
通过血栓烷受体拮抗作用改善
右心室对负荷应激适应的失败是肺动脉高压中死亡的直接原因。已将前列腺素/血栓烷平衡与应激下的心脏保护效果关联，其可能通过冠状动脉的支持。
方法：
将FVB/N小鼠或具有GFP巨噬细胞-特异性的谱系示踪标志物(LysM-Cre)的小鼠进行肺绑扎以直接增加负荷应激(或进行假外科手术用于对照)，并在次日于它们的饮用水中开始接受媒介物或血栓烷受体拮抗剂伊非曲班钠(25mg/kg/天)。2周后，通过经胸超声心动描记术得到非侵入性血液动力学，并通过处死前右心的压力-体积导管插入术得到侵入性血液动力学。针对纤维化和巨噬细胞浸润评估心脏。分离来自右心室的RNA，并用于改变的基因表达的无偏发现(使用在4个组(绑扎或假)上执行的Affymetrix Mouse Gene 2.0阵列)。将LysM-Cre小鼠心脏整个快速冷冻，进行横截面切片，并通过显微术评估纤维化和巨噬细胞浸润。通过ANOVA和t-检验评估组之间的差异。通过Spearman关联评估关联。
结果：
接受伊非曲班的绑扎的小鼠表现出在负荷应激下保留的右心功能的血液动力学标志物，其与纤维化的减少和炎症细胞的募集减少有关。基于表达阵列，这些效果的分子基础依赖于促纤维化途径(诸如PDGF-D和FBXO32)的减少和抗纤维化途径(包括THBS4和TGF-β抑制剂Asporin和LTBP2)的诱导。还存在与功能性肥大有关的途径诱导的证据，其包括血管生成的潜在增加以及与心脏肌生成有关的发育程序的再活化。所有这些变化都是对绑扎的小鼠特异性的，并且没有在接受伊非曲班钠的假外科手术组中发现。由于之前已表明负荷应激会诱导血栓烷产生，这可能是因为被药物阻断的途径在假外科手术中是不活跃的。
结论：
右心室负荷应激的啮齿动物模型证实，血栓烷受体拮抗剂伊非曲班钠会改善适应性应答的生理学和分子标志物。
实施例V
该研究的目的是确定伊非曲班介导的血栓烷-前列腺素类受体的阻断是否可影响肺性高血压的小鼠模型中心脏/肺功能和基因表达，以确定伊非曲班是否可用于治疗患有疾病早期阶段的人中的肺性高血压。
实验方法：在该肺动脉绑扎(PAB)动物模型中，我们使用接受正常饮食的野生型或Rosa26-rtTA2小鼠。将小鼠麻醉并在4-6个月龄进行PAB(20只小鼠)或假外科手术(10只小鼠)。手术后，给予小鼠30mg/kg/天的伊非曲班水或正常饮用水，并且在治疗14天后，我们进行心血管表型分析，随后进行终末处死、组织学和基因表达阵列。
在导管插入术和处死前一天，得到超声心动图以评估心输出量。我们的标准心血管表型分析用全身压力测量(通过尾静脉套囊进行)和颈静脉内心脏导管插入术(针对峰值压力、舒张压、舒张时间常数、动脉弹回性、射血分数和每搏输出量来测量右心室收缩压(RVSP))继续。
处死后，在各动物中评估右心室肥大(以心脏重量的百分比的形式)。将右心的任意部分在福尔马林中固定用于组织学，并检查纤维化的指标；将其它心脏快速冷冻用于通过RNA微阵列的基因表达分析。收集右心和肺用于蛋白表达和基因表达阵列的分析。将左肺固定和染色。在小肺动脉血管中检查血小板沉积。将剩余的器官收获并在液氮中冷冻用于可能的基因表达分析。
得到的结果如下。肺动脉的绑扎是成功的(即，右心室收缩压(RVSP)增加)，但是伊非曲班不具有效果。总心输出量在绑扎后基本上不变，其表明右心补偿。三尖瓣E与A波的比率(通过未配对t检验，p<0.05)证实，伊非曲班在绑扎的小鼠中显著增加三尖瓣E与A波的比率。该数据表明，伊非曲班增加在纤维化应激源的中央的心脏大小，这是有益的。结果还证实，用伊非曲班治疗会减少绑扎的右心室中的纤维化。小鼠的右心室的横截面(在20倍获取的三色染色的RV)表明，伊非曲班会减少假外科手术的右心室和绑扎的右心室中的纤维化。媒介物治疗的小鼠具有增加的纤维化胶原沉积物水平，而伊非曲班治疗的小鼠表现出非常少的纤维化。
被肺绑扎和伊非曲班治疗改变的基因分成三大类：炎症、纤维化和肌化。一般而言，所有三类都被绑扎增加，但是用伊非曲班治疗会减少促纤维化基因和炎症性基因的表达，并增加促肌化基因的表达。
作为该研究的一部分，提取RNA并使用Mouse Genone 2.0Affymetrix表达阵列进行表达分析(图4C)。阵列设计为2x2x2：假的/绑扎的x媒介物/伊非曲班x M/F。总计有8个阵列；各阵列是来自3只小鼠的RV集合。仅具有RVSP>30的小鼠用于绑扎组。将媒介物绑扎与假进行对比，绑扎本身改变199个基因(ABS(平均值的差异)-标准差的总和)>0.4，并且那些基因中的49个的表达被伊非曲班增强(差异>0.4)，并且那些基因中的29个的表达被伊非曲班减弱(差异>0.4)。在其增加被伊非曲班阻断的基因中，认为约一半表明减少的炎症细胞募集，这基于以下事实：(i)伊非曲班减少PDGF(促纤维化信号传递分子)(Ponten等人,Platelet-dervied growth factor D induces cardiac fibrosis and proliferationof vascular smooth muscle cells in heart-specific transgenic mice”Circ.Res.2005年11月11日:97(10):1036-45)的表达；(ii)就纤维化/抗纤维化而言，伊非曲班减少FBX032(一种促纤维化信号传递分子)(Usui等人,“Endogenous muscle atrophyF-box mediates pressure overload-induced cardiac hypertrophy throughregulation of nuclear factor-kappaB”,Circ.Res.,2011年7月8日09(2):161-71)的表达；(iii)就纤维化/抗纤维化而言，伊非曲班增加与胶原和细胞-细胞粘附有关的某些基因的表达，特别是凝血酶敏感蛋白-4(Thbs4)。在其增加被伊非曲班增强的基因中，约一半与胶原和细胞-细胞粘附有关；(iv)伊非曲班还增强在TGF-β、Asporin和Ltbp2的抑制中涉及的基因的表达；(v)伊非曲班增强其它基因(即Nmrk2、Meox1、Nkd2和Pkhd1)的表达；(vi)就肌化而言，伊非曲班增强NMRK2的表达，NMRK2可能在控制肌肉分化的进展中起关键作用(Li等人“A novel muscle-specific beta 1integrin binding protein(MIBP)thatmodulates myogenic differentiation),J.Cell Biol.1999年12月27日:147(7)；1391-8；(vii)就肌化而言，伊非曲班增强Meox1的表达(Mankoo等人,“The concerted action ofMeox homeobox genes is required upstream of genetic pathways essential forthe formation,patterning and differentiation of somites”,Development,2003年10月:130(19):4655-64；伊非曲班增强NKD2的表达，Hu等人,“MyristoylatedNaked2antagonizes Wnt-beta-catenin activity by degrading Dishevlled-1at theplasma membrane”,J.Bio.Chem.2010年4月30日:285(18)第13561-8页,参见图12；伊非曲班增强Pkhd1的表达(Gillessen-Kaesbach等人,“New autosomal recessive lethaldisorder with polycystic kidnesy type Potter I,characteristic face,microephaly,brachymelia,and congenital heart defects”,AM J Med Genet.,1993年2月15日；45(4):511-8。
因此，伊非曲班在RV应激中的保护效果可能包括炎症细胞募集的减少；促纤维化途径(诸如PDGF-D和FBXO32)的诱导减少；抗纤维化途径(包括THBS4和TGF-β抑制剂Asporin和LTBP2)的诱导；以及与功能性肥大有关的途径(包括潜在血管生成)的诱导。
实施例VI
对野生型小鼠进行肺动脉绑扎，随后用伊非曲班(30mg/kg/天，通过饮用水)相对于对照(普通饮用水)治疗2周或6周。肺动脉条带模仿肺性高血压和右心衰竭。右心组织学揭示对照小鼠中显著增加的心肌细胞大小，并且伊非曲班治疗能够阻止该效应并表现出与接受假外科手术的动物类似的心肌细胞大小。
治疗/肺动脉绑扎6周后的超声心动描记术揭示对照小鼠中的左心室衰竭，而伊非曲班治疗的小鼠具有与接受假外科手术的动物类似的心脏功能值。
首先表明右心室收缩压(RVSP)在已经接受肺动脉条带的所有动物中升高(如预期的)。在6周时的回声数据(包括舒张末期容积、收缩末期容积、左心室每搏输出量、射血分数和缩短分数)揭示，左心室在媒介物治疗的PAB小鼠中失败，而伊非曲班治疗的PAB小鼠被保护免于这些效应，且具有与假外科手术动物类似的回声值。将肺动脉绑扎延长至6周时有在2周模型中没有看到的左心室衰竭的事实被认为是出乎预料的，并且使得伊非曲班保护免于该左心室衰竭的能力甚至更惊人。伊非曲班在6周时也保护免于右心室中心肌细胞直径的增加和减少右心室纤维化。
这些结果表明，伊非曲班在该6周模型中通过多种机制/途径提供免于扩张型心肌病的保护。
实施例VII
鉴于在心脏应激的条件下TP受体活化的主要有害后果以及与心肌病有关的异前列烷的产生，我们检查了TP受体拮抗作用在右心室压力负荷过大的肺动脉绑扎(PAB)模型中的效果。在该实施例中，向由于肺动脉绑扎(PAB)导致的压力负荷过大而患有RV功能障碍的小鼠给予媒介物或伊非曲班。PAB后2周，保护伊非曲班治疗的小鼠免于压力负荷过大。使用基因表达阵列、定量组织学和形态计量法、谱系示踪和细胞培养系统来确定伊非曲班保护机制。伊非曲班造成纤维化区域的接近标准化，阻止细胞肥大，同时允许增加的RV量，增加抗纤维化凝血酶敏感蛋白-4的表达，并且阻断促纤维化TGF-β途径的诱导。低剂量阿司匹林不能复制这些结果。将TP受体拮抗剂治疗延长至PAB后6周导致更高的功能性适应和减少的在延长的压力负荷过大下观察到的心力衰竭的指征。
将雄性和雌性年龄匹配的C57Bl/6或FVB/NJ小鼠(通过内部繁殖得到)用于肺动脉绑扎。通过杂交育种LysM-Cre x mTomato/GFP报告小鼠B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J(来自Tim Blackwell的赠品)x Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo(JAX原种#007676)，得到LysM-GFP小鼠。外科手术次日时，向小鼠给予25mg/kg/天的在饮用水中的伊非曲班(Cumberland Pharmaceuticals Inc.,Nashville,TN)或正常饮用水(媒介物)2周或6周，然后进行血液动力学评价。将小鼠称重，并每周换水1次。
结果：在接受伊非曲班的PAB小鼠中增加的心室效率
对小鼠进行肺动脉绑扎(PAB)或假外科手术，并用媒介物或在饮用水中的伊非曲班(TPα/TPβ的竞争性拮抗剂)治疗2周。PAB小鼠中的右心室收缩压(RVSP)升高，这表明成功的机械血管收缩。在绑扎后2周，心输出量没有显著变化，并且在媒介物和伊非曲班治疗的PAB组中RV量相似地增加。但是，通过超声心动描记术，在给予TP拮抗剂的小鼠中E/A波比率增加，这表明增加的充盈效率。通过蛋白质印迹分析RV中的TP受体表达，并且在PAB或药物治疗后2周以后保持恒定。
PAB诱导从～22mm Hg至大约40mm Hg的RVSP增加(**，通过双因素方差分析，p<0.01)。2周以后在PAB小鼠中的心输出量未减少。在PAB小鼠中右心室重量与左心室+隔膜重量的比率增加(**，通过双因素方差分析，p<0.01)；该增加没有被伊非曲班阻断。三尖瓣E/A波比率(收缩性的量度)被伊非曲班改善(*，通过ANOVA,p<0.05)，但是仅在PAB小鼠中。TP受体蛋白在完整RV中表达，并且表达没有随PAB变化。
用TP受体拮抗作用减少心脏纤维化
使用30mmHg的RVSP定义PAH，并且仅来自在该阈值或超过该阈值的小鼠的样品用于分析PAB组。PAB小鼠在2周内形成显著的RV纤维化，其几乎被伊非曲班治疗完全消除。口服剂量的阿司匹林(10mg/kg/天)没有阻止该模型中的纤维化，这表明血栓烷A2不是介导纤维化的配体。PAB后2周，在用Masson氏三色染色的冷冻RV的组织学切片中，未治疗的小鼠的RV中的纤维化已从<5％增加至～20％(蓝色染色)。该效果被伊非曲班阻断，但未被阿司匹林阻断。
伊非曲班治疗的PAB小鼠中RV基因表达的变化
为了确定伊非曲班减少纤维化和保护RV收缩性的机制，我们在来自具有假或PAB外科手术的小鼠(有或无药物治疗)的合并RV集合上实施基因表达阵列。通过基础组分分析，发现绑扎的强效果，并且仅在已经历绑扎的小鼠中的伊非曲班的效果。基础组分分析表明具有绑扎的组的强分离，仅在有绑扎的小鼠中具有伊非曲班的强效果。伊非曲班没有显著改变仅具有假外科手术的小鼠中的基因表达。在PAB小鼠中，伊非曲班治疗增强一些基因的转录，而绑扎对其它基因的效果被TP受体拮抗作用阻断。特别地，存在与附着、胶原组构、细胞外结构和发育过程有关的基因表达的变化。
PAB小鼠中的心脏单核细胞
通过表达阵列，给予伊非曲班的PAB小鼠具有减少的Cd14(成熟的巨噬细胞的标志物)以及Tlr8和其它促炎症性基因的RV表达。TP受体也在单核细胞上表达，并且这些受体的阻断可能具有免疫特异性的效果。为了确定用TP受体抑制观察到的纤维化的减少是否是由于RV中减少的巨噬细胞浸润或增殖，对在溶菌酶M启动子下表达eGFP的LysM-Cre小鼠实施PAB，其中将所有曾经具有单核细胞谱系的细胞用GFP标记，即使它们在之后分化。尽管大多数单核细胞位于左心或隔膜中，PAB似乎在媒介物治疗的和阿司匹林治疗的小鼠中增加RV单核细胞的数目。取自野生型小鼠的RV的流式细胞计量术揭示于任何检查的巨噬细胞群体中在绑扎下没有显著变化，与假手术对照相比，在媒介物治疗的PAB小鼠中具有朝向增加的CD14/CD45和F480/CD45-标记的细胞和减少的CD86-标记的CD45+细胞的非显著趋势，但是在伊非曲班治疗的PAB小鼠中没有。这种与LysM-Cre小鼠的错配表明，所述细胞在寄生于心脏中以后丧失它们的循环分化标志物。基因表达阵列表明伊非曲班会减少与炎症细胞募集有关的基因的表达，但是仅在压力负荷过大的背景下。使用转基因的LysM-Cre x flox-mTomato-flox eGFP小鼠标记RV中的单核细胞衍生化的细胞。这些小鼠表达荧光红，除了在从单核细胞谱系衍生出的细胞中以外(即使它们之后分化)(它们表达荧光绿)。PAB在媒介物和ASA小鼠中显著地增加绿细胞的数目，但是在伊非曲班治疗的小鼠中不会(展示来自2-3个转基因心脏的代表性图像)。循环标志物的整个RV的流式分选发现PA-绑扎小鼠中朝向增加的非显著趋势，其被伊非曲班阻断。
伊非曲班治疗的PAB小鼠中减少的细胞肥大
与绑扎对照相比，在接受TP受体拮抗剂的PAB小鼠中，与生肌分化有关的基因的表达增强。尽管RV重量在媒介物治疗的和伊非曲班治疗的PAB小鼠中相似地增加，通常与PAB有关的心肌细胞直径的增加被伊非曲班治疗阻断。阿司匹林治疗的小鼠具有与媒介物治疗的小鼠类似的心肌细胞直径。在具有PAB的小鼠中，心肌细胞大小增加。该效果被伊非曲班阻断，但是没有被阿司匹林阻断。蛋白质印迹证实RV中的α-MHC和β-MHC表达。α-MHC是可变的，但是没有变化，而β-MHC在给予TP受体拮抗剂的PAB小鼠中被强烈地诱导。PAB小鼠的伊非曲班治疗造成β-肌球蛋白重链(β-MHC)蛋白的诱导，α-MHC表达没有变化。在压力负荷过大的主动脉绑扎模型中，该诱导与表达β-MHC的细胞中减少的单个肥大有关。TP受体拮抗作用后β-MHC的诱导不是由于增加的动物年龄，因为媒介物治疗的和伊非曲班治疗的PAB小鼠的平均年龄分别是688.3±19.8和689.8±18.5天。基因表达阵列表明与适应性重构有关的伊非曲班诱导的基因，但是仅在压力负荷过大的背景下。
减少的TGF-β信号传递和增强的TSP-4
检查伊非曲班治疗对已知的纤维化和抗纤维化信号传递途径的影响。接受TP受体拮抗剂的小鼠具有比媒介物治疗的小鼠更少的与PAB有关的磷酸-SMAD2/3，以及减少的与纤维化有关的基因的表达，增加的抗纤维化基因的表达。给予外源TGF-β、伊非曲班治疗的培养的心肌细胞与媒介物治疗的细胞相比无PAI-1表达或启动子活性的变化，这表明没有来自它的受体的对TGF-β信号传递的直接阻断，并表明TGF-β的体内阻断发生在配体结合的上游。与促纤维化TGF-β相反，压力负荷过大与抗纤维化凝血酶敏感蛋白-4(Thbs4；TSP-4)mRNA的诱导有关。伊非曲班治疗仅强烈地增强PAB RV中的Thbs4表达(图6B)，其翻译成伊非曲班治疗的绑扎的小鼠中增加的TSP-4蛋白。尽管TSP-4的定位似乎限于媒介物治疗的RV中的纤维化斑块，接受伊非曲班的PAB小鼠表现出增加的TSP-4的心肌细胞表达。伊非曲班阻断体内TGF-β信号传递分子Smad2/3的磷酸化(各带来自不同的小鼠心脏)。来自RV的基因表达阵列表明伊非曲班减少促纤维化基因并诱导抗纤维化基因，但是仅在压力负荷过大的背景下。在培养的心肌细胞中，伊非曲班未阻断规范TGF-β靶标PAI1的蛋白表达，它也没有阻断由PAI1启动子驱动的萤光素酶活性的诱导。PAB诱导RV中的TSP-4表达，其被伊非曲班治疗强烈地增强。
心力衰竭的预防
在以前的实验中，在PAB后，存在RV量的增加，但是不存在心输出量或其它功能参数(除了E/A波比率之外)的任何变化。为了确定用TP受体拮抗作用看到的纤维化的减少是否导致增加的心脏功能的保护，将PAB诱导的压力负荷过大以后的阶段延长至6周，并同样继续给药伊非曲班至6周。6周以后，对照治疗的PAB小鼠发生左心室扩张，如通过增加的心脏收缩和心脏舒张容积所证实，其伴有补偿性的增加的每搏输出量。这与减少的射血分数和减少的缩短分数(心力衰竭的标志)有关。所有这些在接受伊非曲班的PAB小鼠中被预防，尽管具有类似的RVSP。小鼠接受假外科手术或PAB以及6周后实施的超声心动描记术和压力环导管插入术。使用用球形和圆柱形模型计算的值的平均值，测量左心室的舒张和收缩末期容积。还从超声心动描记术得到左心室每搏输出量和射血分数，以及缩短分数百分比。
高剂量相对于低剂量伊非曲班的比较
在该实施例的另一个分支中，通过饮用水将低剂量(3mg/kg/天)伊非曲班给药至小鼠持续肺动脉绑扎后2周。右心室组织学揭示，该低剂量治疗不会预防右心室的纤维化。除了纤维化胶原沉积以外，细胞核存在于浸润细胞或增殖细胞的细胞外空间中。本文中在前面呈现的结果揭示高剂量伊非曲班(25mg/kg/天)在相同模型中的抗纤维化效果。右心室组织的凝血酶敏感蛋白-4(TSP-4)蛋白质印迹的密度测定法分析证实，通过饮用水给予高剂量伊非曲班(25mg/kg/天)持续肺动脉绑扎后2周会增加抗纤维化TSP-4的表达，而低剂量伊非曲班3mg/kg/天不会。
讨论
在具有肺动脉的机械收缩的小鼠(PAH-相关的RV肥大的模型)中研究TP受体拮抗作用的效果。使用有效量的TP受体拮抗剂伊非曲班的治疗会减少PAB小鼠中的RV纤维化和心肌细胞肥大，并增加E/A比率(心脏效率的一个指标(E/A比率是早期(E)与晚期(A)心室充盈速率的比率)。在健康的心脏中，E速率大于A速率。在某些病理学中和随着老化，左心室壁可以变得僵硬，这增加了它充盈时的反压，这会减慢早期(E)充盈速率，从而降低E/A比率))。这与增加的抗纤维化和肌化基因的RV表达有关，以及减少的与炎症有关的基因的表达和RV磷酸-SMAD2/3的减少。在接受伊非曲班的假手术的小鼠中几乎没有发现差异，这表明伊非曲班介导的基因表达变化是对PA绑扎特异性的。当压力负荷过大延长至6周时，给予TP受体拮抗剂的小鼠被保护免于在媒介物治疗的PAB小鼠中看到的心力衰竭的指征：左心室容积的显著增加以及射血分数和缩短分数的减小。这可能是由于心室相互依赖性、中隔弓弯或神经激素活化。
小鼠的低剂量阿司匹林治疗没有复制用TP受体拮抗作用看到的最初心脏保护效果；表明与PAB有关的纤维化并非由产生血小板的血栓烷介导。选择该低剂量，因为高剂量阿司匹林在含有心力衰竭的患者中不会减少死亡率或住院治疗，并且为了避免混杂的抗炎或水杨酸盐介导的NF-κB效果。确实存在以下可能性：TxA2的局部或巨噬细胞产生负责在该模型中观察到的心脏纤维化。但是，也已知异前列烷(诸如8-异-PGF2α)通过TP受体进行信号传递，并且可以造成增加的胶原产生和纤维发生效果。实际上，通过超氧化物歧化酶的增强或自由基清除剂的引入来减少氧化性应激和异前列烷产生可以在压力负荷过大中具有抗纤维化、心脏保护效果。关于哪种具体异前列烷通过TP受体进行信号传递或结构上类似的“TP-样受体”是否介导某种异前列烷作用，存在一些争论。可能形成组织-特异性的受体复合物，或存在尚未鉴别的具有类似结合的TP-样受体，其可能在伊非曲班的效果中起作用。作为另外的选择，除了异前列烷和血栓烷以外，伊非曲班的效果可以由TP受体的另一种内源性配体(诸如前列腺素H2或20-HETE)介导。
使情况更复杂的是，存在TP受体的α和β亚型(具有类似的配体结合和Gq/G11偶联，但是不同定位的剪接变体)。两种受体都被伊非曲班有效地阻断。目前不知道这些亚型中的哪种和在哪种组织上响应于压力负荷过大而介导心脏纤维化。通过免疫印迹法和mRNA(数据未显示)，我们检测了完整RV中的稳健TP受体表达，这表明它在心肌细胞中的表达，尽管成纤维细胞或内皮受体的可能贡献不可被忽略。但是，我们的方法不能区分TPα和TPβ表达。
在该研究中，我们还检查了TP受体抑制对PAB小鼠中的RV巨噬细胞数目和细胞标志物表达的影响。通过FACS分析，我们没有发现任何显著的变化，不仅伊非曲班治疗相对于媒介物，而且在PAB和假手术的小鼠之间。但是，在取自具有单核细胞谱系的表达GFP的细胞的小鼠的心脏中，似乎有许多与心肌细胞纤维较好结合的单核细胞，并且我们可能没有从各RV完全解离单个单核细胞。也可能在转基因心脏中看到的表达LysM的细胞实际上是嗜中性粒细胞，尽管通过FACS，总表达CD45的细胞(其包括嗜中性粒细胞)的百分比没有变化。
在PAB后2周，伊非曲班治疗增加PAB小鼠的E/A波比率，这表明可能的增加的收缩效率。这类似于以前的研究，证实TP受体拮抗作用在内毒素性休克以后保留RV效率(Lambermont B,Kolh P,Ghuysen A,Segers P,Dogne JM,Tchana-Sato V,Morimont P,Benoit P,Gerard P,Masereel B和D'Orio V.Effect of a novel thromboxaneA2inhibitor on right ventricular-arterial coupling in endotoxicshock.Shock.2004；21:45-51)。未知的是，这种用伊非曲班治疗的增加的效率是否是由于心脏纤维化的减少或与PA绑扎有关的心肌细胞肥大的减少，或可能是这两种机制的组合。我们用伊非曲班发现的减少的细胞肥大与小鼠中TP受体活化的已知肥大效果相一致，但是可能是协调的体内效应，而不是由于对心肌细胞的直接TP受体抑制，因为血栓烷激动剂不会造成体内分离的心肌细胞的肥大。
在TP拮抗剂治疗的PAB小鼠中单独的细胞肥大和伴随增加的β-MHC的RV表达的预防(没有α-MHC表达的变化)与Lopez等人的之前的研究对应(Lopez JE,Myagmar B,SwigartPM,Montgomery MD,Haynam S,Bigos M,Rodrigo MC和Simpson PC.β-Myosin heavy chainis induced by pressure overload in a minor subpopulation of smaller mousecardiac myocytes.Circ Res.2011；109:629-38)。通过在压力负荷过大后尺寸分选各个心肌细胞，他们发现β-MHC表达仅发生在非-肥大性的心肌细胞中；所有细胞具有类似的α-MHC表达。尽管各个细胞没有在直径上增加，给予伊非曲班的PAB小鼠具有与媒介物治疗的小鼠类似的RV重量增加，其如通过增加的Fulton指标所证实的。在与绑扎相关的伊非曲班所活化的基因中包括许多与细胞生长和重新程序化有关的基因，并且理论上认为TP受体抑制会响应于压力负荷过大而诱导肌化和功能性肥大，同时也减少纤维化应答。减少的TGFβ活性可能部分地是减少的纤维化应答的原因，尽管在TGFβ的减少背后伊非曲班启动事件仍然是未知的。
不知道TSP-4(其也通过PA绑扎增加并且被伊非曲班治疗进一步正调节)调节TGFβ活化，但是它自身可以减少纤维化和肥大，并在压力负荷过大下增加收缩性和心脏适应。认为TSP-4通过诱导保护性内质网(ER)应激信号传递(通过活化转录因子6α(Atf6α)，一种ER应激应答转录因子)而起作用。尽管在伊非曲班治疗的小鼠中TSP-4向心肌细胞的定位(不同于媒介物治疗的小鼠中严格的纤维化区域)会支持细胞内信号传递，在我们的模型中，在PA绑扎或TP受体拮抗作用后不存在Atf6αmRNA水平的差异(数据未显示)。完全可能的是，2周时间点错过mRNA的任何增加，或者RV应激应答不同于LV模型(其中描绘了对TSP-4的Atf6α应答)。
总之，这些研究证实，伊非曲班通过使右心进展向适应而非适应不良性的纤维化、炎症和细胞肥大来针对压力负荷过大进行心脏保护。右心的保护最终导致这些小鼠中左心衰竭的预防。
在上述说明书中，已经参考具体示例性实施方案及其实施例描述了本发明。但是，明显可以在不脱离所附权利要求书中阐述的本发明的更宽精神和范围下，对其做出多种修改和变化。本说明书应当以示例性的方式而不是限制含义来对待。

Claims (22)

1.治疗需要其治疗的哺乳动物的心脏纤维化的方法，其包括向所述哺乳动物给药治疗有效量的血栓烷A2受体拮抗剂或其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物是人患者。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述血栓烷A2受体拮抗剂是[1S-(1α,2α,3α,4α)]-2-[[3-[4-[(戊基氨基)羰基]-2-噁唑基]-7-氧杂二环[2.2.1]庚-2-基]甲基]苯丙酸(伊非曲班)或其药学上可接受的盐。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述治疗有效量的伊非曲班降低所述哺乳动物中纤维化组织的形成速率。
5.根据权利要求3所述的方法，其中将所述伊非曲班以有效提供约1ng/ml至约10,000ng/ml的伊非曲班的血浆浓度的量给药。
6.根据权利要求3所述的方法，其中将所述血栓烷A2受体拮抗剂以有效提供约1ng/ml至约100,000ng/ml的血浆浓度的量给药。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述治疗有效量是约10mg/天至约1000mg/天。
8.根据权利要求7所述的方法，其中将所述伊非曲班口服给药、鼻内给药、直肠给药、阴道给药、舌下给药、含服给药、胃肠外给药或透皮给药。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述治疗有效量的伊非曲班减慢所述人患者中的心肌纤维化的进展。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述治疗有效量的伊非曲班改善所述人患者的运动能力。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述治疗有效量的伊非曲班减少所述人患者中的RV纤维化。
12.根据权利要求7所述的方法，其中所述治疗有效量的伊非曲班减少所述人患者中的心肌细胞肥大。
13.根据权利要求7所述的方法，其中所述治疗有效量的伊非曲班在所述人患者中提供增加的E/A比率。
14.根据权利要求7所述的方法，其中所述治疗有效量的伊非曲班改善或维持选自下列的功能：右心室射血分数(RVEF)、左心室射血分数(LVEF)、肺动力学、右心室收缩压(RVSP)、左心室收缩功能(LVSF)、右心室舒张功能(RVDF)和左心室舒张功能(LVDF)。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述治疗有效量的伊非曲班增加所述人患者中的心肌细胞直径。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述治疗有效量的伊非曲班通过使右心进展向适应而非适应不良性的纤维化、炎症和细胞肥大来针对压力负荷过大进行心脏保护。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述治疗有效量的伊非曲班减弱所述人患者中的左心衰竭。
18.药物组合物，其包含血栓烷A2受体拮抗剂或其药学上可接受的盐，所述血栓烷A2受体拮抗剂的量在需要其的哺乳动物中有效地改善或维持选自下列的功能：右心室射血分数(RVEF)、左心室射血分数(LVEF)、肺动力学、右心室收缩压(RVSP)、左心室收缩功能(LVSF)、右心室舒张功能(RVDF)和左心室舒张功能(LVDF)。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述血栓烷A2受体拮抗剂是伊非曲班或其药学上可接受的盐。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述伊非曲班盐是伊非曲班钠。
21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述治疗有效量是约10mg/天至约1000mg/天。
22.根据权利要求21所述的药物组合物，其为口服固体剂型。
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