CN107063810A - 利用环氧树脂保存海洋生物标本的新型方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物标本的制备方法领域,涉及水生生物标本,尤其涉及一种利用环氧树脂保存水生生物标本的新型方法。包括以下有效步骤:a、脱水;b、配置树脂;c、包埋;d、固化。本发明利用环氧树脂和固化剂的混合配置,使整个水生生物的标本制作简便快速且成本低廉,利用本方法生产的标本能够适应生物教具和标准样品的生物标本的研究需要。同时,根据本发明所提供方案制成的生物标本便于保存、运输、交换交流,很好的保存了生物的分类鉴定特征,并且不易老化,尤其适合小型和微型水生生物的保存。
Description
技术领域
本发明属于生物标本的制备方法领域,涉及海洋和淡水生物标本。
背景技术
目前,用来长期保存微型和小型水生生物是用福尔马林溶液浸泡保存和利用天然树脂封片保存。上述两种方法虽然都能得到水生生物的标本,但其仍存在以下问题:首先,用福尔马林溶液保存的小型水生生物有强烈的气味,不适用于作为学生的教具。同时,浸泡的标本需要倾倒出来进行观察,对于微小样品来说操作过程麻烦,标本容易丢失,给教学和科研工作带来不便。而如果运用经典的树脂封片法,由于水生生物含水量高,直接用树脂浸泡保存则树脂难以渗透进细胞内部,因此经常需要甘油等粘稠液体将样品悬浮于其中再进行天然树脂封片,或者是先将样品脱水后再利用天然树脂封片。在使用天然树脂封片保存时,标本制作步骤麻烦,树脂固化时间极长,而且封片用的天然树脂易于变黄老化从而使标本受到破坏。
因此,在生物科普教学方面,对于小型水生生物的科普教学常常缺位,或者开展困难。在高等教育水产及水生生物类课程教学中,作为教具的标本每次实验后均有一定的损耗。在科研中,由于福尔马林浸泡的标本无论是携带还是运输都存在困难,从事分类和鉴定工作的人们很难进行有效交流。
为了解决上述技术问题,人们提出了各种各样的改进方案,例如国家知识产权局就公开了一种生物标本的塑化方法{申请号:201010612850.9}包括如下步骤:a、生物标本固定:用的福尔马林对生物标本进行完全固定;b、脱水、脱脂:固定好的生物标本经过制作后,丙酮置换直至标本的含水量<1%为止;c、真空浸渍:将置换完全的生物标本浸渍于生物真空浸渍塑化剂中,在真空负压冰柜中完成置换;d、烤箱烘烤:将置换完全生物标本放入烤箱中进行高温烘烤,将生物标本体内多余的生物真空浸渍塑化剂去除干净;e、硬化:将经过烤箱烘烤后的生物标本放入密闭的容器中硬化。
或是生物标本塑化法{申请号:00105847.9}法利用树脂混合液将标本中的体液置换出来进行塑化,以提供一种生物标本塑化方法,其制作步骤包括有:脱水、完全浸泡于树脂混合液中、静置沥干、涂布催化剂、静置反应及干燥固化等步骤。经由塑化完成的生物标本,不但其外观或标本组织细胞能保有完整状态,且具有柔软度及真实感,可供教学研究及标本的长期保存用。
亦或是透明水溶性树脂小型生物标本制备法{申请号:200610054494.7}该方法使用原料为聚乙二醇、透明脲醛树脂(液体)和冰醋酸。透明脲醛树脂液与聚乙二醇重量比为1∶0.4~2.3,经聚合反应形成透明水溶性树脂。冰醋酸(含量≥99.5)的加入量是聚乙二醇与透明脲醛树脂进行聚合反应形成的透明总量的5~15%,主要起凝固剂的作用,用上述工艺制备的树脂制作生物标本,主要步骤分为三步:A.底胶的制备、B.包埋生物标本、C.面胶的制备,该方法是一种简单易行的方法,其优点在于:该方法原料易得,成本低;制备的透明水溶性树脂流动性强,透明度好,便于生物标本的包埋;该方法制备的标本具韧性,不易开裂,能防虫,防霉,并能保持标本原来的色彩,是一种成功率较高的小型生物标本的制作方法。
上述方法中,虽然在一定程度上解决了传统标本制备方法中存在的技术问题,但是其途径往往集中在改造树脂,使之具备亲水能力,从而保证可以迅速渗透到生物体内,或者仍然使用疏水树脂,但需要复杂的前处理。此类途径不仅操作复杂,且成本较高,使用寿命较低,且有的方法由于存在特殊操作步骤不适合使用在水生生物上,因此迫切的需要一种方便简单、保存效果好的新方法来制备标本。
发明内容
本发明针对上述的在制备水生生物标本存在的操作复杂、缺乏广泛适用性等技术问题,提出一种方法科学、操作方便、保存时间长且保存效果好、便于运输的利用环氧树脂保存生物标本的新型方法。
为了达到上述目的,本发明采用的技术方案为,本发明提供一种利用环氧树脂保存水生生物标本的新型方法,包括以下有效步骤:
a、脱水:将已经用固定液处理过的水生生物放入无水乙醇或者丙酮中,进行脱水,待脱水完成后,将生物放置到容器中;
b、配置树脂:将环氧树脂和固化剂按照3∶1的比例配置均匀,得到环氧树脂混合浆;
c、包埋:将混合好的环氧树脂混合浆倒入容器中,对生物进行整姿,包埋;
d、固化:待包埋完成后采用自然固化法或烘干法对标本进行固化,待固化完成后即可得到生物标本。
作为优选,所述b步骤中,所述环氧树脂为南亚128环氧树脂(E-51),所述固化剂为D230。
作为优选,所述d步骤中,所述烘干法的控制温度在60℃~100℃。
作为优选,还包括a1、染色:将完成a步骤的水生生物浸入到考马斯亮蓝或者伊红染色液进行染色,待染色完成后,将生物放入无水乙醇中,漂洗5分钟至上面没有粘附的燃料颗粒以及浮色,然后取出,进行b步骤即可。
作为优选,所述a1步骤中考马斯亮蓝染色液的配置方法为:称取100mg考马斯亮蓝溶于50mL 90%乙醇中,加入85%的磷酸100mL,最后用蒸馏水定容到1000mL,然后将此溶液在常温下可静置一个月,即可得到考马斯亮蓝染色液。
作为优选,所述考马斯亮蓝的型号为G-250。
作为优选,所述a1步骤中伊红染色液的配置方法为:将醇溶性伊红0.1g加入100mL95%乙醇中,加温至40℃左右,搅拌至全部溶解。降温至室温,即制成伊红染色液。
与现有技术相比,本发明的优点和积极效果在于,
1、本发明利用环氧树脂和固化剂的混合配置,使整个水生生物的标本制作简便快速且成本低廉,使本方法生产的标本能够适应生物教具和标准样品的生物标本的研究需要,同时,本发明所提供制成的生物标本便于保存、运输、交换交流且本方法生产出的标本很好地保存了生物的分类鉴定特征,性质稳定,并且不易老化,尤其适合小型和微型水生生物的保存。
2、本方法生产出的标本形态特征清晰,无毒无味,坚硬透明,携带方便,可以作为工艺品和科普教具使用,也可供专业人士作为模式标本或者标准来使用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为考马斯亮蓝染色后的效果图;
图2为考马斯亮蓝染色后的局部效果图;
图3为伊红染色后的局部效果图;
图4为伊红染色后的局部效果图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点,下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是,在不冲突的情况下,本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明,但是,本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施,因此,本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
本方法适合保存的生物主要是海洋和淡水生小型和微型生物。尤其适合保存海洋和淡水浮游和底栖甲壳动物、硅甲藻、有孔虫(体积细微易丢失)等(更多的适合生物需要进行试验来确定),本发明主要解决的问题是现有海洋和淡水生小型和微型生物的标本在制作过程中存在的技术问题,最终导致在我国目前的生物科普教学中,长期大量使用陆生生物,水生生物由于没有好的教具制作方法长期在教学中缺位问题。
实施例1,本实施例提供一种不需要染色的生物标本的制作方法
首先将需要制成标本、已经固定后的生物直接放入无水乙醇或者丙酮中,进行脱水。对于小型和微型的水生生物来说,脱水时间很短。大概在几十分钟到几天不等。之后,将标本取出,放入到容器中。在此过程中,如果标本身体非常柔软,脱水步骤中可能萎缩,为了防止在脱水过程中发生变形,可以采取梯度脱水的办法,或者缩短脱水时间。
然后,按照重量比例3∶1混合环氧树脂和固化剂,在本实施例中,环氧树脂采用南亚128环氧树脂(E-51),黏度为12000-15000,环氧当量184-190,为液态双酚A型树脂。黏度较高,应用历史悠久,成品无毒无气味,而固化剂则选用D230,其具有透明度好、抗黄变、柔韧性好、色泽光亮、无毒无刺激等优点,在此过程中,如果树脂量比较大,将产生大量气泡。必要时可以用抽滤器抽滤以迅速消除气泡。如树脂量很少,则该步骤无需抽滤,静止等待气泡消失即可。
在本实施例中,选用E-51做环氧树脂主要是利用其粘稠性,方便好对后期的生物标本进行整姿,另外,也是最重要的一点,是用E-51和D230配置好的环氧树脂混合浆在包埋过程中,一些由于甲醛保存过程而体色变得暗淡浑浊的生物体在D230作用下,5min之内,即变得透明,接近活着时候的体色,且内部结构清晰可见,外部形态、肌肉、消化道等都得到了完整的保存。这一点对于生物标本显微镜观察非常重要。大型底栖和浮游甲壳动物则不会变色,保持福尔马林固定样品后的颜色,这点对于标本的制作具有重大的意义,节省了传统标本制作中透明化试剂使用步骤,且使标本中的生物接近活体的外观,这也是本发明的重点之处。
将混合好的环氧树脂混合浆倾倒入容器中,对标本进行整姿。因为环氧树脂有一定粘稠度,因此对于小型和微型水生生物来说,整姿很方便,如果需要对标本进行解剖,也在该步骤进行。解剖完之后,注意将解剖后得到的肢体展平,或者摆成适合观察的姿势。也可以将标本先解剖再缓缓倾入混合后的树脂。树脂的厚度需要尽量薄,刚浸没标本即可,便于观察成型后的标本。然后,即可对标本进行固化操作,固化可以采用自然固化法,也可以用烘箱进行。较高的温度(60到100度)有利于标本的充分固化。该步骤视条件而定。固化后的标本,其形态近似于市售水晶工艺品和传统的树胶封片标准标本,保存方便,便于携带、观察和交流。
实施例2,本实施例提供一种以考马斯亮蓝染色液染色的海洋生物标本的制作方法
首先将需要制成标本的生物直接放入无水乙醇进行脱水。对于小型和微型的水生生物来说,脱水时间很短。大概在几十分钟到几天不等。之后,将标本取出,放入到容器中。在此过程中,如果标本身体非常柔软易萎缩,为了防止在脱水过程中发生变形,可以采取梯度脱水的办法,或者缩短脱水时间。
称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 90%乙醇中,加入85%的磷酸100mL,最后用蒸馏水定容到1000mL,然后将此溶液在常温下可静置一个月,即可得到考马斯亮蓝染色液。
然后将上述脱水后的生物浸入到考马斯亮蓝进行染色,待染色完成后,将海洋生物放入无水乙醇中,漂洗5分钟至上面没有粘附的燃料颗粒以及浮色,然后取出。
接着,按照重量比例在3∶1混合环氧树脂和固化剂,在本实施例中,环氧树脂采用南亚128环氧树脂(E-51),黏度为12000-15000,环氧当量184-190,为液态双酚A型树脂。黏度较高,应用历史悠久,成品无毒无气味,而固化剂则选用D230,其具有透明度好、抗黄变、柔韧性好、色泽光亮、无毒无刺激等优点,在此过程中,如果树脂量比较大,将产生大量气泡。必要时可以用抽滤器抽滤以迅速消除气泡。如树脂量很少,则该步骤无需抽滤,静止等待气泡消失即可。
在本实施例中,选用E-51做环氧树脂主要是利用其粘稠性,方便好对后期的生物标本进行整姿,另外,也是最重要的一点,是用E-51和D230配置好的环氧树脂混合浆在包埋过程中,一些由于甲醛保存过程而体色变得暗淡浑浊的生物体在D230作用下,5min之内,即变得透明,接近活着时候的体色,且内部结构清晰可见,外部形态、肌肉、消化道等都得到了完整的保存。这一点对于生物标本显微镜观察非常重要。大型底栖和浮游甲壳动物则不会变色,保持福尔马林固定样品后的颜色,这点对于标本的制作具有重大的意义,节省了传统标本制作中透明化试剂使用步骤,且使标本中的生物接近活体的外观,这也是本发明的重点之处。
将混合好的环氧树脂混合浆倾倒入容器中,对标本进行整姿。因为环氧树脂有一定粘稠度,因此对于小型和微型水生生物来说,整姿很方便,如果需要对标本进行解剖,也在该步骤进行。解剖完之后,注意将解剖后得到的肢体展平,或者摆成适合观察的姿势。也可以将标本先解剖再缓缓倾入混合后的树脂。树脂的厚度需要尽量薄,刚浸没标本即可,便于观察成型后的标本。然后,即可对标本进行固化操作,固化可以采用自然固化法,也可以用烘箱进行。较高的温度(60到100度)有利于标本的充分固化。该步骤视条件而定。固化后的标本,如图1、图2所示其形态近似于市售水晶工艺品和传统的树胶封片标准标本,保存方便,便于携带、观察和交流。染色剂的作用是将透明的标本染色,便于在玻片上查找到标本的位置,同时染色剂可以使肌肉组织和外表进一步清晰化,便于观察。
实施例3,本实施例提供一种以伊红染色液染色的海洋生物标本的制作方法
首先将需要制成标本的水生生物直接放入无水乙醇进行脱水。对于小型和微型的水生生物来说,脱水时间很短。大概在几十分钟到几天不等。之后,将标本取出,放入到容器中。在此过程中,如果标本身体非常柔软,脱水步骤中容易萎缩,为了防止在脱水过程中发生变形,可以采取梯度脱水的办法,或者缩短脱水时间。
然后,将醇溶性伊红0.1g加入100mL95%乙醇中,加温至40℃左右,搅拌至全部溶解。降温至室温,即制成伊红染色液。
然后将上述脱水处理后的生物浸入到伊红染色液进行染色,待染色完成后,将生物放入无水乙醇中,漂洗5分钟至上面没有粘附的燃料颗粒以及浮色,然后取出。
接着,按照重量比例在3∶1混合环氧树脂和固化剂,在本实施例中,环氧树脂采用南亚128环氧树脂(E-51),黏度为12000-15000,环氧当量184-190,为液态双酚A型树脂。黏度较高,应用历史悠久,成品无毒无气味,而固化剂则选用D230,其具有透明度好、抗黄变、柔韧性好、色泽光亮、无毒无刺激等优点,在此过程中,如果树脂量比较大,将产生大量气泡。必要时可以用抽滤器抽滤以迅速消除气泡。如树脂量很少,则该步骤无需抽滤,静止等待气泡消失即可。
在本实施例中,选用E-51做环氧树脂主要是利用其粘稠性,方便好对后期的生物标本进行整姿,另外,也是最重要的一点,是用E-51和D230配置好的环氧树脂混合浆在包埋过程中,一些由于甲醛保存过程而体色变得暗淡浑浊的生物体在D230作用下,5min之内,即变得透明,接近活着时候的体色,且内部结构清晰可见,外部形态、肌肉、消化道等都得到了完整的保存。这一点对于生物标本显微镜观察非常重要。大型底栖和浮游甲壳动物则不会变色,保持福尔马林固定样品后的颜色,这点对于标本的制作具有重大的意义,节省了传统标本制作中透明化试剂使用步骤,且使标本中的生物接近活体的外观,这也是本发明的重点之处。
将混合好的环氧树脂混合浆倾倒入容器中,对标本进行整姿。因为环氧树脂有一定粘稠度,因此对于小型和微型水生生物来说,整姿很方便,如果需要对标本进行解剖,也在该步骤进行。解剖完之后,注意将解剖后得到的肢体展平,或者摆成适合观察的姿势。也可以将标本先解剖再倾入混合后的树脂。树脂的厚度需要尽量薄,刚浸没标本即可,便于观察成型后的标本。然后,即可对海洋生物进行固化操作,固化可以采用自然固化法,也可以用烘箱进行。较高的温度(60到100度)有利于标本的充分固化。该步骤视条件而定。固化后的标本,如图3、图4所示其形态近似于市售水晶工艺品和传统的树胶封片标准标本,保存方便,便于携带、观察和交流。染色剂的作用是将透明的标本染色,便于在玻片上查找到标本的位置,同时染色剂可以使肌肉组织和外表进一步清晰化,便于观察。
另外,本发明所提供的环氧树脂和固定剂配置液也可以针对水生植物进行标本制作,其制作方法在环氧树脂混合浆的配置、包埋以及固化过程均一致,其的区别主要集中在标本的前处理过程中。
对于浮游植物,为了观察其壳面的精巧花纹,可以以双氧水溶解掉有机质再进行制片,也可以直接进行制片。下面先提供直接制片的方法,其步骤如下:
首先,以浮游植物网具捞取浮游植物,镜检检查其密度和种类组成,加入中性甲醛固定。甲醛固定后进行沉降,以保鲜膜蒙住量筒口,静止24小时至48小时后,将上清液吸出,余下底部液体混合均匀即为浓缩后的硅藻。将硅藻连同培养液一起倾倒进烧杯中,按照1∶10的比例添加无水乙醇,然后再度静止沉降。吸出上清液,倒出硅藻,重新加入无水乙醇。然后重复地将硅藻连同培养液一起倾倒进烧杯中,按照1∶10的比例添加无水乙醇,然后再度静止沉降。吸出上清液,倒出硅藻,重新加入无水乙醇。直至藻体中基本不含水分。
接着,倒入乙醇轻轻搅动至沉淀全部浮起,静置十几秒,取悬浮液,弃去下层沉淀的沙粒等杂质。将硅藻液浓缩后吸出,滴到玻片上,待乙醇挥发到几乎整个玻片干燥,然后将混合后的胶液倒上去。待其自流平整,充分固化后即可。可以在固化前压盖玻片也可以选择不压盖玻片。
消化硅藻中的有机质后再行制片的步骤如下:
将浓缩后的硅藻液加入30%双氧水适量(不小于藻液体积的5倍),在70℃下水浴加热进行反应。加热至有机物被完全溶解,停止加热降温至室温。倾倒出样品,静置浓缩。也可以进行离心浓缩,但在取出硅藻样品时需非常注意,避免因扰动或者离心速度过高而损坏硅藻群体的形态。添加无水乙醇,静置沉淀浓缩,再度加入乙醇,重复步骤直至藻体内的水分全部被乙醇置换掉。倒入乙醇,搅动,取悬浮液弃去沉淀沙粒。将得到的悬浮液浓缩后,滴在玻片上,待乙醇大部分挥发玻片稍润湿的时候,滴上环氧树脂混合浆封片,待固化后即可。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非是对本发明作其它形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域,但是凡是未脱离本发明技术方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型,仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (7)
1.一种利用环氧树脂保存海洋生物标本的新型方法,其特征在于,包括以下有效步骤:
a、脱水:将处理好的水生生物放入无水乙醇或者丙酮中,进行脱水,待脱水完成后,将海洋生物放置到容器中;
b、配置树脂:将环氧树脂和固化剂按照3∶1的比例配置均匀,得到环氧树脂混合浆;
c、包埋:将混合好的环氧树脂混合浆倒入容器中,对生物进行整姿,包埋;
d、固化:待包埋完成后采用自然固化法或烘干法对生物进行固化,待固化完成后即可得到生物标本。
2.根据权利要求1所述的利用环氧树脂保存水生生物标本的新型方法,其特征在于,所述b步骤中,所述环氧树脂为南亚128环氧树脂(E-51),所述固化剂为D230。
3.根据权利要求1所述的利用环氧树脂保存水生生物标本的新型方法,其特征在于,所述d步骤中,所述烘干法的控制温度在60℃~100℃。
4.根据权利要求2所述的利用环氧树脂保存水生生物标本的新型方法,其特征在于,还包括a1、染色:可以将完成a步骤的生物浸入到考马斯亮蓝或者伊红染色液进行染色,待染色完成后,将生物放入无水乙醇中,漂洗5分钟至上面没有粘附的燃料颗粒以及浮色,然后取出,进行b步骤即可。
5.根据权利要求4所述的利用环氧树脂保存水生生物标本的新型方法,其特征在于,所述a1步骤中考马斯亮蓝染色液的配置方法为:称取100mg考马斯亮蓝溶于50mL 90%乙醇中,加入85%的磷酸100mL,最后用蒸馏水定容到1 000mL,即可得到考马斯亮蓝染色液,此溶液在常温下可静置一个月保存。
6.根据权利要求5所述的利用环氧树脂保存水生生物标本的新型方法,其特征在于,所述考马斯亮蓝的型号为G-250。
7.根据权利要求4所述的利用环氧树脂保存水生生物标本的新型方法,其特征在于,所述a1步骤中伊红染色液的配置方法为:将醇溶性伊红0.1g加入100mL95%乙醇中,加温至40℃左右,搅拌至全部溶解。降温至室温,即制成伊红染色液。
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