CN107063940A - 用于评价基于蛋白质的制剂的稳定性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于评价基于蛋白质的制剂相对于润滑容器的润滑剂的稳定性的方法，所述基于蛋白质的制剂包含蛋白质、肽和/或蛋白质衍生物和缓冲剂，其中预期要将所述制剂储存所述容器中，所述方法包括：a)评价所述缓冲剂与所述润滑剂之间界面张力随时间的减小；b)评价所述基于蛋白质的制剂与所述润滑剂之间的界面张力随时间的减小；c)通过比较步骤b)中评价的减小与步骤a)中评价的减小来鉴定与所述润滑剂发生相互作用的所述基于蛋白质的制剂的至少一种组分。

Description

用于评价基于蛋白质的制剂的稳定性的方法
发明领域
本发明涉及用于评价基于蛋白质的制剂相对于润滑容器的润滑剂的稳定性的方法，其中所述制剂预期被储存在所述容器中。本发明还涉及使基于蛋白质的制剂适应润滑容器的润滑剂的方法和选择适应润滑预期储存基于蛋白质的制剂的容器的润滑剂的方法，以便改善所述制剂相对于所述润滑剂的稳定性。
背景技术
预装填的注射装置是将药物或疫苗递送给患者的常见的容器，并且包括注射器、药筒和自动注射器。它们通常包括滑动接合(gliding engagement)进入容器的密封塞，所述容器中填充有药物组合物，以便给从业医师提供随时可用的注射装置。
当与恰好在注射前使用小瓶储存的药物组合物填充的空注射装置比较时，预装填注射装置的应用产生了几个优点。特别地，因为限制在注射前制备，所以预装填的注射装置提供给药误差的减小、最小化的微生物污染风险和对于从业医师使用的增强的便利性。此外，这类预装填的容器促进并且简化了患者的自我给药，从而能够降低治疗成本并且增加患者的依从性。最终，预装填的注射装置减少了有价值的药物组合物的损耗，这种情况通常在将药物组合物从小瓶转至无预装填注射装置时发生。这对于指定的制造批次药物产品而言产生了更大数量的可能的注射剂，由此降低了购买和供应链的成本。
然而，连同这些改善，药物组合物在预装填注射装置中的商业化赋予其自身挑战的集合，特别是在敏感性生物制品的情况中。实际上，生物制品例如细胞因子、单克隆抗体、基于核酸的产品和疫苗是高度复杂的分子，并且经历可能影响疗法效能和患者安全性的各种降解途径。
例如，在预装填注射器的情况中，例如钨、基于硅酮的润滑剂和粘着剂这样的组分均被鉴定为对于生物制品的不相容性的潜在来源。润滑剂通常且更具体地是硅油已经收到制剂科学家的增加的关注，以便理解其与蛋白质和疫苗的相容性。医用级硅油例如聚-(二甲基硅氧烷)(PDMS)因其润滑剂特性而常用于注射装置：它们确保在将药物组合物注射给患者的过程中塞子至始至终在注射装置套筒上有效滑动。然而，已经报道，硅油牵涉治疗性蛋白质降解，例如在包括疫苗的药物制剂中形成颗粒。这些颗粒通常包含带有辅助剂和/或硅油的聚集的蛋白质。
除蛋白质活性明显缺失外，不期望的临床作用和安全性担忧因这类聚集的蛋白质的胃肠外施用产生。此外，聚集水平甚至在极低百分比，例如1％也可能产生关于目前最佳实践和管理所不接受的药物组合物。然而，当储存于润滑容器中时，基于蛋白质的制剂的稳定性评价可能是困难和耗时的。此外，使基于蛋白质的制剂适应这类容器通常是根据经验的且在产品研发的后期进行。一些基于蛋白质的药物组合物由此可能到达了研发的更后期阶段，然后在储存于注射装置时鉴定了主要稳定性问题。这可能导致昂贵的再配制步骤且对于患者而言无法获得珍贵的药物组合物。
最终，当得到几种润滑剂时，无法得到选择针对指定基于蛋白质的组合物的最适合的润滑剂的快速方法。耗时的稳定性研究由此必须由医疗公司针对不同的注射装置和润滑剂组成进行，而没有任何最富有希望的解决方案的候选清单的可能性。
作为结果，对于快速和有效的方法存在强烈需求，所述方法用于评价基于蛋白质的制剂相对于润滑容器的润滑剂的稳定性，其中所述制剂预期被储存在所述容器中。此外，对于可靠的方法存在需求，所述方法用于指导预期储存于润滑容器中的基于蛋白质的制剂的配制。最终，选择用于预期储存基于蛋白质的制剂的容器的最适合的润滑剂的方法也是期望的。
发明概述
因此，本发明的第一个方面是用于评价基于蛋白质的制剂相对于润滑容器的润滑剂的稳定性的方法，所述基于蛋白质的制剂包含蛋白质、肽和/或蛋白质衍生物和缓冲剂，其中所述制剂预期要被储存在所述容器中，所述方法包括：
a)评价所述缓冲剂与所述润滑剂之间界面张力随时间的减小；
b)评价所述基于蛋白质的制剂与所述润滑剂之间的界面张力随时间的减小；
c)通过比较步骤b)中评价的减小与步骤a)中评价的减小来鉴定与所述润滑剂发生相互作用的所述基于蛋白质的制剂的至少一种组分。
所述方法使用简单和低廉的界面张力测量方法对基于蛋白质的制剂相对于润滑容器的润滑剂的稳定性提供极为良好的洞察力。具体地，所述方法允许测定所述蛋白质与所述润滑剂之间或所述缓冲剂与所述润滑剂之间是否发生相互作用。因此，允许在制剂研发的最早期阶段检测到稳定性问题并且在制剂研发更后期阶段过程中避免昂贵的再配制步骤。所述方法由此在缓解基于蛋白质的制剂研发过程中的稳定性风险方面和为制药公司节约时间和资金方面是有价值的。
在一个实施方案中，所述方法还包括评价步骤a)中的缓冲剂的每种组分与润滑剂之间的界面张力的减小。实际上，基于蛋白质的制剂和润滑剂的不稳定性可能与所述制剂的任意组分相关，而并非仅仅是与蛋白质相关。所述方法由此用于鉴定缓冲剂的所有组分中发生相互作用的组分。
本发明的第二个方面在于改善所述基于蛋白质的制剂相对于所述容器的润滑剂的稳定性的方法。在第一种途径中，所述方法包括：
a)根据本发明第一个方面，评价基于蛋白质的制剂的稳定性；
b)选择辅助剂，所述辅助剂带来与所述润滑剂的界面张力随时间的减小高于所述基于蛋白质的制剂与所述润滑剂的界面张力随时间的减小；
c)通过将所述选择的辅助剂添加到所述基于蛋白质的制剂中使所述基于蛋白质的制剂适应。
这种辅助剂可能已经存在于缓冲剂中，且其浓度由此得到增加，以便与本发明第一个方面中检测到的相互作用，例如所述蛋白质与所述润滑剂之间的相互作用竞争。因此，不期望的相互作用被非敏感性相互作用替代，所述非敏感性相互作用不会阻碍所述基于蛋白质的制剂的稳定性或效能。所添加的辅助剂还可以是不存在于所述基于蛋白质的制剂中的辅助剂，然后通过本方法使所述制剂适应。例如，所述辅助剂可以是表面活性剂，例如聚山梨酯80。
在第二种途径中，所述方法包括：
a)根据本发明第一个方面，评价基于蛋白质的制剂的稳定性；
b)选择辅助剂，所述辅助剂能够络合(complexing)所述基于蛋白质的制剂的蛋白质；
c)通过添加所述选择的辅助剂，使所述基于蛋白质的制剂适应，以便至少部分减少所述基于蛋白质的制剂与所述润滑剂之间的界面张力随时间的减小。
在这种第二种途径中，通过所述蛋白质与所述辅助剂之间形成的络合物，防止本发明第一个方面中鉴定的不期望的相互作用，且所适应的基于蛋白质的制剂不会呈现任何与所述润滑剂的界面张力随时间的减小。例如，所添加的辅助剂可以是盐，例如铝盐，例如氢氧化铝。
本发明第二个方面的两种途径提供再配制基于蛋白质的制剂的简便方法，所述基于蛋白质的制剂被发现相对于润滑容器中的指定润滑剂不稳定。通过使用界面张力作为指导，可以预期和减少昂贵和冗长的稳定性研究。
本发明的第三个方面是选择适应容器的润滑剂的方法，所述容器预期用于储存基于蛋白质的制剂，所述方法包括：
a)提供至少一种所研究的润滑剂；
b)通过本发明第一个方面的方法，评价所述基于蛋白质的制剂相对于所述至少一种润滑剂的稳定性；
c)测定所述基于蛋白质的制剂对步骤b)中鉴定的相互作用的敏感性；
d)选择润滑剂，其导致与所述基于蛋白质的制剂的不敏感相互作用或使所述基于蛋白质的制剂适应，其中通过本发明第二个方面的方法进行。
所述方法能够选择最适应特定的基于蛋白质的制剂的润滑剂。
更具体地，步骤b)允许鉴定与步骤a)所要研究的至少一种润滑剂发生相互作用的所述基于蛋白质的制剂的至少一种组分。根据本发明的第一个方面，该组分通过下列鉴定：比较所述基于蛋白质的制剂与所述润滑剂之间的界面张力随时间的减小与所述缓冲剂的每种组分与所述润滑剂之间的界面张力随时间的减小。
也就是说，当全部润滑剂与所述基于蛋白质的制剂发生相互作用时，所述缓冲剂的每种组分与所述润滑剂之间的界面张力随时间的减小的随后比较是唯一必不可少的。否则，应当选择与所述基于蛋白质的制剂不发生相互作用的润滑剂。
一旦根据步骤b)已经鉴定与所述润滑剂发生相互作用的所述基于蛋白质的制剂的组分，则步骤c)进一步允许测定所述基于蛋白质的制剂对于所述组分与所述润滑剂之间的相互作用的敏感性。然后，在其中至少一种润滑剂导致与所述基于蛋白质的制剂的不敏感性相互作用的情况中，选择这种润滑剂。在其中全部润滑剂导致与所述基于蛋白质的制剂的敏感性相互作用的情况中，通过向所述制剂中添加辅助剂使所述基于蛋白质的制剂适应，所述制剂中添加辅助剂能够带来界面张力随时间的更高的减小，或者可以使用另外的润滑剂进行目前的研究。
步骤a)和b)是快速而价格低廉的。然而，根据步骤c)和d)测定基于蛋白质的制剂对相互作用的敏感性可能需要本领域技术人员已知的额外的实验并且根据研究中的特定相互作用选择。例如，如果在缓冲剂与润滑剂之间鉴定了相互作用，则可能需要pH控制。然而，如果与蛋白质发生有限的相互作用，则研究这种相互作用蛋白质的结构和折叠可能需要圆二色性、红外和拉曼光谱法或核磁共振。
界面张力由此用作研究基于蛋白质的制剂在润滑容器中的稳定性的强有力工具。当检测到相互作用时，界面张力也是使所述基于蛋白质的制剂适应润滑容器或选择与所述基于蛋白质的制剂相容的润滑剂的精确指导。
附图简述
图1是显示两种针对脑膜炎的疫苗即疫苗A和疫苗B及其相应的缓冲剂即疫苗A缓冲剂和疫苗B缓冲剂(它们是不含疫苗蛋白质的疫苗制剂)的界面张力随时间的减小的示意图。
图2A-2D是显示通过分别对疫苗A、疫苗缓冲剂A(图2A和2C)、疫苗B和疫苗缓冲剂B(图2B和2D)的微流量(Micro-Flow)成像测定的颗粒浓度的示意图。图2A和2B是球形颗粒浓度，且图2C和2D是非球形颗粒浓度。
图3A-3D是显示通过分别对疫苗A、疫苗缓冲剂A(图3A和3C)、疫苗B和疫苗缓冲剂B(图3B和3D)的共振质量测量所测定的颗粒浓度的示意图。图3A和3B是正电颗粒(positiveparticles)浓度，且图3C和3D是负电(negative particles)颗粒浓度。
图4是概括本发明第一个方面的方法的流程图。
图5是显示硅油分别与3×10-6M浓度的聚山梨酯80(十字形)、3×10-4M浓度的聚山梨酯80(三角形)、疫苗B(空心圆圈)和含有3×10-4M浓度的聚山梨酯80的疫苗B(实心圆圈)之间的界面张力随时间的减小的示意图。
图6A和6B是通过分别对疫苗B、疫苗缓冲剂B、含有3×10-4M浓度的聚山梨酯80的疫苗B和含有3×10-4M浓度的聚山梨酯80的疫苗缓冲剂B的微流量成像测定的颗粒浓度的示意图。
图7A和7B是通过分别对疫苗B、疫苗缓冲剂B、含有3×10-4M浓度的聚山梨酯80的疫苗B和含有3×10-4M浓度的聚山梨酯80的疫苗缓冲剂B的共振质量测量所测定的颗粒浓度的示意图。
图8是显示硅油分别与1g/l浓度的胰岛素、10-4M浓度的聚山梨酯80(菱形)、3×10-4M浓度的聚山梨酯80(三角形)和使用10-4M浓度的聚山梨酯80适应的胰岛素(正方形)之间的界面张力随时间减小的示意图。
图9是显示硅油分别与疫苗缓冲剂A(空心圆圈)、氢氧化铝(空心三角形)、疫苗A(实心圆圈)和含有氢氧化铝的疫苗(实心圆圈)之间的界面张力随时间减小的示意图。
图10是概括本发明第三个方面的方法的流程图。
发明详述
在本说明书中，润滑容器可以是适应储存基于蛋白质的制剂并且包括塞子和预期有利于塞子在容器内滑动的润滑剂的任意容器。所述容器可以是，例如，小瓶、药筒或注射器。术语“基于蛋白质的制剂”用于指包含肽、蛋白质或蛋白质衍生物的任意预防性或治疗性药物制剂。措词“疫苗”用于指包括疫苗蛋白质和所有辅助剂和溶剂的疫苗制剂。“疫苗蛋白质”用于指仅包括抗原和载体蛋白、但不含辅助剂和溶剂的疫苗蛋白质。“疫苗缓冲剂”用于指不含疫苗蛋白质、即仅包含辅助剂和溶剂的疫苗制剂。
将界面张力定义为因两种液体之间的分子间相互作用差异导致的这两种不互溶液体之间的界面上存在的张力。在大量液体中，每种分子被相邻分子以全方位等同吸引。然而，位于与不互溶液体界面上的分子不会被另一种液体分子吸引，而仅被其类似的相邻分子(neighbors)吸引。这产生诱导液体表面收缩而将界面能降至最低的张力。本发明使用界面张力作为基于蛋白质的制剂领域中的创新工具。
本发明的第一个方面在于在评价基于蛋白质的制剂相对于润滑容器的润滑剂的稳定性的方法中使用界面张力。所述方法的意义已经使用两种多缀合的(polyconjugated)针对脑膜炎的疫苗、在常用的硅油的存在下得以证实，所述针对脑膜炎的疫苗即疫苗A和B，所述硅油即聚-(二甲基硅氧烷)–参见材料和方法。
下列方法针对疫苗A和B进行：
在第一步中，评价疫苗缓冲剂与硅油(聚-(二甲基硅氧烷))之间的界面张力随时间的减小，得到曲线1。如上所述，疫苗缓冲剂相当于不含疫苗蛋白质的疫苗制剂。
在第二步中，评价所述疫苗与硅油之间的界面张力随时间的减小，得到曲线2。
在第三步中比较曲线1和2，例如，根据同一示意图上的叠加(superimposition)，如图1中所示。
一般而言，如图1中所示，疫苗A和疫苗B导致与硅油的界面张力随时间显著减小。这些使用两种疫苗得到的减小由此证实硅油与所述疫苗之间存在相互作用，这类相互作用导致界面稳定且由此减小所述疫苗与不互溶硅油之间的张力。
然而，针对疫苗A和疫苗B得到的曲线呈现两种不同的图形。实际上，在疫苗A的情况中，曲线(图1中的实心三角形)以适度的斜率有规则地下降，导致界面张力随实验持续时间(即500秒)减少约13％(从41.6至36.2mN/m)。相反，使用疫苗B得到的界面张力曲线(图1中的实心圆圈)显示在前15秒明显的斜度，并且在实验结束时在相同时间期限内达到超过20％的减少(从43.9至35.0mN/m)。
现在注意使用疫苗缓冲剂A(图1中的空心三角形)和B(图1中的空心圆圈)得到的曲线，未观察到界面张力随时间明显下降，这表明没有相互作用能够稳定保持高张力状态的界面。由于使用所述疫苗观察到随时间界面张力减小，而使用疫苗缓冲剂(不含疫苗蛋白质的疫苗制剂)未观察到这一结果，所以可以得出如下结论：疫苗蛋白质导致界面张力随时间减小。这些结果由此证实两种疫苗蛋白质与硅油之间明显的相互作用，疫苗B与硅油的相互作用高于疫苗A。
不希望受到任何理论约束，这一结果可以解释为：疫苗蛋白质B迁移至与硅油的界面上，导致界面张力快速下降(在前15秒)。一旦在界面上，则疫苗B的蛋白质可以以更有活力的有利构象解折叠(unfold)，提供了界面张力再下降。然后解折叠的蛋白质与疫苗制剂发生相互作用，并且产生蛋白质聚集物，在硅油与疫苗B之间的界面由此为疫苗蛋白质的聚集提供成核位点。
相反，疫苗A显示与硅油的相互作用更有限，表明蛋白质缓慢地迁移至所述界面且蛋白质聚集物的产生有限。
该分析由通过使用两种不同分析技术得到的结果支持，即微流量成像(MFITM)和共振质量测量(RMM)。
MFITM是流式显微技术，其俘获流动物流(flowing stream)中悬浮颗粒的图像。得到不同的放大设定点以便适合期望的粒径和图像质量。然后进一步分析颗粒图像以便区分球形颗粒和非球形颗粒。在目前的情况中，球形颗粒可以归因于硅酮颗粒，而非球形颗粒可以归因于蛋白质聚集物，即共同聚集的解折叠的蛋白质。
在本实验中，分别给硅油润滑的注射器装填疫苗A、疫苗缓冲剂A、疫苗B和疫苗缓冲剂B。然后在装填后即刻(T0)和25℃下7-天温育(T7)后测定球形和非球形颗粒的浓度。
通过MFITM得到的数据显示在图2A-2D中，其中图2A和2B显示球形颗粒的数字浓度(每立方厘米中的颗粒数)，且图2C和2D显示非球形颗粒的浓度。疫苗A和疫苗缓冲剂A的颗粒浓度如图2A和2C中所示，而图2B和2D展示出对疫苗B和疫苗缓冲剂B测定的浓度。
正如图2A中所观察到的，储存后，疫苗A的球形颗粒的浓度保持在369个颗粒/cc(part/cc)的有限值，而疫苗缓冲剂A的球形颗粒的浓度保持在1172个颗粒/cc。关于疫苗B，装填后极高浓度的球形颗粒在图2B中可见，达到7543个颗粒/cc，7-天温育后为13959个颗粒/cc，而疫苗缓冲剂B产生的颗粒浓度低于1800个颗粒/cc。
使用非球形颗粒得到类似的结果，这归因于蛋白质聚集物，正如在图2C和2D中观察到的。实际上，在7天后测定装填疫苗A的润滑的注射器为673个颗粒/cc的有限浓度，而疫苗缓冲剂A为283个颗粒/cc(图2C)，但在装填疫苗B的润滑的注射器中非球形颗粒达到极高浓度(图2D)，7天后高于21 000个颗粒/cc。当在润滑容器中温育7天时，疫苗缓冲剂B再次仅产生444个颗粒/cc的有限量的非球形颗粒。
根据使用本发明第一个方面的方法得到的结果，基于界面张力的减小，这些结果证实疫苗B蛋白质与硅油之间的强相互作用。
除MFITM外，还已经通过使用共振质量测量(RMM)采集数据。RMM基于振动微流体回路，其允许通过测定振动频移来测定通过它循环的颗粒数量和尺寸。本实验允许测定小于MFITM尺寸的颗粒以及将硅油液滴与蛋白质聚集物区分开，因为振动频移取决于颗粒质量。因此，具有低于分析介质(本实验中相应的疫苗缓冲剂)的密度的颗粒得到正位移(positive shift)，并且可以归因于硅油。相反，具有高于分析介质的密度的颗粒得到负位移(negative shift)，并且可以归因于蛋白质聚集物。
这些实验的结果在图3A-3D中可见：图3A和3B相当于正电颗粒的浓度，而图3C和3D提供有关负电颗粒的浓度。得到的数据显示混合后(T0)对于疫苗A 79,933个颗粒/cc的低浓度正电颗粒(归因于硅油)和对于疫苗缓冲剂A 25,867个颗粒/cc以及7-天储存后甚至更低的浓度(T7，参见图3A)。相反，正如在图3B中观察到的，疫苗B在润滑容器中温育过程产生高浓度的正电颗粒(高于1×106个颗粒/cc)，而疫苗A或B的缓冲剂不会产生显著颗粒浓度，低于95,000个颗粒/cc。现在关注归因于蛋白质聚集物的负电颗粒的测量值(图3C和3D)：疫苗A和疫苗缓冲剂A不会产生显著浓度的颗粒，低于100,000个颗粒/cc，且疫苗缓冲剂B低于170,000个颗粒/cc。相反，装填疫苗B的润滑注射器在混合后(T0)产生高于460,000个负电颗粒/立方厘米的显著浓度，所述浓度在7天后(T7)显示，其明显升高超过600％，达到3.1×106个颗粒/cc。
因此，能够从这些不同的实验中得出如下结论：疫苗B与硅油之间发生显著相互作用。这种相互作用可以归因于存在于疫苗B中的疫苗蛋白质的性质，因为疫苗缓冲剂B在硅油的存在下不会产生显著浓度的颗粒。
因此，MFITM和RMM的实验结果均提供根据本发明使用界面张力测量值的方法得到结论的强有力支持：疫苗B与硅油不相容，而疫苗B制剂或作为润滑剂的硅油应当改变，以便将稳定的疫苗B递送入用硅油润滑的预装填容器中。这也验证了界面张力作为得到针对基于蛋白质的制剂在润滑容器中的稳定性的洞察力的快速和强有力工具。实际上，润滑剂与基于蛋白质的制剂例如疫苗之间的界面张力随时间的减小与低稳定性和强浓度蛋白质聚集物的生成相关。
在归因于硅油的颗粒方面，通过MFITM测定的中等浓度的球形颗粒与通过RMM测定的高浓度的正电颗粒之间观察到的不同结果可能与通过这些技术观察到的不同粒径相关。具体地，MFITM观察到具有1-100微米的直径的颗粒，而RMM检测到0.05-5.00微米的直径的颗粒。还已知聚山梨酯80能够稳定小尺寸颗粒形式的气泡，其通过RMM以正电颗粒的形式有效地被观察到。
在疫苗A和B的实例中，在所述方法的第一步中仅评价疫苗缓冲剂与润滑剂之间的界面张力的时间依赖性，因为润滑剂与疫苗蛋白质之间发生相互作用。然而，缓冲剂的另外的组分可能与硅油发生相互作用，这种情况导致评价所述制剂的组分与所述润滑剂之间的界面张力随时间的减小，以便在第三步中鉴定哪种组分导致所述相互作用。实际上，所述缓冲剂的一些组分也可能与所述润滑剂产生强相互作用，导致颗粒产生、治疗性蛋白质降解或所述基于蛋白质的制剂至少失去稳定性。
图4中呈现的流程图概括用于评价任意基于蛋白质的制剂相对于润滑容器的润滑剂的稳定性的一般方法的不同步骤。在步骤100中，评价所述缓冲剂与所述润滑剂之间的界面张力。
例如，如果在所述方法的第一步中所述缓冲剂与所述润滑剂之间的界面张力随时间减小(分支d)，则需要中间步骤101来评价所述制剂缓冲剂的每种组分与所述润滑剂之间的界面张力。或者，如果发现所述缓冲剂与所述润滑剂之间的界面张力稳定(分支s)，则可以直接进行第二步102。在所述方法的所述第二步102中，评价所述基于蛋白质的制剂与所述润滑剂之间的界面张力。如果在该步骤中发现稳定性，则可以得出如下结论：所述基于蛋白质的制剂在所研究的润滑容器中是稳定的(分支s’)且可以进行接下来的研发阶段P。
然而，如果通过界面张力减小检测到任何相互作用(分支d’)，则需要鉴定实际上在本方法第三步103中实际起相互作用的组分。这允许在第四步104中研究所述基于蛋白质的制剂对第三步中鉴定的相互作用的敏感性。实际上，所述制剂的组分与所述润滑剂之间有限的相互作用是可以被接受的，例如，如果该组分以显著浓度被导入和/或如果其功能不受所述相互作用阻碍。因此，可能需要另外的实验，以便确定所述相互作用是否实际影响所述基于蛋白质的制剂的稳定性或效能。例如，如果在所述方法的第三步103中鉴定了pH缓冲剂与所述润滑剂之间的相互作用，则可能需要在老化后检查所述基于蛋白质的制剂的pH，以便确定所述基于蛋白质的制剂仍在所需pH下。类似地，如果发现去氧剂与所述润滑剂发生相互作用，则需要研究老化后的蛋白质氧化，因为氧可以与所述润滑剂竞争并且消除与所述清除剂的相互作用。在其中所述基于蛋白质的制剂对所述相互作用不敏感的情况中(分支NS)，随即能够使用所述基于蛋白质的制剂接下来的研发步骤P进行。然而，如果发现所述基于蛋白质的制剂对特定的相互作用敏感(分支S)，则可能需要所述基于蛋白质的制剂或所述润滑剂的适应(步骤105)。
一般而言，在乳剂-辅助的疫苗的情况中，蛋白质与一些关键组分例如角鲨烯之间的相互作用可能无需另外的实验，因为所述基于蛋白质的制剂对这些相互作用的高敏感性显而易见或得到充分记载。在这些情况中，可能需要在任选的第四步104中使所述润滑剂或所述基于蛋白质的制剂适应，无需测定所述基于蛋白质的制剂的敏感性。
根据本发明的第二个方面，界面张力用于使基于蛋白质的制剂适应润滑容器的方法中。如上所述，用于克服基于蛋白质的制剂与润滑剂之间的不相容性的方法可以使所述基于蛋白质的制剂适应，以便防止在本发明第一个方面的方法中测定的不期望的相互作用。
使基于蛋白质的制剂适应润滑容器可以通过下列步骤实现：添加制剂组分，从而实现竞争性相互作用，即在动力学或热力学方面比所鉴定的相互作用组分与所述润滑剂之间的相互作用更有利。这种竞争性相互作用可以在另外的组分与所述润滑剂或另外的组分与所述基于蛋白质的制剂之间发生。
因此，第一种途经在于通过在所述缓冲剂的另外的组分与所述润滑剂之间生成更强的竞争性相互作用来防止所述基于蛋白质的制剂与所述润滑剂之间的相互作用。这种另外的组分可以是对于所述基于蛋白质的制剂而言新的组分或已经存在的组分，只要该组分的浓度可以在不影响所述基于蛋白质的制剂稳定性的情况下显著改变。
申请人已经在疫苗B实例中研究了所述第一种途经。实际上，本发明第一个方面的方法证实了疫苗B蛋白质与硅油之间的不相容性。然而，疫苗B包含聚山梨酯80作为非离子表面活性剂(参见材料和方法)，且这种组分能够与疫苗B蛋白质竞争与硅油的相互作用。
为了测定聚山梨酯80的适合浓度，已经评价了不同浓度的聚山梨酯80与硅油之间的界面张力随时间的减小并且与疫苗B产生的减小进行比较。
在图5中，3×10-6M和3×10-4M浓度的聚山梨酯80与硅油之间的界面张力随时间的减小和疫苗B与硅油之间的界面张力减小叠加。如果3×10-6M的聚山梨酯80浓度仅产生从41至36mN/m的有限减小，则3×10-4M的浓度产生界面张力的显著减小，达到14mN/m的最小值，明显低于使用疫苗B得到的最小值36mN/m。该结果表明疫苗B可以通过将聚山梨酯80的浓度设定在3×10-4M来适应与硅油稳定。这种适应的制剂随后称作疫苗B+PS80，用于接下来的研究，而相应的缓冲剂称作疫苗B缓冲剂+PS80。
疫苗B+PS80的稳定性使用微-流量成像(MFITM)和共振质量测量(RMM)进行评价。
图6A和6B显示通过MFITM测定的疫苗B和疫苗B+PS80产生的颗粒浓度以及疫苗B缓冲剂和疫苗缓冲剂B+PS80的颗粒浓度，它们均在使用硅油润滑的注射器中温育7天后。图6A呈现球形颗粒的浓度(归因于硅油)，而图6B呈现非球形颗粒的浓度(归因于蛋白质聚集物)。在本实验中，发现由适应的制剂产生的球形颗粒浓度(图6A)、即疫苗B+PS80接近由原始制剂(疫苗B)产生的浓度的一半，从13959至7533个颗粒/cc。在归因于蛋白质聚集物的非球形颗粒方面(参见图6B)，改进的制剂疫苗B+PS80仅产生1887个颗粒/cc的浓度，约为疫苗B产生的21826个颗粒/cc浓度的9％。
RMM结果如图7A和7B中所示，其中图7A显示正电颗粒的浓度(归因于硅酮颗粒)且图7B显示负电颗粒浓度(归因于蛋白质聚集物)。7天温育后，适应的制剂(疫苗B+PS80)产生高于疫苗B的正电颗粒浓度，高于2×106个颗粒/cc。然而，由疫苗B+PS80产生的负电颗粒浓度降至72667个颗粒/cc，约为由疫苗B产生的浓度的3.3％。
根据本发明第二个方面的方法，这些实验结果提供了对疫苗B与硅油润滑剂之间相互作用在添加聚山梨酯80后显著减少的支持。在蛋白质的相互作用中，聚山梨酯80成功地与疫苗蛋白质B竞争，即疫苗蛋白质B与硅油之间的相互作用被聚山梨酯80有效地阻止。所述方法由此允许使基于蛋白质的制剂适应指定润滑剂，并且在这种情况中，允许使得疫苗B在润滑容器、例如预装填注射器中安全储存。尽管聚山梨酯80已经用于使疫苗B适应，但是另外的非离子表面活性剂也可能是适合的，只要它们与所述制剂的蛋白质和另外的组分相容。
已经使用胰岛素研究了类似的途经，其为另一种常见的基于蛋白质的制剂。
关于图8，胰岛素制剂与硅油之间的界面张力随时间的减小显示了显著的相互作用。通过添加1×10-4M浓度的聚山梨酯80，胰岛素制剂成功地适应硅油，并且在图8中被称作“胰岛素+PS80”。胰岛素+PS80产生与硅油之间界面张力随时间的减小，降至17mN/m，这种减小高于使用原始胰岛素制剂观察到的减小(在100s时23mN/m)。然而，聚山梨酯80与适应的胰岛素制剂之间的界面张力曲线的叠加允许得出如下结论：仅聚山梨酯80与硅油发生相互作用，与胰岛素不期望的相互作用被有效地掩蔽。
申请人研究的第二种途经在于添加与不稳定的基于蛋白质的制剂的蛋白质发生相互作用的另外的组分。实际上，疫苗A蛋白质的净电荷是负的，且可以与铝阳离子形成络合物。因此，通过导入2g/dm3的氢氧化铝已经使疫苗A适应，所述适应的制剂称作“疫苗A+AH”。
图9示踪硅油分别与疫苗缓冲剂A、疫苗A和疫苗A+AH(适应的制剂)之间的界面张力随时间的减小。尽管如上所述在先证实的相互作用结果，疫苗A与硅油的界面张力从43降至36mN/m，但是疫苗A+AH产生的界面张力仅有限地降至42mN/m。这种减小类似于疫苗缓冲剂A在相同期限内产生的减小。因此，推定储存在使用硅油润滑容器中的疫苗A+AH将产生有限浓度的颗粒，类似于疫苗缓冲剂A得到的结果，并且显示在图2A、2C、3A、3C中。与第一种途经(其中聚山梨酯80成功地与疫苗蛋白质B竞争与硅油的相互作用)相反，在所述第二种途经中疫苗蛋白质A与硅油之间的相互作用通过形成疫苗蛋白质络合物而被阻止。这类疫苗蛋白质络合物不能再与硅油发生相互作用，且疫苗A+AH与疫苗缓冲剂A同样稳定。因此，该结果支持通过添加络合盐使得疫苗A有效适应。氢氧化铝已经用于如下实例，但可以选择另外的盐，例如磷酸铝。
根据本发明的第三个方面，界面张力用于选择适应于预期用于储存基于蛋白质的制剂的容器的润滑剂的方法。
关于图10，在第一步201中评价所述基于蛋白质的制剂与每种所研究的润滑剂之间的界面张力随时间的减小。如果润滑剂不产生显著减小，即鉴定不产生与所述基于蛋白质的制剂的任何相互作用(分支s)，则能够选择它并且进行制剂过程的下一个阶段P。
然而，如果全部润滑剂都与所述基于蛋白质的制剂发生相互作用(分支d)，则必须在第二步202中评价缓冲剂的每种组分与每种所研究的润滑剂之间的界面张力随时间的减小。该步骤允许在第三步203中测定所述基于蛋白质的制剂的哪种组分实际上与哪种润滑剂发生相互作用。在该步骤中，可以选择与所述基于蛋白质的制剂的蛋白质不发生相互作用的润滑剂用于进一步研究，而可以放弃与所述蛋白质发生相互作用的润滑剂。
使用这些数据，可以在第四步204中通过进行额外的实验确定所述基于蛋白质的制剂是否对所选择的润滑剂的相互作用敏感。这些实验可以牵涉颗粒计数法，例如MFITM或RMM(共振质量测量)、结构技术例如核磁共振或圆二色性和其它技术例如液相色谱法、尺寸排阻色谱法、pH-测量法、免疫测定法或体内实验，视与所述润滑剂发生相互作用的所述基于蛋白质的制剂的组分的不同而定。实际上，可以发现一些相互作用是可接受的，因为它们不会妨碍所述基于蛋白质的制剂的效能或稳定性。如果在第四步204中发现产生与所述基于蛋白质的制剂的不敏感性相互作用的润滑剂(分支NS)，则可以选择它，然后进行所述基于蛋白质的制剂的接下来的研发步骤P。然而，如果全部润滑剂都产生与所述基于蛋白质的制剂的敏感性相互作用(分支S)，则在第五步205中可能需要如本发明第二个方面中所述使所述基于蛋白质的制剂适应，或使用另外的润滑剂继续进行目前的研究。
材料和方法
溶液
使用两种不同的多-缀合的脑膜炎疫苗即疫苗A和疫苗B研究本发明的方法，所述两种不同的多-缀合的脑膜炎疫苗均仅包含一种血清型。这些疫苗市售购得。疫苗A缓冲剂包含7mg/ml NaCl、0.184mg/ml NaH2PO4.H2O、0.96mg/ml Na2HPO4.7H2O和14.6mg/ml甘露糖醇。疫苗B缓冲剂包含9mg/ml NaCl；1.335mg/mlNa2HPO4.2H2O；0.345mg/ml NaH2PO4.H2O；0.68mg/ml KH2PO4和25mg/ml蔗糖。全部化学化合物均购自Sigma-Aldrich。氢氧化铝(AH)溶液以2mg/ml浓度由在商购疫苗A试剂盒提供，且由此符合USP和EP级。
聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、称作聚山梨酯80或PS80作为分子生物学等级购自Sigma-Aldrich，其商品名为80。分别制备具有3×10-4M、3×10-5M和3×10-6M的终浓度的PS80溶液。制备具有PS 80 3×10-4M终浓度的疫苗B+PS80。
硅油是医用级聚-(二甲基硅氧烷)(PDMS)，其购自Dow Corning，名称为DC 360。在预研究中研究20cSt和1000cSt，且分别使用空气(air)或磷酸盐缓冲溶液得到相同的界面张力曲线。因此，将得到较大降低曲率的粘性较低的20cSt PDMS用于界面张力测定(参见材料和界面张力测定方法)。
界面张力测定
使用剖面分析张力计(Profile Analysis Tensiometer)(PAT-1M张力计,SINTERFACE Technologies,Berlin,Germany)，基于垂滴技术(pendant drop technique)测定界面张力随时间的减小。PAT-1M张力计使用受控配量系统生成空气或液体中的液滴，液滴形成被高分辨力视频摄像机捕获。Sinterface PAT-1M张力计软件允许进行图像采集、边缘检测并且利用Young-Laplace方程确定界面张力。将进入20-ml玻璃池的测定温度控制在25℃±2℃。用带有浸入的具有1.0mm外径的聚-(四氟乙烯)(PTFE)毛细管盖封闭池。研究溶液的液滴在毛细管浸入端形成。在本方法中，形成的疫苗、疫苗缓冲剂或修饰的制剂的液滴进入PDMS(20cSt)环境。在整个实验过程中通过自动调节将液滴的表面积控制为恒定。在本实验过程中添加到液滴中的体积也得到连续监测。对于每次实验调整液滴面积以便监测液滴曲率，与Young-Laplace方程一致。作为结果，70mm2液滴面积用于不具有PS80或具有低于CMC(1×10-5M)的PS80的溶液，而40mm2用于其它溶液。
稳定性研究
研究疫苗A和疫苗B制剂在润滑容器中的稳定性，以便证实与界面张力测量值的相关性。容器为用0.4mg硅酮润滑的具有潜水喷嘴(diving nozzle)的玻璃注射器(HypakTM,29G1/2,RNS BD260Black,超低钨(Ultra low tungsten),BD-Pharmaceutical Systems,LePont-de-Clai×,France)。全部注射器都被Hypak SCF 1mL不润滑的涂敷塞子塞住。
给注射器装填适合的溶液(疫苗或缓冲剂)并且以垂直位储存在25℃±2℃温度和60％RH±5％湿度下。通过谨慎地取下填充塞打开注射器并且将该溶液从边缘转入澄清的玻璃器皿。使用MicroFluid ImagingTM(MFITM)进行并且通过阿基米德共振质量测量(Archimedes Resonance Mass Measurement)(RMM)仪器在装填后即刻和7-天储存后进行颗粒计数。
稳定性研究过程中使用的颗粒计数方法
为了评估在稳定性研究过程中生成的颗粒的浓度和尺寸，使用BrightwellTechnologies的MFI TM-DPA5200A系列和通过阿基米德系统(Archimedes system)的共振质量测量(RMM)(Affinity Biosensors,Santa Barbara,California)。
给MFITM-5200仪器安装100μm流动池，以高放大倍数操作。MFITM View软件MVSS2.R3版和MVAS 1版(Protein-Simple)用于数据分析。初始使用10μm聚苯乙烯NIST可追踪的粒径标准品(Duke Scientific Corp.Fremont,CA)校准仪器。在每份样品运行前，使不含颗粒的流体流过所述系统，以提供纯净的基线并且优化照明。然后使用蠕动泵将样品轻轻地插入流动池。使用0.5ml运行体积进行3次独立的运行。基于MFITM系统的MVAS软件，建立定制过滤器(custom filters)。与Sharma等人,PharmTech 2009(33),p.74-9一致，硅油液滴与聚集的相同尺寸的蛋白质颗粒相比具有始终如一的较高长宽比，这支持利用具有长宽比(AR)>0.85截止值的单一软件过滤器。这种过滤器使球形群体与非球形群体分离，并且俘获约95-98％的具有可见小纤维形态的颗粒。
给阿基米德系统安装有Hi-Q微型传感器(Micro Sensor)(AffinityBiosensors)，并且由ParticleLab软件1.8版控制。用纯水将该传感器冲洗60s，然后分析。随后，通过至少5次“打喷嚏”操作除去系统中可能的杂质(将传感器中的液体推入两个方向)，并且用纯水再将所述系统冲洗60s。然后如D.Weinbuch等人Journal ofPharmaceutical Sciences 2013(102),p.2152-65所述加载样品溶液45s。将分析设置10min期限。加载新鲜的样品溶液用于一式三份测定。通过RMM进行的尺寸测定和分选颗粒基于频移并且解释在P.Dextras等人,Analytical Chemistry 2009(81),p.4517-23中。

Claims (7)

1.用于评价基于蛋白质的制剂相对于润滑容器的润滑剂的稳定性的方法，所述基于蛋白质的制剂包含蛋白质、肽和/或蛋白质衍生物以及缓冲剂，其中预期所述制剂要被储存在所述容器中，所述方法包括：
a)评价所述缓冲剂与所述润滑剂之间界面张力随时间的减小；
b)评价所述基于蛋白质的制剂与所述润滑剂之间的界面张力随时间的减小；
c)通过比较步骤b)中评价的减小与步骤a)中评价的减小来鉴定与所述润滑剂发生相互作用的所述基于蛋白质的制剂的至少一种组分。
2.根据权利要求1的方法，还包括评价步骤a)中所述缓冲剂的每种组分与所述润滑剂之间的界面张力的减小。
3.用于改善基于蛋白质的制剂相对于润滑容器的润滑剂的稳定性的方法，其中所述制剂要被储存在所述容器中，所述方法包括：
a)通过根据权利要求1或2的方法评价基于蛋白质的制剂相对于所述润滑剂的稳定性；
b)选择辅助剂，所述辅助剂带来与所述润滑剂的界面张力随时间的减小高于所述基于蛋白质的制剂与所述润滑剂的界面张力随时间的减小；
c)通过将所述选择的辅助剂添加到所述制剂中使所述基于蛋白质的制剂适应。
4.权利要求3的方法，其中所述辅助剂是表面活性剂。
5.用于改善基于蛋白质的制剂相对于润滑容器的润滑剂的稳定性的方法，其中所述制剂要被储存在所述容器中，所述方法包括：
a)通过根据权利要求1或2的方法评价基于蛋白质的制剂的稳定性；
b)选择辅助剂，所述辅助剂能够络合所述基于蛋白质的制剂的蛋白质；
c)通过将所述辅助剂添加到所述基于蛋白质的制剂中使所述基于蛋白质的制剂适应，以便至少部分减少所述基于蛋白质的制剂与所述润滑剂之间的界面张力随时间的减小。
6.权利要求5的方法，其中所添加的辅助剂是盐。
7.用于选择润滑剂的方法，所述润滑剂适应于预期储存基于蛋白质的制剂的容器，所述方法包括：
a)提供至少一种所要研究的润滑剂；
b)通过根据权利要求2的方法评价所述基于蛋白质的制剂相对于所述至少一种润滑剂的稳定性；
c)测定所述基于蛋白质的制剂对步骤b)中鉴定的相互作用的敏感性；
d)选择润滑剂，所述润滑剂导致与所述基于蛋白质的制剂不敏感的相互作用或使所述基于蛋白质的制剂适应，其中通过根据权利要求3-6中任一项的方法进行。
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