CN114042071A - 尤克那非新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了尤克那非在治疗磷酸二酯酶5(PDE5)/环一磷酸鸟苷(cGMP)/蛋白激酶(PKG)通路(PDE5/cGMP/PKG通路)参与的生物病理过程的疾病和病症的新用途。本发明进一步涉及的是尤克那非在预防和控制PDE5/cGMP/PKG通路参与的生物病理过程的疾病和病症的发生或复发，以及延长病症缓解期的新用途。因为PDE5广泛表达和分布在大脑，血管平滑肌，肺等组织，因此给予尤克那非提升这些组织中的cGMP水平有助于心脑肺血管系统,神经系统和代谢疾病的预防，控制，治疗和恢复。本发明也公开了适合尤克那非的非口服给药的途径和方法。本发明中尤克那非的新用途不仅限于尤克那非单独使用、通过抑制PDE5活性升高cGMP水平达到治疗效果，也包括它与其他药物联合使用实现协同治疗效果。

Description

尤克那非新用途

本申请是申请号为2015104150375、申请日为2015年7月8日、发明名称为“尤克那非新用途”的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及尤克那非在制备用于治疗PDE5/cGMP/PKG通路参与的生物病理过程的疾病的药物中的新用途，具体地说是涉及优克那非通过抑制PDE5活性治疗PDE5表达高的大脑，肺，肾，膀胱，平滑肌，血小板，心，内皮细胞，胰腺,阴茎，全身血管，气管平滑肌，肥厚心肌，胃肠道上皮细胞和生殖系统组织和部位的疾病的新用途，具体症状是缺血性脑卒中，缺血性心力衰竭，肺动脉高压，糖尿病，动脉粥状硬化，老年痴呆，疼痛，抗癌药免疫增效方面的用途。

背景技术

磷酸二酯酶5/环一磷酸鸟苷/蛋白激酶通路(PDE5/cGMP/PKG通路)病理生物学：所谓的PDE5/cGMP/PKG通路是PDE5调控由一氧化氮(NO)激活水溶性鸟苷酸环化酶(sGC)催化三磷酸鸟苷(GTP)转化第二信使环一磷酸鸟苷(cGMP)，及相应的cGMP蛋白激酶(PKG)和环核苷酸门控制的生理过程的通道。这些通道直接调控平滑肌的蠕动、神经传递(neurotransmission)、血管张力(regulation of blood-vesseltone)和免疫响应(immuneresponse)等作用。

磷酸二酯酶(PDEs)本身是一个超级酶家族，有11个亚型，PDE 1到PDE11，其中PDE5特异性水解cGMP，负责调节细胞内cGMP的水平。PDE5广泛的表达分布在人体的多种组织中，研究明确证明的有大脑，肺，肾，膀胱，平滑肌，血小板，全身血管，肥厚心肌，心，内皮细胞,胰腺,阴茎，气管平滑肌，胃肠道上皮细胞，生殖系统等。

PDE5抑制剂的主要功能是通过抑制PDE5对cGMP的水解，使细胞内cGMP的蓄积。因此PDE5成为了治疗与cGMP水平相关疾病的理想药物靶点。研究证明PDE5/cGMP/PKG通路参与很多体内关键性的生物生理学过程。图2描述了PDE5/cGMP/PKG通路生物功能作用过程。

发明内容

按照我们的国际专利申请WO2004108726的说明书，我们发现和证明了尤克那非是通过抑制PDE5活性调节cGMP水平治疗男性勃起功能障碍的化合物，并已经取得尤克那非作为治疗男性勃起功能障碍药物的开发成功，目前尤克那非治疗男性勃起功能障碍已经在进行二期临床试验中。

本发明包括以尤克那非为主要活性成分制造的药物在治疗PDE5/cGMP/PKG通路参与的生物病理过程的疾病和病症的新用途。包括但是不限于原发性，继发性和遗传性心脑肺血管系统，代谢系统，神经系统等疾病和病症。治疗的机制不限于通过抑制PDE5在特定组织和部位的活性提升cGMP的水平达到治疗和改善效果，也包括促进一氧化氮(NO)生成提升NO通路活性达到治疗和改善效果。本发明还包括以尤克那非为主要活性成分制造的药物在预防和控制PDE5/cGMP/PKG通路参与的生物病理过程的疾病和病症的发生或复发，以及延长病症缓解期的新用途。因为PDE5广泛表达和分布大脑，肺，肾，膀胱，平滑肌，血小板，心，内皮细胞,胰腺,阴茎，全身血管，气管平滑肌，肥厚心肌，胃肠道上皮细胞和生殖系统等部位和组织，因此给予尤克那非提升这些组织中的cGMP水平有助于这些组织和部位疾病的预防，控制，治疗和恢复。

本发明还包括尤克那非与其他药物联合使用或“鸡尾酒”方式使用，尤克那非发挥抑制PDE5活性提升cGMP水平使患者自身的生理功能和恢复能力得到提高和改善，实现协同治疗效果。本发明还包括尤克那非与其他治疗PDE5/cGMP/PKG通路参与的生物病理过程的疾病和病症的常规治疗方法相结合给药，这些常规方法包括但不限于手术，激素疗法，生物疗法和免疫疗法。

本发明的特点是尤克那非抑制PDE5水解cGMP的活性，提升cGMP在组织和细胞中的水平，从而调动与cGMP相关联的生物通路功能激发起患者机体自身的防御疾病发生，病发后抵御病情发展和恢复发病时造成的损伤的能力。

本发明中尤克那非包括尤克那非可药用的盐，溶剂化物，水合物，前药和络合物，以及它们口服和非口服给药的途径和制剂。

本发明详述如下：

(1)本发明第一方面提供尤克那非在制备治疗脑血管疾病药物新的用途。

脑血管疾病(Cerebra vascular disease，CVD)是各种血管源性脑病变引起的脑功能障碍，是一种发病率高、复发率高、致残率高、死亡率高和医疗费用高，与心脏病，恶性肿瘤齐名的疾病，目前中国现存脑血管病患者是719-745.6/10万人，发病率109.7-217/10万人，死亡率116-141.8/10万人，幸存者50％-70％遗留严重残疾，已成为中国农村和城市人口致残、致死的第一大疾病。脑血管疾病通常分为缺血性和出血性脑血管病两大类。其中，缺血性脑卒中(中风)约占70％。包括颈内动脉闭塞综合征、大脑中动脉闭塞综合征、大脑前动脉闭塞综合征、大脑后动脉闭塞综合征、椎基底动脉闭塞综合征、分水岭脑梗死、偏瘫、失语、痴呆等。

急性缺血性脑卒中是临床神经内科常见病之一，也是高血压、心脏病、糖尿病的常见并发症。缺血性脑卒中的主要原因为：①动脉粥样硬化所致血栓栓塞；②心脏来源的栓子所致脑栓塞；③各种原因引起的血管炎、血管损伤以及外伤等。主要包括脑血栓形成和脑栓塞。前者由于脑动脉系统中的粥样硬化和血栓形成使动脉管腔狭窄或闭塞导致脑组织局部动脉血流灌注减少或中止所引起的局部脑组织坏死。另外，胶原性疾病或动脉炎引起的动脉内膜增生和肥厚，颈动脉外伤，肿瘤压迫颈动脉，小儿颈部淋巴结炎和扁桃体炎伴发的颈动脉血栓，以及先天颈动脉扭曲等，均可引起颈内动脉狭窄和闭塞。颈椎病骨质增生或颅底陷入压迫椎动脉，也可造成椎动脉缺血。临床表现是1、脑血管形态结构受损；2、血液动力学异常；3、血液成分改变，血液粘滞度增加。缺血性脑卒中是严重致残性疾病，一般在夜间睡眠中发病，造成中枢神经系统(Central nervous system，CNS)神经元损伤，常为次晨起床时发现肢体无力或偏瘫，多无意识障碍，血压可正常或偏高，可有动脉硬化史。随着医疗技术的不断提高和医疗条件的不断完善，缺血性卒中的致死率虽已明显降低，但缺血性脑卒中损伤后遗留神经功能缺失如偏瘫、失语、痴呆等严重残疾，尿和大便失禁共存在于80～90％的急性脑卒中患者，给患者、家庭、社会带来极大的痛楚和沉重的负担。

急性缺血性脑卒中的治疗目的是降低致残率，提高病人生活质量，努力实现改善脑的血循环，增加缺血区的半暗带区的血流及氧的供应，控制脑水肿，防治并发症。在过去的30-40年中，以减轻缺血性脑卒中造成脑损伤和残疾为目的，科学家在开发中风后急救治疗药物和方法上付出了大量的努力。然而，这些努力获得的成就很有限，多种以保护脑组织免受缺血引发的连锁毒性反应的药物疗效未能在大型临床试验中被证明有效，唯一被认可的治疗方案和药物是消除形成的血栓，恢复血流灌注的组织型纤溶酶原激活剂(tPA)，可以防止进一步的缺血性损伤。然而，tPA只有在中风后几小时内使用有效，同时有脑出血的危险。因此，这种治疗药物被限用于每年中国高达200万例中风病人的百分之几。临床上有4种对缺血性卒中的治疗方法，即卒中单元、溶栓治疗、抗血小板治疗和抗凝治疗；有七类药物，第一类是血管扩张药(如潘生丁等)，第二类是改善微循环、扩充血容量的药物(如低分子右旋糖酐等)，第三类是溶解血栓的药物(如尿激酶等)，第四类是抗凝治疗(如肝素等)，第五类是使用钙离子拮抗剂(如尼莫地平等)，第六类是防止血小板凝聚的药(如阿司匹林等)，第七类是中药(安宫牛黄丸)。治疗手段和药品多和乱，很难说某个手段和某类药物对所有的缺血性脑卒中病人有良效，因此，减少中风后残疾的新药物仍然是临床上急需。其中激发大脑自身能力来恢复中风造成的损伤和防止中风后进一步的缺血性脑损伤是理想的治疗方法。目前未见报道将尤克那非用于抗缺血性脑卒中。

我们在研究中发现尤克那非改善大脑中动脉闭塞(MCA-O)大鼠的神经生成，减少神经功能缺损，实现功能恢复。实验证明MCA-O发生24小时后，持续7天给予尤克那非完全抑制PDE5活性，产生感觉运动功能完全恢复的效果，治疗效果持续3个月。尤克那非治疗延迟到MCA-O发生3天后，尤克那非治疗效果与上述MCA-O发生24小时后开始治疗的效果相同。但是尤克那非治疗贻误到MCA-O发生14天后，尤克那非治疗是无效。我们还发现治疗时间持续28或84天的治疗效果与持续治疗7天的效果相同，同时发现尤克那非治疗至少要持续一天以上，因为只使用尤克那非治疗1天的效果很差。我们确定在MCA-O发生后3天内施行尤克那非最大限度的抑制PDE5，并保持联续7天治疗，能够实现尤克那非促进中风患者康复最大治疗功效，并且没有脑出血等副反应。与目前临床最常用的组织型纤溶酶原激活剂(tPA)相比的优势是：1.尤克那非在缺血性脑卒中发生3天内使用有效，tPA必须在中风后几小时(一般3小时)内使用；2.tPA治疗只是防止进一步的缺血性损伤，尤克那非治疗不仅防止进一步的缺血性损伤，同时调动人体自身的恢复功能；3.tPA有脑出血的危险，尤克那非没有脑出血等副反应。

血小板粘合和激活在中风、心梗等血栓性疾病的发生中起着关键性作用。在正常的大鼠前脑，PDE5免疫反应在脑膜中动脉的平滑肌和小血管中占主导，在广为分散的皮质神经元和神经胶质细胞中有限。实验证实在MCA–O发生后24和48小时,在缺血性损伤的区域的血管、小胶质细胞和血小板中，PDE5表达上上升。同时PDE5-IR出现在大鼠前脑，与没有发生病变的区域比较，众多的梗死皮层，纹状体内血管中和大脑膜动脉中能检测到PDE5。

实验中我们观察到，服用尤克那非后cGMP在皮质和脑内水平显著增加。尤克那非治疗显著增加在脑室下区和齿状回的BrdU阳性细胞数量，和Tuj1(iii-tubulin)在同侧脑室下区和纹状体的免疫反应,使未成熟的神经元数量的增加。这是脑中cGMP水平增加促成血管生成和神经滋生的结果。尤克那非治疗增加血管生成和突触可塑性同样有助于中风后功能恢复。

cGMP的增加显然是由于尤克那非抑制PDE5的结果。鉴于疗效窗口和PDE5分布情况，尤克那非治疗效果来自对血管的作用、对血小板聚集抑制和调节小胶质细胞的功能，三者都有利于神经功能的恢复,同时尤克那非提升cGMP诱导的血小板响应是一个双向反应：(1)组成的一个早期刺激响应促进血小板活化，(2)跟随着是一个延迟的血小板抑制，限制血小板聚集体的尺寸。尤克那非通过对cGMP的代谢封锁，加强NO介导的抑制血小板粘附聚集防止和预防中风,心梗等血栓性疾病发展，同时不延长出血时间或引起全身性低血压。

本发明的一个实施方案中，中动脉闭塞(MCA-O)大鼠服用尤克那非(16mg/kg)组与服用盐水组相比，尤克那非显著改善大鼠神经功能的恢复。与服盐水的大鼠相比，尤克那非组增加了缺血边界脑血管密度和BrdU阳性内皮细胞。此外，尤克那非治疗的大鼠表现出比盐水组大鼠同侧更大SVZ细胞增殖。尤克那非治疗缺血性中风时改善功能的恢复和增强神经细胞生成。

尤克那非治疗缺血性脑卒中的特点是：1.尤克那非在缺血性脑卒中发生后72h之内开始使用并连续7天，与缺血性脑卒中发生后0-24小时内开始连续7天使用的治疗效果相同。这是目前任何一种缺血性脑卒中治疗药物都做不到的，因此尤克那非有宽达3天的治疗窗，能够囊括及时诊断和拖迟诊断等全部发生缺血性脑卒中的病人。2.尤克那非对全部缺血性脑卒中病人的功能恢复有效。实验观察到一般在上述治疗窗内开始使用尤克那非，到第3天功能改善即明显发生。因此是适合治疗所有缺血性脑卒中病人的药。3.尤克那非在治疗缺血性脑卒中时没有脑出血副反应。4.尤克那非治疗缺血性脑卒中的效果与产生缺血性脑卒中的阻塞机制无关，阻塞发生24小时后开始给药时观察不到对梗死面积的影响，因此尤克那非疗效作用来自它增加大脑自身能力来恢复卒中阻断作用造成的缺血性损伤，因此适合于所有的中风的治疗，是治疗中风的专用和特效药。

(2)本发明另一方面提供尤克那非在制备治疗心血管疾病药物的新用途。

内皮细胞处于血液和组织之间中，在维持正常生物学功能上有着举足轻重的地位，包括炎症、血小板聚集、血栓形成、血管平滑肌增殖和血管张力。内皮细胞受到各种体液，神经，和机械刺激后释放众多功能介质，最重要的是一氧化氮。血管内皮功能障碍时所有这些过程可以被改变，但主要改变是在一氧化氮水平，因此受NO制约的cGMP是心脏病理生理的一个关键要素，PDE5/cGMP/PKG通路在心血管系统中发挥作用的机制是通过增高细胞内cGMP水平，激活依赖cGMP的蛋白激酶(PKG)，对心肌肌钙蛋白Ⅰ的磷酸化作用加强，肌钙蛋白对Ca²+的亲合性下降，肌细胞膜上K+通道活性也下降，cGMP的蛋白激酶增强，从而导致血管舒张。能够降低全身平均动脉血压，控制全身各种血管床的静息张力，增加局部血流，是血压的主要调节通路。

我们研究发现尤克那非扩张心外膜冠状动脉，改善血管内皮功能障碍，并可以提高生理冠状动脉血管舒缩，显示在治疗血管内皮功能障碍疾病的作用。此外，尤克那非减少血小板IIb/IIIa受体的活化，具有抗局部缺血的效果。尤克那非改善NO生物利用度和心力衰竭时的血管舒张(HF)，增加心肌收缩力，钝化肾上腺素能刺激作用，降低左室后负荷，并改善肺弥散功能和肺血流动力学。证实尤克那非改善心力衰竭通风和有氧效率。因此，尤克那非是急性心肌梗死、心脏肥大、心脏衰竭和阿霉素心脏毒性的患者一个有前途的治疗方法。尤克那非是有希望的心血管保护药物。

本发明的一个实施例中首次证明尤克那非对I/R损伤心脏保护的作用。在兔的模型中，缺血前给予尤克那非，由缺血造成的梗塞面积显著减少，这是由于打开mitoKATP通道的效果。尤克那非也减少由坏死和分离的心肌细胞凋亡造成的细胞死亡，显示这种药物的细胞保护作用是独立的扩血管/降血压作用。

尤克那非疗效心血管疾病主要依赖于对血管内皮细胞功能的有益作用。除了抑制环磷酸鸟苷分解代谢，还刺激mRNA的转录诱导一氧化氮合成酶和内皮细胞一氧化氮合酶增加一氧化氮的产生，增加一氧化氮水平，改善冠脉血管内皮功能，增加冠状动脉血流量缓解患者的心绞痛、急性缺血、变异型心绞痛和心脏X综合征。减少急性冠脉综征的梗死面积，增加内皮祖细胞水平。

此外尤克那非具有预防和治疗动脉粥样硬化的作用。血管内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化的前兆。在血管内皮功能障碍发生时，有局部增强氧化应激，包括氧化低密度脂蛋白在动脉粥样硬化中发挥核心的作用。内皮功能障碍促进动脉粥样硬化的作用，可体现在一氧化氮合酶基因敲除小鼠上。16周高脂肪的饮食后，一氧化氮合酶基因敲除小鼠表现出主动脉内病变区增加动脉粥样硬化(93.6％相比于对照组的59.2％)。此外，所有的内皮型一氧化氮合酶基因敲除小鼠形成远端冠状动脉粥样硬化。内皮型一氧化氮合成酶基因敲除小鼠还发展出主动脉瘤(3/12只小鼠)和主动脉夹层(2/12只小鼠)。而对照组小鼠没有发生冠状动脉粥样硬化或动脉瘤。因此，内皮一氧化氮合酶/一氧化氮在维持血管完整性和预防动脉粥样硬化的进展中关键作用。

实验中我们发现每日服用尤克那非减弱缺氧野生型小鼠的肺动脉的肌化，但对内皮一氧化氮合酶基因敲除小鼠没影响。这些数据表明，内皮一氧化氮合酶/一氧化氮途径能够阻止肺小动脉肌化和增加血管阻力。因此，内皮一氧化氮合酶/一氧化氮是在维持血管完整性、防止动脉粥样硬化和防止肺动脉肌化的关键。尤克那非通过内皮一氧化氮合酶/一氧化氮/环磷酸鸟苷途径可能防止动脉粥样硬化的进展。尤克那非延缓动脉粥样硬化的进展在是从未见报道的。

尤克那非有利于肺循环和体血管扩张，增加心肌收缩力，改善血管内皮功能，并减少细胞凋亡、纤维化及肥大机制,包括NO、cGMP、蛋白激酶G、Bcl-2蛋白和Rho激酶抑制作用。在急性心肌梗塞动物模型中，尤克那非能够减少梗死面积，发挥心肌保护作用，也促进反向重构和减少心肌细胞凋亡、纤维化和肥大。尤克那非也可使难治性高血压、先兆子痫或外周动脉疾病患者受益，改善雷诺氏患者临床参数。因此我们的研究证明尤克那非适合于制造治疗心力衰竭，心绞痛(包括急性缺血，变异型心绞痛和心脏X综合征)、急性冠脉综合征、动脉粥样硬化和心脏保护的药物。

(3)本发明另一方面提供尤克那非在制备治疗肺血管疾病药物中的新用途。

PDE5在肺的表达比在心脏高15倍，近似在阴茎海绵体中表达的水平。PDE5在肺cGMP-PDE中是占主要地位的，比cGMP依赖性蛋白激酶(PKG)高5倍。在体内PKG负责磷酸化PDE5。在心脏的PDE5水平是PKG的二分之一。因此，PDE5在肺血管平滑肌的高表达为PDE5抑制剂治疗肺血管疾病提供了可靠的分子基础，使PDE5Is成为治疗肺循环和肥厚右心室疾病一线用药成为可能。尤其是对肺动脉高压(PAH)的治疗已经得到充分肯定，西地那非和他达拉非已经在全球用于治疗PAH。PAH的发病率约为2.4-7.6/百万人/年，患病率为15-26/百万人，但是真实患病率很难评估。其中心力衰竭(HF)是肺动脉高压(PH)最常见原因。其中高达60％的重症患者左室收缩功能不全，此外，PH折磨着70％的风湿性心脏瓣膜病患者。许多患者发展为慢性血栓栓塞性(CTEPH)或血栓栓塞症(PTE)。目前84％的肺心病归因于慢性阻塞性肺病，而且由于吸烟等原因，到2020年它将是第三大致死原因。门脉高压(PPH)是一个肺-肝血管紊乱疾病，折磨着大约5-6％的肝移植患者。

我们在动物模型上证明尤克那非对患肺动脉高压的充血性心脏衰竭有效。尤克那非改善了血流动力学、运动耐受量、6分钟步行距离和生存质量。除了肺血管舒张，尤克那非通过降低心脏衰竭病人的全身负荷而改善微循环和氧气的输送，而不会引起症状性低血压。尤克那非诱导血管扩张使高海拔肺动脉高压患者受益，防止登山者高海拔肺水肿的复发。通过改善数肢端流量，尤克那非降低雷诺氏病发作的频率和持续时间，并促进肢端溃疡的愈合。

尤克那非对肺血管疾病的治疗主要依赖于其对血管内皮细胞功能的有益作用。研究发现肺动脉高压患者的肺血管内皮细胞含有很少或几乎不表达内皮一氧化氮合酶。很少或没有内皮型一氧化氮合酶的动脉部分，表现出较强的内皮素1表达。内皮一氧化氮合酶/一氧化氮通路还可以防止肺动脉病变。实验中我们发现每日服用尤克那非可减弱缺氧野生型小鼠的肺动脉肌化，但对内皮一氧化氮合酶基因敲除小鼠没有作用。这些数据表明，内皮一氧化氮合酶/一氧化氮途径可阻止肺小动脉肌化和增加血管阻力。因此，内皮一氧化氮合酶/一氧化氮是维持血管完整性，防止肺动脉肌化的关键。尤克那非通过内皮一氧化氮合酶/NO/cGMP/PKG通路可能防止肺动脉肌化的进展，预防和治疗高原肺水肿和HAPH，降低雷诺氏病发作的频率和持续时间。

(4)本发明另一方面提供尤克那非在制备治疗神经系统疾病药物中的新用途。

有关L-Arg→NO途径在中枢神经系统(CNS)方面的研究认为NO/cGMP/PKG通路作用广泛。NO作为内皮源性舒张因子，NO-cGMP信号级联参与至关重要的CNS功能。NO也已经被认为是一个神经病理学递质，NO通过扩散，作用于相邻的周围神经元，例如突出前神经末梢和星状胶质细胞，激活GC来提高cGMP水平产生生理效应，介入调解兴奋性细胞死亡和神经炎症细胞的损伤过程。NO可诱导与学习、记忆有关的长时程增强效应(Long-termpotentiation，LTP)，并在LTP中起逆信使作用。cGMP被认为是记忆再巩固的必要因素。所有CNS实质细胞都有合成NO的能力，但只有神经元和星形胶质细胞表达NO/cGMP/PKG信号通路所需要的所有分子组成。这一途径调节星形胶质细胞的生理学，诸如钙稳态、基因表达和生存等重要方面。在外周神经系统，NO被认为是非胆碱能、非肾上腺素能神经的递质或介质，参与痛觉传入与感觉传递过程。NO在胃肠神经介导胃肠平滑肌松弛中起着重要的中介作用，在胃肠间神经丛中，NOS和血管活性肠肽共存并能引起非肾上腺素能非胆碱能(nonadrenergic-non-cholinerrgic，NANC)舒张，但血管活性肠肽的抗体只能部分消除NANC的舒张，其余的舒张反应则能被N-甲基精氨酸消除。

我们研究发现尤克那非全身给药改善抑郁症状，并通过抑制细胞凋亡减少神经细胞的死亡，减轻记忆障碍，增强了小鼠原有的学习保持性能。尤克那非通过参与和调节NO/cGMP/PKG通路，减轻神经小胶质细胞炎症，实现改善记忆、保持学习能力、改善抑郁、防止和治疗痴呆症状的作用。

(5)本发明另一方面提供尤克那非在制备治疗代谢性疾病药物中的用途。

世界上大约四分之一的人口忍受着代谢疾病(MetS)的折磨。1998年，世界卫生组织(WHO)把代谢疾病定义为高危病状。代谢疾病有多种诱发因素，其中最主要的因素是心血管(CVD)和胰岛素抵抗(insulin resistance)。

脂肪组织是能量储存的主要部位，成熟脂肪细胞被赋予了一个复杂的系统，能够根据人体的需要来细微调节游离脂肪酸氧化和进一步酯化成三酸甘油酯。在过去的几年中，脂肪组织在代谢性疾病发病过程中的重要性已得到越来越多的重视。事实上，脂肪组织的过度膨胀导致了胰岛素抵抗和糖尿病的发展，从而引发代谢综合征(MS)。因此，保持其生理健康对于避免局部和全身性疾病是非常重要的。

实验证明PDE5在人前脂肪细胞和脂肪细胞中有表达，NO/cGMP/PKG通路在脂肪细胞的生物学方面发挥重要作用，在脂肪细胞中，cGMP的关键调节作用是通过激活cGMP依赖性PKG，以影响脂肪的分解和芳烷化。PDE5负责水解cGMP，抑制PDE5的活性能激活芳香化酶，有益于内皮细胞和代谢功能，同时提高大鼠和小鼠涎腺睾酮水平，是实现更平衡脂肪组织的一种方法，因此通过抑制PDE5增加睾丸激素水平降低脂肪水平是治疗男性代谢综合征一个新手段。

PDE5是NO/cGMP/PKG通路的一部分。实验表明通过增加cGMP在白色脂肪组织(WAT)中的水平导致细胞对葡萄糖和甘油三酯摄取的增强，激活芳香化酶，减少巨噬细胞/炎症对组织的浸润，增加产热，控制和治疗代谢综合征。因此，脂肪细胞组织中的PDE5与全身系统代谢具有不可分割的关系，PDE5是扭转代谢综合征、维持脂肪组织健康的有效靶点。PDE5在脂肪细胞中的作用可能揭示了治疗肥胖和代谢综合征新的新策略。PDE5的作为一种新型的效应分子，能够影响脂肪细胞的多种功能，因此可能成为一种用于MS治疗的很有前途的新靶点。

本发明提供了证明PDE5在体内参与胰岛素信号传导和尤克那非调整NO/cGMP/PKG通路有助于防止和治疗代谢综合症的一个实验例。在饮食诱导的胰岛素抵抗性小鼠模型中，服用尤克那非可逐渐改善胰岛素敏感度，同时伴随动脉cGMP水平升高，显示空腹胰岛素和葡萄糖水平减少。尤克那非的这个作用是通过抑制NO/cGMP/PKG通路中PDE5的活性，升高cGMP水平实现的。

(6)本发明另一方面提供尤克那非在制备治疗在泌尿及生殖系统疾病药物中的用途

PDE5在下尿路(LUT)中大量表达，NO/cGMP/PKG通路直接或间接地调节人LUT的平滑肌张力，包括前列腺，膀胱，膀胱颈和尿道平滑肌的收缩，在LUT的组织舒张反应中发挥核心作用，是排尿节制等生理功能的重要调节物质。因此，NO/cGMP/PKG通路是预防和治疗与LUT相关症状药物的理想靶点。因为男性LUT的生理目的是储存和释放尿液，在一定程度上也依赖于尿道前壁(阴茎)部分平滑肌组织的活性，药物靶向这些特定的结构有助于促进流出区域的正常功能。在缺血/泌尿生殖道缺氧的动物模型中，尤克那非能够增加膀胱和前列腺组织的机能。

本发明的一个是实例是尤克那非对离体男性尿道组织张力的作用，以及对cGMP和cAMP在尿道组织中产生量的影响。实验证明尿道对刺激NO/cGMP/PKG途径的尤克那非很敏感，同时观察到尤克那非作用与组织中cGMP水平呈正比。因此尤克那非可以用来治疗下尿路综和症状(LUTS)和改善良性前列腺增生(BPH)患者的排尿。

(7)本发明另一方面提供尤克那非在制备免疫增效药物中的新用途。

当前认为，经T细胞激活的巨噬细胞释放的NO可以通过NO/cGMP/PKG通路抑制靶细胞线粒体中三羧酸循环、细胞DNA合成等途径，发挥杀伤靶细胞的效应。免疫反应所产生的NO对邻近组织和能够产生NOS的细胞也有毒性作用。某些与免疫系统有关的局部或系统组织损伤、血管和淋巴管的异常扩张及通透等，可能都与NO在局部的含量有着密切的关系。研究还发现PDE5抑制剂增加T细胞中cGMP水平。因此NO/cGMP/PKG通路直接和间接地参与免疫功能的调节。

本发明的一个是实例使用尤克那非作为抗肿瘤免疫反应的调节剂，在小鼠肿瘤模型中，逆转肿瘤引起的免疫抑制机制，并产生抗肿瘤免疫反应，从而延缓肿瘤进展。实验证明尤克那非下调精氨酸酶1和一氧化氮合酶-2表达，从而降低生长中的肿瘤的免疫抑制的功能。通过消除这些肿瘤的逃逸机制，尤克那非提高肿瘤内T细胞的浸润和活化，减少肿瘤生长，并提高过继性T细胞抗肿瘤功效。在体外，尤克那非恢复骨髓瘤和头颈部癌症患者外周血单核细胞和T细胞增殖。这些研究结果表明了尤克那非在肿瘤特异性免疫治疗中的新用途。实验证明尤克那非增强替莫唑胺，伊马替尼，吉非替尼，紫杉醇，利妥昔单抗，贝伐珠单抗，曲妥珠单抗的抗癌活性。

(8)本发明另一方面提供尤克那非与其他药物联合使用增强对NO/cGMP/PKG通路参与的生物病理过程的疾病的治疗效果的新用途

尤克那非与一个a-肾上腺素能受体拮抗剂联合使用可增强调节和治疗勃起功能障碍的作用，其中a-拮抗剂的实例包括阿夫唑嗪、吲派胺、萘哌地尔、酚妥拉明、坦洛新、氯哌三唑酮、哌吡三唑、苯氧苄胺、咪唑克生、依洛克生、育亨宾，罗芙木碱和Recordati 15/2739及其制药学上可接受的盐类。其中，苯氧苄胺、酚妥拉明、氯哌三唑嗣和哌吡三唑是对a2-受体非选择性的，罗芙木碱、咪唑克生、依洛克生和育亨宾对a2-受体具有选择性。

另外尤克那非与抑制Rho激酶拮抗作用协同，增强高血压型男性勃起反应。自发性高血压(SHR)大鼠神经性勃起反应与正常血压大鼠的比较实验证实雄性勃起功能与环鸟苷酸通路及Rho激酶的通路关联。同正常血压大鼠相比，SHR大鼠阴茎海绵体压力的静息基准较低，但是发生勃起阈值很高。实验考察了动物海绵体内注射Rho激酶抑制剂Y–27632，和注射Y–27632加尤克那非的前与后的SHR模型动物勃起功能。在SHR中，Y-27632逆转胸性勃起与高血压相关的变化；Rho激酶拮抗作用和抑制PDE5结合在改善神经性勃起反应有协同作用。我们的数据表明，高血压与自发性高血压大鼠神经性勃起响应缺损相关，这可能与阴茎勃起组织的血流动力学机制紊乱有关。因此Rho激酶抑制剂单独或联合尤克那非是有价值的治疗高血压ED的新方法。

尤克那非和血管扩张剂前列环素(PGI2)联合使用治疗肺动脉高压(PAH)。尤克那非加强前列环素受体(IPR)介导强效血管扩张剂和三磷酸腺苷从红细胞的释放。因此PGI2受体激动剂和尤克那非剂联合使用对PAH的治疗提供一种新的协同作用方案。

另外尤克那非与利钠肽协同作用也可以改善肺动脉高压。PDE5抑制剂是肺动脉高压患者的选择性肺血管扩张剂，研究发现这个作用是利钠肽生物活性依赖性的。同PDE5抑制剂一样利钠肽也参与cGMP的调节。在利钠肽引起的降压过程中，我们研究了尤克那非对此过程的影响，结果证明尤克那非可增强利钠肽对肺动脉的降压作用，但不会增强利钠肽对体循环的降压作用。此研究结果意外揭示了尤克那非的一个新用途，即与利钠肽联合使用增强治疗肺动脉高压效果。在缺氧诱导的肺动脉高压模型中，PDE5抑制剂和中性内肽酶(NEP)抑制剂依卡曲尔(增加内源性利钠肽的水平)产生cGMP依赖性的协同作用，在无显著影响全身血压情况下减少肺动脉高压的严重程度指数。

我们数据表明，PDE5是肺部ANP的cGMP介导的非全身性的血管舒张机制中关键调节因子，是尤克那非对肺选择性的物质基础。因此尤克那非和中性内肽酶抑制剂利钠肽联合使用是增强治疗肺动脉高压效果的新途径。

本发明中尤克那非口服给药和制剂如同我们的国际专利申请WO2004108726的说明书中描述。注射给药在实施例中也给予了说明，例如静脉内、动脉内、腔内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌内或皮下，或者可以利用输注或无针注射技术给药。口腔给药已在陈松杰博士论文中详尽论述(Polymeric Films for Buccal Drug Delivery，Songjie Chen，Doctor of Philosophy ASTON UNIVERSITY June 2009)。透皮和粘膜给药以凝胶剂、乳膏剂、洗剂、滴剂(包括滴鼻剂、滴耳剂及滴眼剂)或散剂的形式局部用药，或栓剂局部给药，或者通过透皮贴剂给药，或者通过舌下或颊部粘膜给药。

附图说明

图1尤克那非的化学结构；

图2PDEs/cGMP/PKG通路生物功能。注释：NO：一氧化氮；sGC：水溶性鸟苷酸环化酶；GTP：三磷酸鸟苷；cGMP：环磷酸鸟苷；PDE：磷酸二酯酶；PKG：蛋白激酶；CNG：环核苷酸门控制通路；

图3大鼠行为能力、神经功能缺损、脑梗死体积和脑水肿评价结果。IP-20：5-24氨基三氟醋酸盐盐，蛋白激酶A(PKA)抑制剂；ODQ：1H-[1,2,4]-Oxadiazolo-[4,3-a]-quinoxalin-1-1，鸟苷酸环化酶抑制剂；DT-3：cGMP蛋白激酶(PKG)抑制剂。n＝6,mean±S.D.

图4尤克那非对低氧引起的肺动脉高压的影响。组1：对照组(正常压)；组2：肺动脉高压+安慰剂(口服生理盐水，低氧环境4天前起，持续18天)；组3：肺动脉高压+尤克那非(口服5mg/kg/d，低氧环境4天前起，持续18天)；组4：肺动脉高压+尤克那非(口服15mg/kg/d，低氧环境4天前起，持续18天)；组5：肺动脉高压+安慰剂(口服生理盐水，低氧环境14天后起，持续12天)；组6：肺动脉高压+尤克那非(口服5mg/kg/d，低氧环境14天后起，持续12天)；组7：肺动脉高压+尤克那非(口服15mg/kg/d，低氧环境14天后起，持续12天)。n＝6,mean±S.D.

图5尤克那非对3-NP引起的神经退行性自发性活动力降低的保护作用(n＝6,mean±S.D.)。

*P＜0.05，与生理盐水组相比；

图6尤克那非对3-NP引起的运动功能失常的保护作用(n＝6,mean±S.D.)。

*P＜0.05，与生理盐水组相比；

图7尤克那非对3-NP引起的握持力减弱的保护作用(n＝6,mean±S.D.)。

*P＜0.05，与生理盐水组相比；

图8静脉葡萄糖耐量试,结果：体内葡萄糖水平。组1：腹腔注射尤克那非5mg/kg/d，持续6周；组2：腹腔注射尤克那非15mg/kg/d，持续6周；组3：安慰剂组，腹腔注射生理盐水，持续6周；组4：空白对照。n＝6,mean±S.D.

图9静脉葡萄糖耐量试验结果：体内胰岛素水平。组1：腹腔注射尤克那非5mg/kg/d，持续6周；组2：腹腔注射尤克那非15mg/kg/d，持续6周；组3：安慰剂组，腹腔注射生理盐水，持续6周；组4：空白对照。n＝6,mean±S.D.

图10静脉胰岛素耐量试验结果：体内血糖水平。组1：腹腔注射尤克那非5mg/kg/d，持续6周；组2：腹腔注射尤克那非15mg/kg/d，持续6周；组3：安慰剂组，腹腔注射生理盐水，持续6周；组4：空白对照。n＝6,mean±S.D.

图11大鼠高胰岛素-正葡萄糖钳夹术中的葡萄糖输注率(GIR)。n＝6,mean±S.D.

图12去甲肾上腺素(NE)引起显著的组织收缩力增加。n＝6,mean±S.D.

图13对照药佛司可林和硝普钠对组织收缩的反转作用。n＝6,mean±S.D.

图14 CNP和尤克那非对组织收缩的反转作用。n＝6,mean±S.D.

图15尤克那非对肿瘤生长的影响。A：BALB/c小鼠，CT26WT移植瘤；B：BALB/c小鼠，TS/A移植瘤；C：BALB/c-Rag-2^-/-小鼠，CT26WT移植瘤；D：BALB/c-Rag-2^-/-小鼠，TS/A移植瘤。组1：生理盐水,i.p.；组2：尤克那非20mg/kg/d,i.p.；组3：多柔比星2mg/kg/d,i.v.；组4：多柔比星2mg/kg/d,i.v.+尤克那非20mg/kg/d,i.p.；n＝6,mean±S.D.

图16大鼠足底热痛觉试验PWL测定结果。组1：术前30min，吗啡3mg/kg，s.c.；组2：术前1h，加巴喷丁10mg/kg，s.c.；组3：术前1h，尤克那非10mg/kg，s.c.；组4：术前1h，尤克那非20mg/kg，s.c.；组5：对照组，术前1h，生理盐水，s.c.。n＝6,mean±S.D.

图17尤克那非(3μM)对ANP引起的胸主动脉或肺动脉舒张的影响。n＝6,mean±S.D.

图18尤克那非(3μM)对SPER-NO引起的胸主动脉或肺动脉舒张的影响。n＝6,mean±S.D.

图19尤克那非(3μM)对ANP引起的肠系膜小动脉或肺小动脉舒张的影响。n＝6,mean±S.D.

图20尤克那非(3μM)对SPER-NO引起的肠系膜小动脉或肺小动脉舒张的影响。n＝6,mean±S.D.

具体实施方式

【实施例1】尤克那非在制备用于治疗缺血性脑卒中的药物中的应用

方法：

实验动物：雄性SD大鼠，体重270-300g。

缺血性脑卒中模型和分组：大鼠实施右侧中脑动脉闭塞(MCAO)(中脑动脉根部放置栓塞)后，实施再灌注(I/R)1天或7天。实验动物随机分为以下实验组：空白对照组(生理盐水，10ml/kg)、MCAO组(大鼠实施I/R后给予生理盐水)、MCAO/尤克那非组(大鼠实施I/R后，分别于2h、4h或6h后开始腹腔或静脉注射尤克那非)、MCAO/抑制剂/尤克那非组(大鼠实施I/R。MCAO后立刻给予蛋白激酶抑制剂，2h后给予尤克那非)。评价指标为：行为能力、神经功能缺损、脑梗死体积和脑水肿。

结果：

脑局部缺血会对大鼠造成严重的行为失调。试验结果(图3)表明，尤克那非治疗组的大鼠获得更高的平衡木行走分数和滚木行走时间。MCAO组的神经损伤、脑梗死体积和脑水肿显著高于空白对照组，并可以显著地被尤克那非逆转，即使是MCAO实施4小时候给药仍然如此。另外，尤克那非对脑梗死体积的减少具有剂量依赖性，其ED₅₀为12.27mg/kg。而当同时给予蛋白激酶抑制剂(IP-20、ODQ或DT-3)时，尤克那非所带来的神经功能、脑含水率和梗死体积的改善被显著地逆转。说明尤克那非和NO/cGMP/PKG通路在上述功能改善中的关键作用。

结论：尤克那非在制备用于治疗缺血性脑卒中的药物中具有显而易见的潜在应用。

【实施例2】尤克那非在制备心血管保护(抗心肌梗死)药物中的应用

方法：

实验动物：雄性新西兰白兔(体重2.8–3.3kg)。

分组：实验动物被随机分为以下实验组：

第1组：空白对照组，术前给予生理盐水；

第2组：术前30min静脉注射尤克那非0.5mg/kg；

第3组：术前24h静脉注射尤克那非0.5mg/kg；

第4组：术前10min静脉注射线粒体K_ATP通道阻断剂5-羟基癸酸(5-HD)5mg/kg；

第5组：术前30min静脉注射尤克那非0.5mg/kg，术前10min静脉注射5-HD 5mg/kg；

第6组：术前24h静脉注射尤克那非0.5mg/kg，术前10min静脉注射5-HD 5mg/kg。

梗死造模手术：家兔肌肉注射盐酸氯胺酮(35mg/kg)和赛拉嗪(5mg/kg)进行麻醉，同时注射阿托品以保持心率的升高。实施颈静脉插管，持续输注生理盐水。颈动脉插管进行血液采样和动脉压检测。血液循环稳定后，进行左侧胸廓切开术，用无创针头穿线绕过左前降支动脉(房室沟和尖端之间)。以勒除器勒紧左前降支动脉使之闭塞30min，然后松开勒除器使之恢复。可观察到局部发绀、心电图的ST抬升或降低、T波倒置、心肌层运动机能减退和运动障碍等征状以确定心肌梗死的形成。心脏再灌注180min，使之前的缺血区域恢复供血。上述缺血-再灌注流程完成后，注射500单位肝素，分离心脏，重新束紧冠状动脉的扎结，自主动脉注射10％伊万蓝溶液约2ml直至心脏大部分变蓝。以生理盐水洗去过量的伊万蓝溶液，冷冻后切片，在1％氯三苯四唑(TTC)溶液中37℃培养20min。未梗死细胞会被染色成深红色，而梗死区域未被染色，为白色或灰色，得以鉴别。然后，切片以10％甲醛溶液固定，通过计算机成像技术计算梗死面积，以百分数表示。

结果：

心肌梗死面积测定结果如表1所示，静脉注射给予尤克那非0.5mg/kg后，对心肌细胞表现出显著的保护作用，术前30min静脉注射(组2)和术前24h静脉注射(组3)的心肌梗死面积由空白对照的38.8％分别下降至11.7％和21.4％。而当术前以5-HD阻断线粒体K_ATP通路时，尤克那非对心肌细胞不再有保护作用(组5、组6)，心肌梗死面积与空白对照无显著区别，提示尤克那非的抗心肌梗死作用是通过K_ATP通路发挥作用的。

表1尤克那非对心肌梗死造模家兔的心肌保护作用。n＝6,mean±S.D.

实验组	心肌梗死面积(％)
		1	38.8±3.7
2	11.7±2.1*
		3	21.4±2.8*
4	38.1±3.0
		5	39.8±2.4
6	37.6±2.6

*P＜0.05，与组1相比

结论：尤克那非对缺血导致的心肌梗死有显著的保护作用，其机制是通过线粒体K_ATP通路发挥作用，因此尤克那非在制备相关药物时具有有价值的用途。

【实施例3】尤克那非在制备抗肺动脉高压药物中的应用

方法：

实验动物：雄性SD大鼠，体重270-300g。

分组：

第1组：对照组(正常压)

第2组：肺动脉高压+安慰剂(口服生理盐水，低氧环境4天前起，持续18天)

第3组：肺动脉高压+尤克那非(口服5mg/kg/d，低氧环境4天前起，持续18天)

第4组：肺动脉高压+尤克那非(口服15mg/kg/d，低氧环境4天前起，持续18天)

第5组：肺动脉高压+安慰剂(口服生理盐水，低氧环境14天后起，持续12天)

第6组：肺动脉高压+尤克那非(口服5mg/kg/d，低氧环境14天后起，持续12天)

第7组：肺动脉高压+尤克那非(口服15mg/kg/d，低氧环境14天后起，持续12天)

肺动脉平均压的测定：使用植入式无线电遥感器测定大鼠的肺动脉平均压。连接有发射器的充液感应导管被用来向远端接收器发送信号，再经过计算机处理。大鼠麻醉后，分别实施胸廓切开术和腹部正中切口。以17号静脉针将感应导管从腹腔穿引至胸腔，将信号发射器置于腹腔的肌肉层，感应导管的尖端进入右心室，直至推入到肺动脉。接收器正常接收到脉冲信号后，缝合胸腔和腹腔切口。每只大鼠置入单独的鼠笼，每30min记录一次肺动脉压。每只大鼠至少经过10天的恢复期。

通过低氧环境(10％O₂)诱导形成肺动脉高压。大鼠被暴露于低氧环境总共14-28天。

结果：

动物暴露于低氧环境14d肺动脉平均压显著升高(组2)，逐渐形成肺动脉高压(图4-A)。与组2相比，尤克那非提前4d给药组(组3、组4)表现出对肺动脉高压的显著的抑制(图4-B)，而高剂量组(15mg/kg/d)的抑制作用显著强于低剂量组(5mg/kg/d)。证明了尤克那非在预防肺动脉高压形成中的作用及其剂量相关性。在尤克那非滞后给药的情况下(组5、6、7)，尤克那非仍然能抑制已被诱发的肺动脉高压(图4-C)，且在高剂量的情况下(15mg/kg/d)表现出更显著的抑制作用。

结论：证明了尤克那非在治疗肺动脉高压中的作用，提示尤克那非可被用于制备治疗或预防肺动脉高压的药物。

【实施例4】尤克那非在制备预防阿尔茨海默病药物中的应用

方法：

实验动物：雄性SD大鼠，体重270-300g。

分组：

第1组：口服尤克那非5mg/kg/d，持续28d；

第2组：口服尤克那非15mg/kg/d，持续28d；

第3组：口服生理盐水，持续28d；

第4组：空白对照组(只进行常规饲养，不造模)。

阿尔茨海默病(AD)造模：大鼠腹腔注射乌拉(33mg/kg)坦实施麻醉，将头部置于脑立体定位仪上，去毛备皮，切开颅骨皮肤，定位脑NBM核，Bregma点向后1.8mm，正中旁开2.8mm，硬脑膜下7.0mm，采用微型电钻，左右对称各钻一孔(直径0.8mm)，由微注射泵每侧分别注射β淀粉样蛋白(Aβ_1-40)4μg和鹅膏蕈氨酸(IBO)2μg，20min内注射完毕，留针10min。双侧注射完毕后，缝合皮肤，给予14d的恢复期。

给药方法：大鼠灌胃给予尤克那非5mg/ml溶液，每天1次，造模前持续给药14d，造模后继续给药14d，总计28d。

AD检测方法：定位航行试验：采用Morris水迷宫装置，试验历时4天，第1天大鼠自由游泳(随机如水点如水)2min，池中无平台，观察大鼠的游泳速度及泳姿，剔除不合格的大鼠。从第2天起，每天分为两个训练时段(间隔大于8小时)，每个训练时段训练4次，每次均由不同象限入水点入水，观察大鼠寻找并爬上平台所需时间(即逃避潜伏期)。如超过120s则逃避潜伏期记为120s。

结果：

(1)造模前大鼠水迷宫定位航行试验测试结果：大鼠在造模前先进行测试，结果见表2。结果显示，造模前各组大鼠在第2天均可出现逃避潜伏期的大幅下降，第3、4天趋向稳定，表明了学习和记忆能力。分别计算训练末两天和全部训练时间内的平均逃避潜伏期，各组间无显著差异。

表2大鼠造模前水迷宫定位航行试验结果(n＝6,mean±S.D.)

(2)造模后大鼠水迷宫定位航行试验测试结果：大鼠造模术后两周，各组末2天平均逃避潜伏期和全时段平均逃避潜伏期较空白对照组均出现不同程度的延长，验证了AD造模对认知和记忆功能的损伤(表3)。给药组(组1，尤克那非5mg/kg/d和组2，尤克那非15mg/kg/d)的末2天和全时段平均逃避潜伏期均较生理盐水组有显著缩短，而组1和组2之间无显著差别。

表3大鼠造模后水迷宫定位航行试验结果(n＝6,mean±S.D.)

*P＜0.01，与空白对照组相比

**P＜0.05，与生理盐水组相比

结论：试验结果提示大鼠口服尤克那非5mg/kg/d或15mg/kg/d剂量显著降低了AD造模对大鼠认知和记忆功能的损伤，表明尤克那非在制备预防阿尔茨海默病药物中具有潜在应用。

【实施例5】尤克那非在制备神经保护药物中的应用

亨廷顿氏舞蹈病(HD)是一种中枢神经退行性病变，由基因突变引起，是一种家族显性遗传型疾病。患者由于基因突变或者第四对染色体内DNA(脱氧核糖核酸)基质之CAG三核甘酸重复序列过度扩张，造成脑部神经细胞持续退化，机体细胞错误地制造一种名为“亨廷顿蛋白质”的有害物质。这些异常蛋白质积聚成块，损坏部分脑细胞，特别是那些与肌肉控制有关的细胞，导致患者神经系统逐渐退化，神经冲动弥散，动作失调，出现不可控制的颤搐，并能发展成痴呆，甚至死亡。本试验通过3-硝基丙酸(3-NP)诱导的大鼠HD模型，评价PDE-5抑制剂尤克那非对中枢神经的保护作用。

方法：

实验动物：雄性SD大鼠，体重270-300g。

动物分组：

第1组：口服尤克那非5mg/kg/d，持续14d；

第2组：口服尤克那非15mg/kg/d，持续14d；

第3组：口服生理盐水，持续14d；

第4组：空白对照组(只进行常规饲养，不造模)。

HD模型造模：大鼠连续腹腔注射3-NP共14天(10mg/kgi.p.)，每次注射1h后，给药组口服灌胃给予尤克那非5mg或15mg(生理盐水溶液，5mg/ml)，对照组给予相应体积的生理盐水。

自发性活动力测试：在第1、8和15天每只动物分别测试其自发性活动力。大鼠被置于30cm×30cm的方形塑料盒中，用装有数码计数器的红外传感摄像机记录大鼠的活动次数。肢体退出测试：测试大鼠的肢体行为，动物被置于20cm高的30cm×30cm的有机玻璃平台上，平台含有4个圆孔，两个5cm直径的孔对应后肢，两个4cm的孔对应前肢。将大鼠的后肢、前肢先后置于孔中。记录大鼠抽出第一支后肢和第二支后肢的撤回时间，并记录两个时间的差值。此差值是评价运动功能失常的重要指标，与皮质纹状体脊髓变性的程度直接相关。每只动物分别测试3次，每次间隔45min，记录平均值。

钢丝悬挂试验：将长35cm、直径2mm的钢丝固定于50cm高度，钢丝下方有保护垫保护。大鼠前爪抓住钢丝，记录大鼠保持悬挂的时间。此时间可反映大鼠的握持力。

结果：

(1)自发性活动力测试：自发性活动力测试试验分别测试了给药前、给药中期和给药后期大鼠的自发活动情况，结果见图5。可见，在给药前，4组大鼠的自发性活动情况无显著差别，而当腹腔注射3-NP至第8天(Day8)时，自发性活动力显著下降，至第15天时，下降最明显。而当注射3-NP同时口服尤克那非时，自发性活动的下降得到了缓解，组1和组2显著高于组3，而且组2略高于组1。可见，尤克那非降低了3-NP对神经组织的损伤，起到了神经保护的作用，并于剂量呈一定的正比关系。

(2)肢体退出测试：肢体退出测试用来评价大鼠的运动功能，间接反映神经系统的损伤程度。试验结果表明，连续腹腔注射3-NP显著延长了大鼠后肢的撤回时间(图6)，组3的生理盐水组的撤回时间显著长于未注射3-NP的空白对照组(组4)。而当腹腔注射3-NP时同时给予口服尤克那非，则观察到撤回时间显著低于生理盐水组，可见尤克那非可抑制3-NP引起的运动功能失常，提示其具有神经保护作用。

(3)钢丝悬挂试验：

握持时间可评价大鼠运动神经功能的完整度。试验结果表明，连续腹腔注射3-NP显著缩短了大鼠的悬挂时间(图7)，表明握持力减小，神经功能损伤(组3)。而当腹腔注射3-NP时同时给予口服尤克那非，则观察到握持时间显著延长，可见尤克那非可用于保护神经功能的完整，抑制3-NP带来的神经损伤。

结论：尤克那非在制备神经保护药物中具有显而易见的潜在应用。

【实施例6】尤克那非在制备治疗糖尿病的药物中的应用

方法：

实验动物：雄性SD大鼠(体重120-130g)，随机分为正常饲养组和高脂肪饲养组，饲养10周。

分组：高脂饲养组大鼠随机分为3组，分别为：

组1：腹腔注射尤克那非5mg/kg/d，持续6周；

组2：腹腔注射尤克那非15mg/kg/d，持续6周；

组3：安慰剂组，腹腔注射生理盐水，持续6周；

而正常饲养组作为空白对照组，即组4：腹腔注射生理盐水，持续6周。

导管植入术：给药周期完成后，大鼠腹腔麻醉，实施左侧颈动脉和右侧颈外静脉导管植入，术后恢复7天，恢复正常的大鼠入组选为研究对象。

静脉葡萄糖-胰岛素耐量试验(IVGTT)：静脉推入25％葡萄糖(0.5g/kg)，在0、5、10、15、30、60、120min取血1ml检验，测定血糖(BG)和胰岛素(Ins)水平。

高胰岛素-正葡萄糖钳夹术：大鼠空腹12h，用三通阀连接动脉导管，经动脉导管输入葡萄糖及胰岛素，由静脉导管抽取血液样本。于钳夹开始时(0min)由动脉导管一次性给予6μCi3-³H葡萄糖，随后以0.2μCi/min的速度输注直至钳夹结束。在60min血浆与组织3-³H葡萄糖的代谢已经达到平衡状态时，抽取血液标本测定基础葡萄糖利用率(G_Rd)。随后以6mU/Kg/min的速度输注胰岛素和25％的葡萄糖。每5-10分钟检测血糖，并根据血糖调整外源性葡萄糖的输注率，使血糖控制在4.5-5.5mmol/L。在0、60、140、160、170、180min分别取血样0.8ml，测定3-³H葡萄糖、血浆游离脂肪酸(FFA)和胰岛素等。采用液体闪烁计数法测定3-³H葡萄糖比活性。酶联免疫法测定血浆脂联素。

结果：

各组基础生化指标：见表4。

表4各组大鼠基础生化指标比较。组1：腹腔注射尤克那非5mg/kg/d，持续6周；组2：腹腔注射尤克那非15mg/kg/d，持续6周；组3：安慰剂组，腹腔注射生理盐水，持续6周；组4：空白对照。LI：Lee氏指数；BG：血糖；Ins：胰岛素；FFA：游离脂肪酸；TG：甘油三酯；TC：总胆固醇；ADI：脂联素。n＝6,mean±S.D.

*P＜0.05，与组3比较；**P＜0.05，与组2比较；^#P＜0.05，与组4比较。

结果表明，各组间基础血糖与基础胰岛素水平无显著差异，而高脂肪饲养大鼠(组3)的LI、FFA、TG和TC显著高于对照组(组4)，ADI显著低于组4，而尤克那非5mg/kg/d组(组1)和尤克那非5mg/kg/d(组2)的LI、BG、FFA、TG和TC显著低于组3，ADI显著高于组3，其中组1的LI和TC显著高于组2，ADI显著低于组2。表明尤克那非对高脂肪饲养大鼠的各项生化指标有影响，显著抑制了高脂肪饲料带来的影响。并且与用药剂量有一定的正相关关系。

静脉葡萄糖耐量试验结果见图8和图9。静脉葡萄糖刺激后各组血糖水平迅速升高(图8)，大约在5min是达到高峰，但组2(尤克那非15mg/kg剂量组)和组4(空白对照组)显著低于组1和组3，并且组1低于组3，说明尤克那非抑制了血糖水平的升高，且呈现剂量依赖关系。而除组3外，其余各组的血糖水平均在30min恢复基础水平，而组3在60min恢复基础水平。组2和组4在葡萄糖刺激后胰岛素水平的升高显著高于组3(图9)，5min达到最高峰，此后迅速下降，约30min达到基础水平；而组1的升高幅度小于组2，但高于组3。组1和组3的胰岛素水平下降更迅速，约15min达到基础水平。

静脉胰岛素耐量试验结果见图10。四组大鼠的基础血糖无显著性差异(0min)，而当静脉胰岛素刺激后，各组血糖均出现下降，其下降幅度为组2＞组4＞组1＞组3，其中安慰剂组(组3)降血糖速度最缓慢，而经尤克那非5mg/kg/d治疗后(组1)，降血糖速度显著加快，而尤克那非15mg/kg/d组(组2)进一步加快了降血糖速度，已与空白对照组无显著差别。

高胰岛素-正葡萄糖钳夹术结果：

稳态时各生化指标比较(表5-表7)：大鼠高胰岛素-正葡萄糖钳夹术中各组血糖水平均维持在基础值附近。在胰岛素输注情况下，胰岛素水平均显著升高，组2、组4在160min达到稳态，而组3在160min出现最高峰，且显著高于另外两组；而组2和组4之间差异不大。三组大鼠的血浆FFA值在钳夹中均受到抑制，但组3的FFA水平始终显著高于另外两组，组2的FFA水平虽然显著高于组4，但同时也显著低于组3，表明了尤克那非对FFA水平的抑制作用。

表5大鼠高胰岛素-正葡萄糖钳夹术中的血糖水平(BG)。n＝6,mean±S.D.

*P＜0.05，与组3比较；**P＜0.05，与组4比较；^#P＜0.01，与组4比较。

表6大鼠高胰岛素-正葡萄糖钳夹术中的胰岛素水平(Ins)。n＝6,mean±S.D.

*P＜0.05，与组3比较；**P＜0.05，与组4比较；^#P＜0.01，与组4比较。

表7大鼠高胰岛素-正葡萄糖钳夹术中的游离脂肪酸水平(FFA)。n＝6,mean±S.D.

*P＜0.05，与组3比较；**P＜0.05，与组4比较；^#P＜0.01，与组4比较。

稳态时糖代谢指标比较：

大鼠高胰岛素-正葡萄糖钳夹术稳态时糖代谢指标见图11和表8。在稳态时，组3的葡萄糖输注率GIR显著低于组4，并且显著低于组2。组2的GIR仅略低于组4(图11)。各组的基础G_Rd和基础HGP没有显著差异(表8)。而钳夹稳态时，各组的G_Rd均较基础时显著升高，而组3的G_Rd显著低于组2和组4；组2和组4之间无显著差异。对于各组的HGP，在稳态时组2和组4的HGP均出现大幅度的抑制，而组3仅出现了小幅度的抑制(表8)。表明尤克那非15mg/kg/d(组2)显著改变了高脂饲养大鼠的高胰岛素-正葡萄糖钳夹术时的糖代谢指标，已十分接近正常饲养的大鼠。

表8大鼠高胰岛素-正葡萄糖钳夹术中的稳态糖代谢指标。n＝6,mean±S.D.

*P＜0.05，与组3比较；**P＜0.05，与组4比较

结论：

高脂饲养的大鼠在同时给予尤克那非时糖脂代谢得到明显改善，增加了体内胰岛素水平，血脂下降。

高脂饲养的大鼠在经过尤克那非连续给药之后，G_Rd、GIR得到显著提高，胰岛素对肝糖输出(HGP)的抑制作用显著强于未给药对照组，表明尤克那非改善了胰岛素敏感性。高脂饲养大鼠的血浆脂联素低于正常水平，而同时给予尤克那非时其血浆脂联素水平显著升高达到正常水平。因此，机体的胰岛素敏感性显著增高，阻止了胰岛素抵抗性的形成。

【实施例7】尤克那非在制备抗治疗在泌尿及生殖系统疾病药物中的应用

在本实施例中，评价了尤克那非对离体尿道组织张力的作用，以及对cGMP和cAMP在尿道组织中产生量的影响。

方法：

实验材料：雄性猪离体尿道组织。

组织浴槽试验：将尿道组织切割成约8mm×4mm的条状。将组织置于垂直组织浴槽之上，浴槽供给池中装有10ml林格缓冲液(PH7.4)，37℃保温，并持续供给95％氧气和5％二氧化碳混合气体。对尿道组织施以1g的力，并使之持续受力平衡1h。供给池中加入10μM去甲肾上腺素(NE)引起组织收缩。1nM-1μM的C-尿钠肽(CNP)、腺苷酸环化酶激动剂佛司可林(forskolin)和一氧化氮供给剂硝普钠(SNP)作为对照药物引起组织舒张。分别给予0.01-10μM尤克那非作为组织舒张剂，以张力反转率评价药物的组织舒张作用。

cGMP和cAMP表达量的测定：在测定张力反转率后，将组织条迅速冷冻、均质，以80％乙醇提取，提取液离心，取上清液冷冻干燥、复溶，以放射性免疫法测定cGMP和cAMP浓度。

结果：图12可见当尿道组织施以NE时，随NE浓度的增加，组织收缩力明显增大，在NE浓度为10μM时达到最大。当组织施以浓度逐渐增高的舒张剂佛司可林和硝普钠时，收缩反转率逐渐增大(图13)，可见对照药物引起了收缩缓解(组织舒张)。当组织给予不同浓度的尤克那非时(图14)，可引起显著的组织舒张，其程度与CNP相当，并且舒张作用随药物浓度增大而增大。

cGMP和cAMP浓度测定结果见表8。可见，组织给予尤克那非后，cGMP和cAMP浓度均显著增高，其中cGMP增高更明显。

表8测定张力反转率后各组织的cGMP和cAMP浓度。n＝6,mean±S.D.

	对照组	佛司可林	硝普钠	CNP	尤克那非
						cAMP	7.0±0.8	36.3±4.5	8.0±1.1	8.3±1.5	10.3±1.4*
cGMP	0.3±0.1	0.6±0.1	9.7±1.3	0.6±0.2	1.8±0.3*

*P＜0.01，与对照组相比

结论：尤克那非发挥PDE5抑制作用，显著提高了组织中的cGMP浓度，引发尿道组织的舒张力。因此，尤克那非可用来治疗下尿路舒张力不足，改善良性前列腺增生(BPH)患者的排尿。

【实施例8】尤克那非在制备抗肿瘤免疫增效药物中的应用

本实施例使用三种肿瘤细胞系研究移植瘤小鼠体内尤克那非的免疫抑制相关的抗肿瘤增效作用。

方法：

实验动物：BALB/c小鼠和BALB/c-Rag-2-^/-小鼠(免疫缺陷)，体重20±2g，雌雄各半。

细胞株：结肠癌细胞系CT26WT、乳腺癌细胞系TS/A。

动物分组：

BALB/c小鼠和BALB/c-Rag-2-^/-小鼠分别分为4个给药组：

组1：生理盐水,i.p.

组2：尤克那非20mg/kg/d,i.p.

组3：多柔比星2mg/kg/d,i.v.

组4：多柔比星2mg/kg/d,i.v.+尤克那非20mg/kg/d,i.p.

小鼠移植瘤模型的建立和评价：将细胞株接种于小鼠股沟处皮下，建立移植瘤模型。细胞接种量为0.5×10⁶。以游标卡尺测量肿瘤的最大直径及其与最大直径垂直的宽度。最大直径×垂直宽度的值记为肿瘤生长指数。接种4天后开始按不同实验组分别给予生理盐水(i.p.)、盐酸多柔比星(2mg/kg/d,i.v.)及尤克那非(20mg/kg/d,i.p.)，每天测量记录肿瘤生长指数。

结果：

荷瘤小鼠肿瘤生长指数如图15所示。结果表明，在具有免疫力的BALB/c小鼠中(图15A、B)，尤克那非对CT26WT和TS/A移植瘤的生长具有一定的抑制作用，单独给予尤克那非时，即能观察到肿瘤体积的显著差异，而当与盐酸多柔比星合用时，进一步抑制了肿瘤生长速度。为了证明尤克那非的抗肿瘤作用是免疫介导的，我们使用免疫缺失的BALB/c-Rag-2-^/-小鼠进行对比试验(图15C、D)，结果表明，尤克那非未能表现肿瘤抑制作用，两个平行组之间的肿瘤生长指数曲线基本重合。BALB/c-Rag-2-^/-小鼠缺少T型和B型淋巴细胞，但具有正常的甚至增强的NKT(自然杀伤细胞)活性。此结果表明，尤克那非对肿瘤生长的抑制作用可能是由于激发适应性免疫应答导致肿瘤细胞凋亡。

结论：尤克那非在制备抗肿瘤免疫增效药物中具有显著的有益效果，可与其他抗肿瘤药物联用，增强抗肿瘤效果。

【实施例9】尤克那非在制备镇痛药物中的应用

本实施例采用大鼠足底切开术-热敏痛觉模型进行药物镇痛效果评价。

方法：

动物：雄性SD大鼠，体重270-300g。术前常规饲养，术后饲养于铺垫了防水纤维垫的笼中。

分组：

组1：吗啡3mg/kg，s.c.

组2：加巴喷丁10mg/kg，s.c.

组3：尤克那非10mg/kg，s.c.

组4：尤克那非20mg/kg，s.c.

组5：对照组，生理盐水，s.c.

痛觉模型：大鼠麻醉后将右后足的足底表面消毒，从脚后跟边缘0.5cm起延伸至趾，切1cm长的切口，切口穿过皮肤和筋膜，并将足底肌肉切开。缝合伤口，喷涂土霉素喷雾剂及金霉素散剂。48小时后伤口愈合，拆去缝合线。通过足底热痛觉试验评价大鼠的痛觉敏感性。大鼠固定置于有机玻璃测试装置中，在后足底部安装有照射热源，记录右后足的退缩潜伏期(PWL)。热源22.5秒时自动停止加热以防止组织损伤。在术前先行测定每只大鼠后足的PWL，测3次取平均值作为痛觉基础PWL，并校准装置使基础PWL约为10秒。组1在术前30min给予吗啡3mg/kg，s.c.，组2在术前1h给予加巴喷丁10mg/kg，s.c.，组3在术前1h给予尤克那非10mg/kg，s.c.，组4在术前1h给予尤克那非20mg/kg，s.c.。术后2、24、48和72小时后分别测定PWL。

结果：大鼠足底肌肉切开术导致受热时产生热痛觉，可模拟术后疼痛征状。足底热痛觉试验见图16，可见空白对照组在2h时对痛觉的敏感达到最大值，PWL值最低。而已知的镇痛药加吗啡和加巴喷丁显著提高了PWL，表明此模型中痛阈的升高。当大鼠给予尤克那非时，20mg/kg剂量组的PWL相对于对照组显著升高，而低剂量的10mg/kg剂量组的PWL也有一定的升高。

结论：尤克那非在抑制术后疼痛方面具有显而易见的潜在应用。

【实施例10】尤克那非在与其他药物联合使用治疗高血压性勃起功能障碍(ED)中的应用

方法：

实验动物：雄性SD大鼠，体重160-200g。

受试药物：尤克那非(YK)、Rho激酶抑制剂Y-27632

分组：

组1(BL)：空白对照组(正常血压，无ED)

组2(HT)：高血压模型组

组3(ED)：ED模型组

组4(HT/ED)：高血压+ED模型组

组5(ED+Y-27632)：ED模型组，给予Y-27632，5μg，海绵体内注射

组6(ED+YK+Y-27632)：ED模型组，给予尤克那非15mg/kg，i.v.+Y-27632，5μg，海绵体注射

组7(HT/ED+Y-27632)：高血压+ED模型组，给予Y-27632，5μg，海绵体内注射

组8(HT/ED+YK+Y-27632)：高血压+ED模型组，给予尤克那非15mg/kg，i.v.+Y-27632，5μg，海绵体注射

高血压模型的建立：大鼠高盐高脂饲料喂养，此外日常给予10％蔗糖溶液代替引用水，连续喂养至少6周。以大鼠尾动脉血压心律测定仪测定尾动脉血压，血压显著升高并稳定后可入选高血压组。

ED模型的建立：正常大鼠或高血压造模大鼠通过低氧环境(12％O₂)诱发大鼠ED。大鼠连续暴露于低氧环境中总共14天，并于实验时始终处于低氧环境中。

阴茎海绵体压力(CCP)测定：采用25G-IV型蝶形针在大鼠阴茎基底上方约3-5mm处插管，并连接压力传感器，即时测定CCP。纤维囊以棉签分隔前列腺侧叶交叉处的前侧的纤维囊和输精管，大鼠麻醉后，切开分隔前列腺侧叶和输精管交叉处前侧的纤维囊，可见大骨盆神经节，连接电场刺激装置(EFS)的电极。刺激电压为1.5V、3V或4.5V，持续时间1min。每次刺激之间至少间隔5min。记录电刺激期间的CCP平均值。

给药：尤克那非和Y-27632均在CCP试验30min前注射给药。

结果：

CCP测定结果见表9。正常大鼠或高血压大鼠经ED造模后，CCP相对于对照组显著降低，表明ED的形成，而HT/ED大鼠的CCP略低于ED大鼠，但无显著差别。ED大鼠或HT/ED大鼠单独给予Y-27632，CCP显著高于相应的未给药组，而ED大鼠或HT/ED大鼠联合给予尤克那非和Y-27632后，CCP显著高于单独给予Y-27632组。在联合给药的情况下，ED大鼠和HT/ED大鼠的CCP之间无显著差别。以上结果说明，尤克那非与Y-27632联合给药时，可有效改善高血压ED的症状。

表9大鼠CCP测定试验结果。n＝6,mean±S.D.

*P＜0.01，与BL组相比；**P＜0.01，与ED组相比；^#P＜0.05，与ED+Y-27632组相比；^##P＜0.01，与HT/ED组相比；^$P＜0.05，与HT/ED+Y-27632组相比；^$$P＞0.05，与ED+YK+Y-27632组相比。

结论：在治疗高血压ED时，尤克那非与Rho激酶抑制剂Y-27632联用时具有比单用Y-27632具有更好的疗效。

【实施例11】尤克那非在与其他药物联合使用治疗肺动脉高压中的应用

本实施例验证尤克那非与尿钠肽联合应用对肺动脉压的降低。

方法：

实验动物：SD大鼠，体重270-300g

受试药物：尤克那非(YK)、N-[4-[1-(3-氨丙基)-2-羟基-2-亚硝基肼]丁基]-1,3-丙二酰胺(SPER-NO)、心房钠尿肽(ANP)

胸主动脉和肺动脉：健康大鼠被安乐死后，小心分离胸主动脉和肺动脉，以组织浴槽法测定等长张力，以前列腺素内过氧化物类似物U46619引起组织收缩，以引起最大收缩时浓度的80％(EC₈₀)作用于组织引起持续收缩，并给予SPER-NO(1nM-1mM)和ANP(1nM-1mM)以及尤克那非(3μM，培养30min)，测定张力的变化情况，计算舒张百分率。

肠系膜小动脉和肺小动脉：大鼠肺小动脉(直径约100μm)和肠系膜小动脉(直径约180μm)切开置于Mulvany肌动仪，分别以透壁压强15mmHg(肺小动脉)或100mmHg(肠系膜小动脉)伸展至直径的90％。血管组织用U46619预收缩，以1mM乙酰胆碱(ACh)测试内皮完整性。给予SPER-NO(10nM-10mM)或ANP(1nM-1mM)以及尤克那非(3μM，培养30min)作用于组织，测定舒张曲线。

结果：

尤克那非对胸主动脉及肺动脉SPER-NO或ANP响应的影响：结果如图17、18所示。当动脉组织与3μM的尤克那非共同培养30min时，尤克那非对胸主动脉-ANP响应无显著影响，但对肺动脉-ANP的响应有影响，显著提高了ANP的舒张作用，提示对肺动脉的降压作用增强。而尤克那非在胸主动脉和肺动脉中均提升了组织由一氧化氮供体SPER-NO引起的舒张，说明只有在外源性NO介入时，尤克那非才会引起胸主动脉压的降低。

尤克那非对肠系膜小动脉及肺小动脉SPER-NO或ANP响应的影响：结果如图19、20所示。当组织与3μM的尤克那非共同培养30min时，尤克那非对肠系膜小动脉-ANP响应无显著影响，但对肺小动脉-ANP的响应有影响，显著提高了ANP的舒张作用，提示对肺动脉的降压作用增强。而尤克那非在肠系膜小动脉和肺小动脉中均提升了组织由SPER-NO引起的舒张，说明只有在外源性NO介入时，尤克那非才会引起肠系膜小动脉压的降低。

试验结果提示尤克那非是ANP介导的肺动脉舒张的调节剂，与ANP合用时，可通过NO/cGMP/PKG通路显著增强ANP介导的肺动脉舒张，但不会影响体循环动脉的舒张。表明尤克那非具有肺动脉选择作用。

结论：当尤克那非与抗肺动脉高压药物联用时，可选择性增强肺动脉高压降压效果，而不引起体动脉血压的降低。

【实施例12】尤克那非通过口服给药途径在制备PDE5/cGMP/PKG通路参与的生物病理过程的疾病的药物中的应用

利用下列成分制备片剂：将活性成分尤克那非(例如：5-100mg)与微晶纤维素、二氧化硅、硬脂酸镁共混，将混合物压制成片剂，包胃溶型薄膜衣。片剂通过标准的制剂工艺制备，例如粉末直接压片、湿法制粒、干法制粒等。

还可以采用类似的固体组合物作为填充至硬胶囊的填充物。硬胶囊壳可由明胶、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素等形成。组合物中可包含稀释剂，例如微晶纤维素、淀粉类、乳糖等；也可包括助流剂和润滑剂，如二氧化硅和硬脂酸镁等；也可包含其他制剂辅料成分。也可将尤克那非与各种矫味剂、着色物混合，以及与乳化剂和/或悬浮剂和稀释剂混合，例如与水、乙醇、丙二醇和甘油或它们的组合物相混合。

缓慢释放和脉冲释放的剂型可以含有赋形剂，例如微晶纤维素、淀粉类、乳糖等，以及另外添加充当释放速率调节剂的赋形剂。释放速率调节剂包括但不限于羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、醋酸纤维素、聚氧乙烯、异丁烯酸铵共聚物、氢化蓖麻油、巴西棕榈蜡、石蜡、乙酸纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、异丁烯酸共聚物及其混合物。缓慢释放和脉冲释放的剂型可以含有释放速率调节剂中的一种或几种组合。释放速率调节剂可以存在于剂型内部，也就是基质内，和/或存在于剂型外部，也就是表面或包衣。

当口服给药时，可按照如下给药方案进行：

起始剂量每次50mg，每天一次，以25mg剂量递增，逐渐加大至最大剂量100mg/天。

又例如，起始剂量每次25mg，每天一次，以25mg剂量递增，逐渐加大至最大剂量100mg/天。

再例如，以25mg/天的剂量持续长期给药。

再例如，以10mg/天的剂量持续长期给药。

再例如，以50mg/天的剂量连续服药3天，停药4天，每周循环。

【实施例13】尤克那非通过非口服给药途径在制备PDE5/cGMP/PKG通路参与的生物病理过程的疾病的药物中的应用

尤克那非还可以通过非口服途径，即肠胃外(Parenteral)给药，例如静脉内、动脉内、腔内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌内或皮下，或者可以利用输注或无针注射技术给药。关于这类肠胃外给药，最好使用无菌水溶液的形式，其中可以含有其他物质，例如足够的盐或葡萄糖，使溶液与血液等渗。如果必要的话，水溶液应当被适当地缓冲(优选至pH为3至9)。利用本领域技术人员熟知的标准药学技术，在无菌条件下的制备适合的肠胃外制剂是容易实现的。

下列剂量水平和本文其他剂量水平是针对体重约65至70kg的普通患者而言的。专业技术人员能够容易地确定体重超出该范围的患者所需的剂量水平，例如儿童和老人。尤克那非在这类制剂中的剂量取决于它的具体治疗用途，但是可以确定大多数剂量是在1-500mg/天的范围内，并且每天给药一般不超过三次。精确的剂量将由临床医师决定，并取决于患者的年龄、体重和症状的严重程度。

尤克那非还可通过鼻内给药或肺部吸入给药，适宜以干粉吸入剂或气雾剂的形式从加压容器、泵、喷雾器、雾化器或喷洒器中释放出来，其中使用或者不用适当的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟代甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷(例如1,1,2,2-四氟乙烷或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷、二氧化碳或其它适合的气体。在加压气雾剂的情况下，该剂量单位可以通过计量阀加以确定。加压容器、泵、喷雾器、雾化器或喷洒器可含有活性化合物的溶液或混悬液，例如使用乙醇与推进剂的混合物作为溶剂，还可以另外含有润滑剂，例如脱水山梨醇三油酸酯。

气雾剂或干粉制剂的优选用法为：使之每计量单位的剂量或“每揿一下”含有1至50mg的尤克那非。气雾剂的每日总剂量将在1至100mg的范围内，可以在全天内一次给药，或者更通常地分为多次给药。

另外，尤克那非可以通过皮肤、粘膜和直肠给药。例如以栓剂的形式给药，或者以凝胶剂、乳膏剂、洗剂、滴剂(包括滴鼻剂、滴耳剂及滴眼剂)或散剂的形式局部用药，或者通过透皮贴剂给药，或者通过舌下或颊部粘膜给药。

关于皮肤局部用药，可以将尤克那非制成适合的软膏剂，例如其中含有混悬或溶解在下列一种或多种辅料混合物中的活性化合物：矿物油、液体石蜡、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、乳化剂和水。或者，可以配制成适合的洗剂或凝胶剂，将尤克那非混悬或溶解在例如下列一种或多种辅料的混合物中：矿物油、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨醇60、鲸蜡基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水等。

Claims (36)

1.一种配制为单剂量形式的药物组合物，其中该单剂量形式含有5-100mg的化合物优克那非或其可药用的盐。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中该单剂量形式中含有优克那非或其可药用的盐的含量为10mg。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中该单剂量形式中含有优克那非或其可药用的盐的含量为25mg。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中该单剂量形式中含有优克那非或其可药用的盐的含量为50mg。

5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中该单剂量形式中含有优克那非或其可药用的盐的含量为100mg。

6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中该单剂量形式中含有优克那非或其可药用的盐的含量为5mg。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的药物组合物，其中所述单剂量形式适合于通过口服途径进行给药。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的药物组合物，其中所述单剂量形式是适于口服的固体制剂。

9.根据权利要求1-6中任一项所述的药物组合物，其中所述单剂量形式是适于口服的片剂或胶囊剂。

10.根据权利要求1-6中任一项所述的药物组合物，其中所述单剂量形式是缓慢释放或脉冲释放的口服制剂。

11.一种配制为单剂量形式的药物组合物，其中该单剂量形式含有1-500mg的化合物优克那非或其可药用的盐。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述单剂量形式适合于通过非口服途径进行给药。

13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述非口服途径包括静脉内、动脉内、腔内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌肉或皮下、鼻内或肺部吸入、皮肤、粘膜或直肠。

14.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述单剂量形式为注射剂、干粉剂或气雾剂、栓剂、凝胶剂、乳膏剂、洗剂、滴剂、散剂、贴剂、软膏剂。

15.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述单剂量形式为气雾剂或干粉剂。

16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述气雾剂或干粉剂的单剂量形式含有1-100mg的化合物优克那非或其可药用的盐。

17.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述气雾剂或干粉剂的单剂量形式含有1-50mg的化合物优克那非或其可药用的盐。

18.配制成单剂量形式的药物组合物，其中该单剂量形式含有1-500mg之间的化合物优克那非或其可药用的盐，和尿钠肽。

19.配制成单剂量形式的药物组合物，其中该单剂量形式含有1-500mg之间的化合物优克那非或其可药用的盐，和Rho激酶抑制剂。

20.根据权利要求1-19中任一项的药物组合物，在制备用于治疗PDE5/cGMP/PKG通路参与的生物病理过程的疾病的药物中的用途。

21.根据权利要求20所述的药物用途，其中所述疾病包括缺血性脑卒中、心肌梗死、肺动脉高压、阿尔茨海默病、亨廷顿氏舞蹈病、糖尿病、下尿路舒张力不足、肿瘤、术后疼痛、勃起功能障碍。

22.一种优克那非片剂，其中所述的片剂为将活性成份优克那非与微晶纤维素、二氧化硅、硬脂酸镁共混，将混合物压制成片剂，包胃溶型薄膜衣，优选的所述活性成份优克那非为5-100mg。

23.一种优克那非片剂，其中所述的片剂含有活性成份优克那非为5-100mg，优选的所述的片剂为将活性成份优克那非与微晶纤维素、二氧化硅、硬脂酸镁共混，将混合物压制成片剂，包胃溶型薄膜衣。

24.根据权利要求22或23所述的片剂，其中所述的片剂通过标准的制剂工艺制备，优选的为粉末直接压片、湿法制粒、干法制粒。

25.一种优克那非硬胶囊剂，其中所述的硬胶囊剂由固体组合物作为填充剂填充至硬胶囊壳，所述硬胶囊壳由明胶、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素形成，固体组合物中可包含稀释剂，所述稀释剂优选为微晶纤维素、淀粉类、乳糖；优选的固体组合物中进一步包括助流剂和润滑剂，优选的所述优克那非硬胶囊剂活性成份优克那非为5-100mg。

26.一种优克那非硬胶囊剂，其中所述的硬胶囊剂活性成份优克那非为5-100mg，优选的其所述的硬胶囊剂由固体组合物作为填充剂填充至硬胶囊壳，所述硬胶囊壳由明胶、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素形成，固体组合物中可包含稀释剂，所述稀释剂优选为微晶纤维素、淀粉类、乳糖；优选的固体组合物中进一步包括助流剂和润滑剂。

27.一种优克那非缓慢释放和脉冲释放的剂型，其中所述的缓慢释放和脉冲释放的剂型包含赋形剂和充当释放速率调节剂的赋形剂，优选的所述赋形剂为微晶纤维素、淀粉类或乳糖，所述释放速率调节剂包括但不限于羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、醋酸纤维素、聚氧乙烯、异丁烯酸铵共聚物、氢化蓖麻油、巴西棕榈蜡、石蜡、乙酸纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、异丁烯酸共聚物及其混合物，优选的所述释放速率调节剂可以存在于剂型内部，也就是基质内，和/或存在于剂型外部，也就是表面或包衣，优选的所述优克那非缓慢释放和脉冲释放的剂型含有活性成分优克那非5-100mg。

28.一种优克那非缓慢释放和脉冲释放的剂型，其中所述活性成份优克那非为5-100mg，优选的所述缓慢释放和脉冲释放的剂型包含赋形剂和充当释放速率调节剂的赋形剂，优选的所述赋形剂为微晶纤维素、淀粉类或乳糖，所述释放速率调节剂包括但不限于羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、醋酸纤维素、聚氧乙烯、异丁烯酸铵共聚物、氢化蓖麻油、巴西棕榈蜡、石蜡、乙酸纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、异丁烯酸共聚物及其混合物，优选的所述释放速率调节剂可以存在于剂型内部，也就是基质内，和/或存在于剂型外部，也就是表面或包衣。

29.根据权利要求22或23所述的片剂、权利要求25或26所述的硬胶囊剂或权利要求27或28所述的优克那非缓慢释放和脉冲释放的剂型，其特征在于以10mg/天或25mg/天的剂量持续长期给药。

30.根据权利要求22或23所述的片剂、权利要求25或26所述的硬胶囊剂或权利要求27或28所述的优克那非缓慢释放和脉冲释放的剂型，其特征在于起始剂量每次50mg，每天一次，以25mg剂量递增，逐渐加大至最大剂量100mg/天。

31.根据权利要求22或23所述的片剂、权利要求25或26所述的硬胶囊剂或权利要求27或28所述的优克那非缓慢释放和脉冲释放的剂型，其特征在于起始剂量每次25mg，每天一次，以25mg剂量递增，逐渐加大至最大剂量100mg/天。

32.根据权利要求22或23所述的片剂、权利要求25或26所述的硬胶囊剂或权利要求27或28所述的优克那非缓慢释放和脉冲释放的剂型，其特征在于以50mg/天的剂量连续服药3天，停药4天，每周循环。

33.一种优克那非无菌水溶液，其特征在于除优克那非外还含有其他物质，所述其他物质优选为足够的盐或葡萄糖，优选的如果必要的话，水溶液应当被适当地缓冲(优选至pH为3至9)。

34.一种优克那非鼻内或肺部吸入剂，其特征在于以干粉制剂或气雾剂的形式从加压容器、泵、喷雾器、雾化器或喷洒器中释放出来；优选的，气雾剂或干粉制剂每计量单位的剂量或“每揿一下”含有1至50mg的优克那非，气雾剂的每日总剂量将在1至100mg的范围内，可以在全天内一次给药，或者更通常地分为多次给药。

35.一种优克那非软膏剂，其特征在于含有混悬或溶解在下列一种或多种辅料混合物中的活性化合物：矿物油、液体石蜡、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、乳化剂和水。

36.一种优克那非洗剂或凝胶剂，其特征在于将优克那非混悬或溶解在下列一种或多种辅料的混合物中：矿物油、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨醇60、鲸蜡基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。

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